不同体外诱导培养条件下新生鼠基底前脑神经干细胞增殖和分化为神经元的能力

目的:研究神经干细胞的增殖、迁移和分化可为揭示神经系统的发生、发育过程提供可靠依据.观察表皮生长因子和碱性成纤维生长因子在体外刺激新生鼠基底前脑神经干细胞的增殖情况,及其各自诱导神经干细胞分化成神经元的能力.方法:实验于2005-12/2006-07在广州医学院解剖学教研室完成.①动物:清洁级新生24 h内的SD大鼠30只,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:新生鼠在无菌条件下取脑,分离出基底前脑,胰蛋白酶消化,离心过滤制备单细胞悬液,接种于含B27的DMEM/F12培养基培养瓶中,每瓶40～60万个细胞,加入终浓度均为10μg/L的表皮生长因子和碱性成纤维生长因子刺激生长,在体外进行神经干细胞的克隆培养,传代培养过程中加入终浓度为6 mg/L BrdU用于标记神经球,设立3组,各自加入体积分数为0.1的小牛血清、终浓度均为10μg/L的表皮生长因子、碱性成纤维生长因子,对培养得到的神经干细胞进行诱导分化.③实验评估:免疫荧光染色检测神经干细胞巢蛋白抗原的表达,并用BrdU标记和免疫荧光证实其增殖能力.免疫荧光染色检测不同诱导条件下神经干细胞向神经元分化的能力. 结果:①细胞形态观察:从新生鼠基底前脑成功分离出神经干细胞,原代培养呈透亮的圆球形,2～3 d后细胞数目明显减少,部分细胞开始分裂.1周左右培养瓶中出现许多由数十到数百个细胞组成的悬浮生长的细胞球,球中的细胞形态规则,边界清楚,折光性较强,胞浆颜色较深,核/浆比较大.该细胞具有连续增殖能力,可以传代培养.②巢蛋白抗原的表达:传代神经球中的细胞均呈巢蛋白抗原阳性.③BrdU标记检测:克隆球中的细胞均为BrdU阳性,表明克隆球是由不断分裂增殖的细胞组成.④诱导分化结果:在体积分数为0.1小牛血清、终浓度均为10μg/L的表皮生长因子、碱性成纤维生长因子诱导条件下,神经干细胞分化为神经元的比例分别为20%,22%,40%.结论:①表皮生长因子和碱性成纤维生长因子在体外能够刺激新生鼠基底前脑神经干细胞连续增殖,且具有胚胎源性.②以血清作为对照,碱性成纤维生长因子诱导神经干细胞向神经元分化的能力强于表皮生长因子.     

含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养建立大鼠胚胎神经干细胞克隆的实验

背景：体外培养获得神经干细胞的有效方法是干细胞实验研究中很值得关注的问题。 目的：观察应用含有不同生长因子的培养基体外培养神经干细胞的有效方法。 设计：单一样本观察。 单位：四川大学生命科学院细胞生物学实验室。 材料：孕14dSD大鼠10只。DMEM／F12 1：1，碱性成纤维细胞生长因子，表皮生长因子；巢蛋白抗体IgG，β-微管蛋白Ⅲ抗体IgG，胶质纤维酸性蛋白抗体IgG，生物素标记二抗和三抗、异硫氰酸荧光素标记二抗。 方法：实验于1999／2001在四川大学生命科学院细胞生物学实验室完成。①从胎鼠前脑取出脑组织，采用酶消化．机械吹打、离心、培养原代神经干细胞克隆。②神经干细胞以2&;#215;10^8 L^-1密度接种培养，分4组，每组6瓶细胞，DMEM／F12组：加入DMEM／F12（1：1）培养基含体积分数为0．1的小牛血清；碱性成纤维细胞生长因子组：培养基为含20μg／L碱性成纤维细胞生长因子；表皮生长因子组：培养基含30μg／L表皮生长因子；碱性成纤维细胞生长因子＋表皮生长因子组：先用含碱性成纤维细胞生长因子的培养基培养2h后再换成含表皮生长因子的培养基培养。培养24h后更换培养瓶，培养14d后显微镜下计数原代克隆数，免疫组化法检测干细胞特殊标记蛋白巢蛋白的表达。 主要观察指标：①神经干细胞的原代克隆。②单细胞克隆培养结果。③诱导分化结果。 结果：①从胎鼠脑中分离的细胞具有连续传代形成克隆的能力，免疫荧光化学显示细胞球内细胞巢蛋白表达阳性。②采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养的方法形成神经干细胞克隆率最高（0．630％）。③培养的神经干细胞克隆能诱导分化成神经元和神经胶质细胞。 结论：①结果证实培养分离的细胞是神经干细胞。②采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养的方法是获得神经干细胞的有效方法。     

大鼠胚胎脑源性神经干细胞的分离培养和鉴定

目的：分离培养大鼠胚胎脑源性神经千细胞，并进行增殖分化鉴定。 方法：实验于2005—06／12在中国科学技术大学生命科学学院周江宁研究室进行。①自孕14dWistar大鼠胚胎分离大脑皮质及皮质下组织，经机械吹打分离成单细胞后，利用无血清原代及传代培养方法，在添加重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人表皮生长因子和B27添加剂的DMEM／F12（1：1）培养基中进行悬浮培养，获得具有克隆能力的细胞群；用有限稀释法，得到来源于同一细胞的亚细胞系克隆。②从培养基中撤除生长因子和B27添加剂，换成含体积分数为0．1的胎牛血清的DMEM／F12培养基，将培养的细胞球接种于预先铺有多聚赖氨酸盖玻片的培养皿，诱导分化。③以免疫荧光细胞化学技术，用神经干细胞的特异性单克隆抗体（巢蛋白）和增殖细胞单克隆抗体（5一溴脱氧尿苷嘧啶）鉴定克隆细胞，以鉴定神经干细胞的自我更新增殖能力。④以免疫荧光细胞化学技术，用神经细胞的特异性抗体（神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、半乳糖脑苷脂）鉴定分化细胞，以鉴定神经干细胞的多向分化潜能。 结果：①从胎鼠大脑皮质及皮质下分离的组织，经原代和传代培养均可形成细胞克隆，并具有增殖的能力，表达神经上皮干细胞蛋白抗原和增殖细胞抗原。②在血清诱导下，分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞3种神经细胞的特异性抗原。 结论：运用上述方法分离培养的细胞具有自我更新和增殖能力，并具有多向分化潜能和具有神经干细胞的特异性抗原。     

含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养建立大鼠胚胎神经干细胞克隆的实验

背景体外培养获得神经干细胞的有效方法是干细胞实验研究中很值得关注的问题.目的观察应用含有不同生长因子的培养基体外培养神经干细胞的有效方法.设计单一样本观察.单位四川大学生命科学院细胞生物学实验室.材料孕14 d SD大鼠10只,DMEM/F12 11,碱性成纤维细胞生长因子,表皮生长因子;巢蛋白抗体IgG,β-微管蛋白Ⅲ抗体Ig G,胶质纤维酸性蛋白抗体Ig G,生物素标记二抗和三抗、异硫氰酸荧光素标记二抗.方法实验于1999/2001在四川大学生命科学院细胞生物学实验室完成.①从胎鼠前脑取出脑组织,采用酶消化、机械吹打、离心、培养原代神经干细胞克隆.②神经干细胞以2×108L-1密度接种培养,分4组,每组6瓶细胞,DMEM/F12组加入DMEM/F12(11)培养基含体积分数为0.1的小牛血清;碱性成纤维细胞生长因子组培养基为含20μg/L碱性成纤维细胞生长因子;表皮生长因子组培养基含30μg/L表皮生长因子;碱性成纤维细胞生长因子+表皮生长因子组先用含碱性成纤维细胞生长因子的培养基培养2 h后再换成含表皮生长因子的培养基培养.培养24 h后更换培养瓶,培养14 d后显微镜下计数原代克隆数,免疫组化法检测干细胞特殊标记蛋白巢蛋白的表达.主要观察指标①神经干细胞的原代克隆.②单细胞克隆培养结果.③诱导分化结果.结果①从胎鼠脑中分离的细胞具有连续传代形成克隆的能力,免疫荧光化学显示细胞球内细胞巢蛋白表达阳性.②采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养的方法形成神经干细胞克隆率最高(0.630%).③培养的神经干细胞克隆能诱导分化成神经元和神经胶质细胞.结论①结果证实培养分离的细胞是神经干细胞.②采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养的方法是获得神经干细胞的有效方法.     

神经干细胞在创伤性脑损伤灶周边的成活和迁移

背景:成年人中枢神经系统再生困难,颅脑损伤后,损伤灶周边区域神经细胞的存活数量直接影响患者的预后.如何有效地使移植入创伤性脑损伤灶周边的神经干细胞存活分化,是目前神经修复再生研究的重点.目的:探讨神经干细胞移植入大鼠创伤性脑损伤灶周边的成活、迁移和分化情况.方法:利用无血清培养技术,加入表皮生长因子、碱性成纤维生长因子诱导刺激大鼠胚胎源性前脑神经干细胞生长增殖,并存体外进行克隆培养,移植前行BrdU标记,采用免疫组化和免疫荧光法检测其增殖特性和多向分化潜能,并观察其移植到Fenney's落体脑损伤模型鼠脑皮质内的成活和辽移情况.结果与结论:免疫组化及免疫荧光检测结果显示克隆细胞球呈nestin和BrdU阳性,分化后呈NSE,GFAP,MAP-2阳性.免疫组化及荧光双标检测结果显示移植后7,14 d损伤灶周边散在BrdU阳性细胞.并且GFAP阳性细胞增多.提示前脑神经干细胞在体外培养中能够增殖,并分化为神经元和神经胶质细胞,移植后能够在创伤性脑损伤灶周边存活和迁移,形态上显示出与脑组织整合的特点.     

新生小鼠海马源性神经干细胞体外分离培养细胞群的增殖分化

目的：从新生小鼠脑海马部取材进行大量细胞克隆，对体外分离培养的神经干细胞进行鉴定．检测所分离细胞群的增殖分化特性。 方法：实验于2005-07／10在解放军第三军医大学解剖学教研室实验完成。选用清洁级昆明种新生24h内小鼠12只，利用神经于细胞条件培养基和单细胞克隆技术，从小鼠脑海马分离并体外培养神经干细胞。连续传代20代后，以免疫荧光细胞化学方法及免疫组织化学方法检测克隆细胞Nestin、BrdU、NeuN、NF-200、MOSP及胶质原纤维酸性蛋白的表达。 结果：实验选用昆明种新生24h内小鼠12只，全部进入结果分析。①神经干细胞的培养及分化：神经干细胞以神经球的方式悬浮生长。无明显突起，原代细胞接种后于第3天开始形成神经球。组成细胞球的细胞圆润饱满，活力状态好，绝大多数在1d内贴壁，并从细胞球边缘伸出突起，加入含血清的培养基后克隆球48h内即可见到明显的细胞分化，克隆球周围有细胞移出，7d后原有的细胞球消失。②神经干细胞的鉴定结果：原代克隆及其亚克隆行Nestin免疫荧光染色。证实克隆内细胞均为Nestin抗原阳性；细胞经BrdU标记后，行BrdU免疫细胞化学染色，部分细胞呈阳性。③神经干细胞的分化鉴定：对诱导分化的细胞分别行NeuN、NF-200、MOSP及胶质原纤维酸性蛋白免疫细胞化学检测，表达均呈阳性。 结论：成功分离并获得新生小鼠脑海马神经于细胞，该细胞可连续传代，具备多向分化潜能。     

体外诱导人脐带间充质干细胞向神经干细胞的分化

背景：人脐带间充质干细胞较骨髓、脂肪等来源的间充质干细胞易取材、更为原始,并不受伦理、法律的限制,是中枢神经系统损伤修复最具治疗潜力的细胞来源之一。 目的：探讨重组人碱性成纤维生长因子、重组人表皮生长因子定向诱导人脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的潜能。 方法：采用碱性成纤维生长因子、表皮生长因子作为诱导剂,体外诱导人脐带间充质干细胞;在倒置显微镜下动态观察细胞形态学变化,并用免疫荧光法检测人脐带间充质干细胞向神经干细胞分化的情况,实时荧光定量PCR技术检测诱导前后神经干细胞标记蛋白巢蛋白在mRNA水平的相对表达量。 结果与结论：形态学观察经诱导后的人脐带间充质干细胞呈神经干细胞球改变;免疫荧光法及实时荧光定量PCR技术均可检测到神经干细胞标记物巢蛋白,并可进一步分化表达神经元标志蛋白神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2以及神经胶质细胞蛋白、神经胶质原纤维酸性蛋白。碱性成纤维生长因子、表皮生长因子可定向诱导人脐带间充质干细胞向神经干细胞及神经元、神经胶质细胞分化。     

体外分离与培养SD乳鼠神经干细胞实验过程中部分方法的改进

目的：探讨体外培养与分离SD乳鼠神经干细胞的方法，以便获得大量的神经干细胞，方法：实验于2003-06／10在四川大学华西医学中心细胞生物学教研室完成分别取出生3d的SD乳鼠侧脑室和大脑皮质，用改进后的胰蛋白酶消化法分离单个细胞，进行细胞培养，加20μg／L表皮生长因子，20μg／L碱性成纤维细胞生长因子刺激生长，用半定量法换培养液，用免疫细胞化学方法对神经干细胞进行鉴定，流式细胞仪分别对每天培养的神经干细胞凋亡率进行检测。结果：①所获得的克隆细胞具有抗巢蛋白免疫荧光反应阳性、具有增殖、血清诱导分化的特性，证明这些细胞为神经干细胞。②培养的侧脑室神经干细胞比大脑皮质的神经干细胞增殖快。③改进的胰蛋白酶消化法得到了1&;#215;10^8L^-1单细胞，避免了过度消化或过度机械吹打造成的细胞碎片。④含20μg／L表皮生长因子和20μg／L碱性成纤维细胞生长因子培养基适合神经干细胞短期培养。⑤流式细胞仪定量检测细胞凋亡率呈下降趋势。结论：SD乳鼠体外培养神经干细胞取材最佳位置应该是脑室管膜或室管膜下。神经干细胞的存活和分裂有赖于表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子按一定比例的共同作用。采用改进的胰酶消化法提高有效细胞产生率，应用半定量换液法可有效减少细胞凋亡率。     

表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对人胎脑室下区神经干细胞增殖分化的影响

背景：由于神经干细胞分化的多向性和不确定性给临床应用造成巨大困难，因此，探讨神经干细胞增殖分化条件已成为解决这一问题的关键。目的：观察表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对人胎脑神经干细胞增殖分化的影响。设计：以培养的人胚神经干细胞为观察对象，随机对照实验。单位：解放军第一军医大学珠江医院儿科。材料：实验于2004—01／05在全军儿科中心实验室进行。随机在广州市某三级甲等医院产科选取自愿水囊引产的16周胎儿2例（胎儿父母签署同意书），取其脑室下区组织分别在无血清培养基和血清培养基进行细胞培养。方法：采用含有表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子以及表皮生长因子＋碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养基对人胎脑室下区组织进行原代细胞培养；两种生长因子的浓度均为20μg／L，采用血清培养基对原代培养的细胞克隆球进行分化实验；并采用免疫组化技术对分化细胞进行检测。主要观察指标：各组克隆球数量及其分化为神经元和星形胶质细胞的变化。结果：①碱性成纤维细胞生长因子组、表皮生长因子＋碱性成纤维细胞生长因子组形成的原代克隆球数量无显著差异[（150．3&;#177;14．9），（173．6&;#177;26．4）个／孔，P〉0．05]，但均明显多于表皮生长因子组[（99.5&;#177;14．9）个／孔，P〈0．01]。②碱性成纤维细胞生长因子组以及表皮生长因子＋碱性成纤维细胞生长因子组克隆球分化为神经元的数量明显多于表皮生长因子组，而表皮生长因子组产生较多的星形胶质细胞。结论：①碱性成纤维细胞生长因子能促进人胎脑室下区神经干细胞增殖，所形成的细胞克隆球能分化出较多的神经元。②两种因子合用并没有获得明显的优于单用碱性成纤维细胞生长因子的结果，提示不存在协同作用。     

人脑神经干细胞对不同储存方式及分离培养和诱导分化条件的要求

背景：近年来发现神经干细胞可于体外增殖并分化为神经细胞，是用来修复替代损伤神经组织的较为理想的来源，但是神经干细胞的培养中如何提高它的增殖能力，诱导分化成需要的表现型，尚处于研究探讨阶段。目的：探讨细胞冻存和非冻存方法分离培养人脑神经干细胞及诱导其向成熟神经细胞分化的培养条件。设计：以细胞为观察对象，单一样本研究。单位：江西医学院泌尿外科研究所，江西医学院第二附属医院神经外科。材料：实验于2003-12／2004-06在江西医学院泌尿外科研究所完成。取16周龄新鲜人胚脑组织。方法：用胰蛋白酶消化法从人胚脑中分离单个细胞，细胞冻存1个月后复苏或／和新鲜细胞用无血清培养基进行体外培养，碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子刺激细胞生长，用血清诱导其分化；采用免疫荧光细胞化学染色方法检测培养的细胞神经巢蛋白抗原和分化后成熟神经细胞抗原神经元特异性烯醇化酶的表达。观察碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子及血清对分离培养的人脑神经干细胞增殖与分化的影响。主要观察指标：①冻存与新鲜细胞后续培养的生长状况。②细胞形态变化。③神经干细胞标志物神经巢蛋白及成熟神经细胞标志神经元特异性烯醇化酶的鉴定。结果：①从胚龄16周的新鲜人胚脑中成功分离出神经干细胞。人胚脑原代细胞为圆形亮球状，培养3d后可见细胞开始聚集成神经球，部分呈悬浮生长，2周后神经球增大，部分细胞增大数倍，具有极强折光性，可见分裂增殖。经传代后细胞仍保持原有特征，细胞形态不变。克隆细胞在有血清培养基中培养，24h后可见大部分细胞贴壁生长，细胞从神经球游出分散，形态不规则；48h后多数细胞分化为大量形态不一的、分散成片的多突起星状细胞和神经元样细胞，突起相互交织成网。②分离出的神经干细胞在体外培养条件下传代培养，并表达神经干细胞标志巢蛋白；含血清培养基培养48h分化后的细胞主要表达成熟神经细胞标志神经元特异性烯醇化酶。③冻存复苏的细胞95％，以上为活细胞，与新鲜细胞比较，细胞生长状况无明显差别。结论：用无血清培养条件下结合碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的作用，使干细胞体外得到了分离培养、增殖和纯化，证实其方法可行，同时冻存和新鲜细胞的比较，说明可用冻存方法保存人胚脑细胞，复苏后使用。     

碱性成纤维生长因子和神经生长因子联合应用培养成年大鼠海马神经干细胞向神经元样细胞的分化

背景：影响神经干细胞向神经元分化的因素很多,各种营养因子可以不同程度地刺激神经干细胞向神经元分化,如何使神经干细胞大量分化为神经元是研究的热点问题。目的：观察联合应用碱性成纤维生长因子和神经生长因子对成年大鼠海马神经干细胞为神经元的影响。方法：无菌条件下分离大鼠脑海马组织,传至第4代克隆球直径约为200μm时,滴加DMEM/F12＋2%B27＋20μg/L表皮生长因子＋20μg/L碱性成纤维细胞生长因子,进行单细胞克隆培养,传代的神经干细胞分成空白对照组、碱性成纤维细胞生长因子组、神经生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子＋神经生长因子组。观察传代后的克隆球进行神经干细胞免疫细胞化学染色鉴定,计数神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率,检测神经干细胞向神经元的分化情况。结果与结论：①单细胞克隆培养后,克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达。②与空白对照组神经干细胞分化为神经元的比例比较,碱性成纤维细胞生长因子组、神经生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子组＋神经生长因子组均明显提高（P〈0.05）,且碱性成纤维细胞生长因子组＋神经生长因子组神经元的比例最高（P〈0.05）。提示,碱性成纤维细胞生长因子可以提高神经生长因子诱和神经生长因子均可促进神经干细胞向神经元分化,且二者联合应用效果更佳。     

脑源性神经营养因子促进低血糖幼鼠海马神经干细胞的定向分化

背景：有研究表明脑源性神经营养因子可以维持神经元的存活、影响神经元的迁移,在体外可以促进神经干细胞的存活和分化。目的：探讨脑源性神经营养因子对低血糖幼鼠海马神经干细胞定向分化的作用。方法：取新生1d低血糖模型大鼠脑海马组织进行原代、传代及单细胞克隆培养。培养的细胞一部分进行神经干细胞鉴定,另一部分依据培养液中脑源性神经营养因子质量浓度的不同将单克隆细胞分为0,100,200μg/L组,取第4代细胞进行诱导分化,行神经元特异性烯醇化酶免疫荧光染色,计数阳性细胞比例。结果与结论：单克隆培养后3组细胞均呈巢蛋白阳性,诱导分化后细胞呈行神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白阳性;100,200μg/L组神经干细胞生长较快,且分化为神经元特异性烯醇化酶阳性细胞比例较高（P〈0.05）,但两组神经干细胞之间差异无显著性意义（P〉0.05）。提示脑源性神经营养因子促进低血糖幼鼠海马神经干细胞向神经元定向分化。     

异丙酚对体外培养大鼠神经干细胞增殖的影响

目的：研究静脉麻醉药异丙酚对大鼠神经干细胞的体外增殖的影响。方法：从孕14.5d的胎鼠前脑分离培养神经干细胞;采用逆转录-聚合酶联反应（RT-PCR）检测GABAA受体亚基的表达情况;用不同浓度（0~0.05mM）的异丙酚处理大鼠神经干细胞,BrdU标记及非放射性细胞增殖（MTS）法检测细胞增殖能力变化,原位末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡情况,蛋白印迹技术检测凋亡执行蛋白多聚ADP核糖聚合酶（PARP）的活化切割情况与细胞周期调控激酶Chk1与Chk2的磷酸化情况。结果：大鼠神经干细胞也表达部分GABAA受体亚基;异丙酚处理抑制大鼠神经干细胞增殖,但不影响细胞凋亡;异丙酚增强Chk1在317位丝氨酸的磷酸化,不影响345丝氨酸磷酸化,也不影响Chk2在68位苏氨酸的磷酸化。结论：异丙酚抑制体外培养的大鼠神经干细胞增殖,可能部分通过激活Chk1在317位丝氨酸磷酸化发挥作用。     

法舒地尔和RhoA沉默对神经干细胞增殖的影响

背景：Rho及其相关分子在神经轴突生长、分化、延伸及突触形成中起重要作用,阻断和抑制RhoA/ROCK通路可促进神经干细胞的增殖与生长。目的：观察Rho激酶抑制剂法舒地尔和RNAi介导的RhoA基因沉默对大鼠神经干细胞增殖的影响。方法：体外培养Wistar胎鼠神经干细胞,分6组干预：空白对照组,5,10,15,20μmol/L法舒地尔组,siRNA沉默RhoA基因组。干预后第3天,采用RT-PCR,Westernblot检测各组神经干细胞RhoA基因及蛋白的表达。应用MTT比色法观察神经干细胞增殖情况;采用流式细胞术测定神经干细胞周期分布的变化。结果与结论：15,20μmol/L法舒地尔组、siRNA沉默RhoA基因组神经干细胞RhoA基因及蛋白表达量较5,10μmol/L法舒地尔组、空白对照组明显降低（P〈0.05）,细胞的生长速度较5,10μmol/L法舒地尔组、空白对照组明显增快（P〈0.05）,细胞周期G0/G1期减少（P〈0.05）,S期细胞数增多（P〈0.05）。当法舒地尔浓度增加到20μmol/L时对细胞的作用并非随浓度的增加而增强,与15μmol/L组的差异无显著性意义（P〉0.05）。15,20μmol/L法舒地尔组与siRNA沉默RhoA基因组相比差异无显著性意义（P〉0.05）。说明Rho激酶抑制剂法舒地尔和RNAi介导的RhoA基因沉默在体外均能促进神经干细胞增殖,法舒地尔最佳作用浓度为15μmol/L。     

表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对人胎脑室下区神经干细胞增殖分化的影响

背景由于神经干细胞分化的多向性和不确定性给临床应用造成巨大困难,因此,探讨神经干细胞增殖分化条件已成为解决这一问题的关键.目的观察表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对人胎脑神经干细胞增殖分化的影响. 设计以培养的人胚神经干细胞为观察对象,随机对照实验.单位解放军第一军医大学珠江医院儿科.材料实验于2004-01/05在全军儿科中心实验室进行.随机在广州市某三级甲等医院产科选取自愿水囊引产的16周胎儿2例(胎儿父母签署同意书),取其脑室下区组织分别在无血清培养基和血清培养基进行细胞培养.方法采用含有表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子以及表皮生长因子+碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养基对人胎脑室下区组织进行原代细胞培养;两种生长因子的浓度均为20 μg/L,采用血清培养基对原代培养的细胞克隆球进行分化实验;并采用免疫组化技术对分化细胞进行检测.主要观察指标各组克隆球数量及其分化为神经元和星形胶质细胞的变化.结果①碱性成纤维细胞生长因子组、表皮生长因子+碱性成纤维细胞生长因子组形成的原代克隆球数量无显著差异[(150.3±14.9),(173.6±26.4)个/孔,P＞0.05],但均明显多于表皮生长因子组[(99.5±14.9)个/孔,P＜0.01].②碱性成纤维细胞生长因子组以及表皮生长因子+碱性成纤维细胞生长因子组克隆球分化为神经元的数量明显多于表皮生长因子组,而表皮生长因子组产生较多的星形胶质细胞.结论①碱性成纤维细胞生长因子能促进人胎脑室下区神经干细胞增殖,所形成的细胞克隆球能分化出较多的神经元.②两种因子合用并没有获得明显的优于单用碱性成纤维细胞生长因子的结果,提示不存在协同作用.     

中枢神经系统再生的可能性:碱性成纤维生长因子和表皮生长因子对胚胎神经干细胞生长分化的影响

目的研究碱性成纤维生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)对胚胎神经干细胞生长和分化的影响.方法从孕11～13d大鼠胚胎神经管取神经干细胞,原代体外培养中加入bFGF和EGF,观察对神经干细胞胞体发育及突起生长的影响.结果EGF主要影响神经干细胞的增殖,也可以促进细胞突起的生长,但胞体直径与相应的对照组无显著差异;bFGF可促进胞体发育及突起的生长;两种因子联合应用,生长作用优于单独应用组.结论EGF和bFGF可以促进原代培养胚胎神经干细胞的生长和分化.     

兔骨髓间充质干细胞体外培养定向诱导分化为软骨细胞

背景：骨髓间充质干细胞具有分化为骨、软骨、肌腱、脂肪等组织的多分化潜能。目的：体外培养兔骨髓间充质干细胞并定向诱导分化为软骨细胞,探讨体外诱导分化为软骨的方法和条件。方法：取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子体外培养后,取第3代细胞在培养基中添加不同质量浓度转化生长因子β1的软骨分化诱导剂,2周后倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色,RT-PCR技术检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达。结果与结论：可以从兔骨髓中培养出骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子能明显的促进骨髓间充质干细胞增殖。经软骨诱导分化后骨髓间充质干细胞呈软骨细胞形态,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达阳性。10μg/L的转化生长因子β1诱导成软骨分化能力最强。     

不同培养条件下胚胎神经干细胞分化细胞中神经元所占比例的比较

目的比较细胞因子(bFGF、EGF)、B27及血清对胚胎神经干细胞分化的影响。方法从孕16-18d大鼠胚胎脑室旁组织分离神经干细胞,进行原代培养,分为B27组、bFGF+EGF组(联合组)、血清组及对照组;每天观察细胞生长状况。结果培养细胞呈Nestin免疫阳性;各组均可见干细胞的生长及分化。免疫荧光双标及图象分析结果B27组及联合组神经干细胞分化为神经元的比例大,联合组更突出(P<0.01);血清组及对照组神经干细胞组分化为胶质细胞比例较大,血清组更突出(P<0.01)。结论神经干细胞的分化同时受到内在基因和外在环境的影响,bFGF、EGF可促进NSC细胞生长,并对细胞分化为神经元起很大作用。     

ERK1/2信号传导通路介导碱性成纤维细胞生长因子诱导人晶状体上皮细胞中环氧合酶2的表达

背景：碱性成纤维细胞生长因子在各种白内障形成中都起着重要的作用,可促进晶状体上皮细胞的增殖并化生为纤维细胞,但其信号通路尚不清楚。目的：探讨ERK1/2信号转导通路在碱性成纤维细胞生长因子诱导的人晶状体上皮细胞环氧合酶2表达中的作用。方法：使用10μg/L的碱性成纤维细胞生长因子干预培养的人晶状体上皮细胞0,1,3,6,12,24h,RT-PCR检测刺激不同时间人晶状体上皮细胞环氧合酶2mRNA的表达,Western blot检测细胞中环氧合酶2及磷酸化ERK1/2的表达。在阻断实验中应用特异性ERK1/2的阻断剂PD98059阻断ERK信号转导通路1h,再用10μg/L碱性成纤维细胞生长因子刺激细胞6h,Western blot检测细胞中环氧合酶2的表达。结果与结论：碱性成纤维细胞生长因子刺激后的人晶状体上皮细胞中环氧合酶2mRNA及其蛋白的表达显著增加（P〈0.01）,同时碱性成纤维细胞生长因子诱导人晶状体上皮细胞磷酸化ERK1/2活性增强,表达水平随作用时间而增加,30min时达到最高峰（P〈0.01）,6h后恢复至基线水平;PD98059可抑制人晶状体上皮细胞环氧合酶2的表达（P〈0.01）。说明ERK1/2信号转导通路参与了碱性成纤维细胞生长因子诱导的人晶状体上皮细胞中环氧合酶2的表达,在后发性白内障的形成过程中起着重要作用。     

蛇床子素可促进体外培养神经干细胞的增殖

背景：神经干细胞具有自我更新和多向分化潜能,但正常情况下,神经干细胞数目太少,且大部分处于静息状态,促进其增殖是神经干细胞治疗神经退行性疾病的关键。目的：观察蛇床子素对体外培养的神经干细胞增殖作用的影响,分析其促进增殖能力的作用机制。方法：体外培养神经干细胞,在增殖培养基中培养至第3代,加入不同浓度的蛇床子素（10,50和100μmol/L）作用24 h用CCK-8法检测细胞活力,再培养3,5,7 d后测量神经球半径,用免疫荧光组化法计数Ki67阳性细胞数目;再培养3 d后利用RT-PCR技术检测神经干细胞中Notch 1、Hes 1和Mash 1基因表达的情况。结果与结论：与正常组比较,50,100μmol/L的蛇床子素具有明显促进神经干细胞增殖能力的作用,100μmol/L作用最为显著,可引起Notch 1基因、Hes 1基因上调表达,对Mash 1基因基本无影响,说明蛇床子素对体外培养的神经干细胞具有促进增殖作用,其作用机制可能与激活Notch信号通路上的Notch 1、Hes 1基因有关。