ID-LC-MS/MS方法对高糖血症SD大鼠肾组织DNA中8-oxo-dGsn的检测

目的 用同位素稀释高效液相-串联质谱法（Isotope-Diluted LC-MS/MS,ID-LC-MS/MS）和免疫组化法检测高糖血症SD大鼠肾组织DNA氧化产物8-羟基脱氧鸟苷（8-oxo-dGsn）的含量,评价高糖血症对大鼠肾组织DNA氧化损伤的影响.方法 健康雄性SD（Sprague-Dawley rats）大鼠28只,随机分为4组：3月糖尿病模型组（3DR组）及其对照组（3CR组）,6月糖尿病模型组（6DR组）及其对照组（6CR组）.糖尿病模型组接受腹腔单次链脲佐菌素（streptozotosin,STZ）每公斤70mg注射,对照组接受腹腔生理盐水注射.糖尿病模型组造模成功3个月及6个月后,分别抽提大鼠肾组织DNA,用ID-LC-MS/MS方法检测其DNA氧化产物8-oxo-dGsn的含量;用免疫组化法观察肾组织中DNA氧化损伤部位及程度.结果 糖尿病模型组造模成功3个月时肾组织DNA中8-oxo-dGsn高于对照组高,造模成功6个月时肾组织DNA中8-oxodGsn含量比正常对照组增加显著（P＜0.01）;免疫组化结果显示3个月模型组DNA氧化损伤水平高于对照组,6个月时模型组DNA氧化损伤更为严重.结论 高糖血症3个月可造成大鼠肾组织DNA的氧化损伤,高糖血症6个月时大鼠肾组织中DNA氧化损伤程度呈显著增加,高糖血症是肾组织中DNA氧化损伤的重要原因.     

DNA氧化损伤及其修复基因OGG1和MTH1的研究进展

过量的自由基特别是活性氧自由基(ROS),可以攻击包括DNA、蛋白质等所有生物分子,产生多种不同氧化产物,对机体造成各种不良后果.DNA对活性氧特别敏感,ROS能引起DNA的多种类型损伤,可形成种类繁多的具有致DNA突变作用的碱基氧化产物,其中鸟嘌呤8位碳原子的氧化最常见,其氧化产物8-羟基鸟嘌呤被视为DNA氧化损伤的生物标志物.机体具有多种途径修复DNA氧化损伤,对于这种DNA损伤修复的主要代表酶有MutT同源酶即8-羟基鸟嘌呤核苷酸(MTH1)和8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(OGG1),MTH1能够分解核苷酸池中的8-羟基鸟嘌呤,可以减少8-oxodGTP结合到DNA上,而OGG1则是能切除DNA中被氧化的碱基.本文将阐述氧化损伤的种类、危害及其修复的途径,着重于氧化损伤修复中的主要修复基因OGG1和MTH1的结构功能、表达与疾病关系的研究进行综述.     

高效液相色谱检测DNA加合物的方法研究

目的 建立高效液相色谱检测DNA加合物的方法.方法 确定样品处理方法,对多个因素进行分析,建立HPLC检测BPDE-DNA加合物的方法,最后用质谱对DNA加合物的结构进行验证.结果 色谱柱为Phenomenex,C18(ODS)柱,5μm,250×4.6mm;柱温为室温;流动相A为甲醇,B为乙酸-乙酸铵缓冲液(pH4.5±0.2);梯度洗脱流速1.0ml/min;荧光检测器检测λex=338nm,λem=425nm.结论 所建立的HPLC检测DNA加合物的方法具有简单快速、操作简便、成本低廉等特点.     

大鼠灌胃棉花皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷后血清中药物的分析

目的 研究大鼠灌胃棉花皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷后血清中药物的分析检测方法.方法 大鼠灌胃250mg/kg棉花皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷,收集血样,进行适当的前处理,采用HPLC-DAD、LC-MSc法对血清样品进行检测.结果 HPLC-DAD和LC-MSn两种方法均能检测到血清中的棉花皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷,但未能检测到其代谢产物.血清样品前处理中的离心转速、pH值、纯化方法对血清中棉花皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷的分析检测有明显影响.结论 建立了大鼠灌胃棉花皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷后血清中药物的快速灵敏的分析检测方法,为棉花皮索-8-O-葡萄糖醛酸苷的进一步药动学研究提供参考依据.     

大鼠BPDE-DNA加合物生成及其高效液相色谱测定

目的 研究苯并(a)芘(BaP)诱导大鼠产生(7R,8S)-二羟基-(9S,10R)-环氧-7,8,9,10-四氢苯并(a)芘(BPDE)-DNA加合物的生成.建立以血液为样品的检测染毒大鼠BPDE-DNA加合物的高效液相色谱法.方法 选用清洁级SD大鼠,一次性腹腔注射苯并(a)芘二甲基亚砜溶液(以1%羧甲基纤维素钠为助溶剂)100 mg/kg,5 h后取股静脉血.提取抗凝全血中的DNA,采用琼脂糖凝胶电泳确认DNA的提取效果.将提取的DNA在 0.1 nmol/L HCl、90 ℃恒温水浴箱中酸水解4 h,乙酸乙酯提取酸水解产物--四醇-苯并(a)芘.高效液相色谱法检测,最后用高效液相色谱-质谱法确认.结果 BaP 染毒组与溶剂对照组和阴性对照组比较,高效液相色谱检测有新的色谱峰产生,质谱确定其相对分子质量与四醇-苯并(a)芘一致.结论 本实验的染毒方法能使大鼠产生 BPDE-DNA 加合物;建立的高效液相色谱法可以血液为样品检测 BPDE-DNA 加合物.     

液相色谱-质谱联用技术的研究进展

20世纪70年代,液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术开始出现,当时的场解吸(FD)离子化技术虽然能测定分子量1500～2000Da的非挥发性物质,但重复性差.后来出现的快原子质谱法(FAB-MS),对分子量较大的多肽类化合物测定效果良好.随着现代科学技术的发展,更加精密的化合物分析质谱法—电喷雾离子化质谱法(ESI-MS)和大气压化学电离源质谱法(APCI-MS)应运而生.本文对近年来LC-MS的研究应用进行综述.     

液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测血浆肾素活性(PRA)的方法学建立和临床应用评估

 目的    建立高血压患者血浆肾素活性(plasma renin activity,PRA)液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)的检测方法,用于早期筛查高血压患者中的原发性醛固酮增多症(primary aldosteronism,PA)。方法    arginine 13C 15N作为内标,采用Phenomenex Kinetex C18柱(2.6 μm,100 mm×3.0 mm)进行分离,柱温55 ℃。流动相为0.2%甲醇水溶液和0.2%甲酸甲醇溶液,流速为0.5 mL/min,梯度洗脱。考察该方法的特异性、基质效应、携带污染、重复性、定量下限(lower limit of measuring interval,LLMI)、线性、不精密度、回收率、稀释一致性和血浆标本稳定性。采用LC-MS/MS方法测定296名表面健康人群(男性153名,女性143名,平均年龄48岁)及360名高血压患者(平均年龄52岁,确诊为PA 27例)的血浆样本PRA,并与放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)进行比较。结果    该方法通过了特异性、基质效应、携带污染、重复性的性能评价。PRA的检测线性范围为0.084 4～30.000 0 ng/mL;PRA的LLMI为0.084 4 ngmL-1h-1;日间和批内的不精密度变异系数(coefficient of variation,CV)均＜15%;准确度偏差均<15%,回收率为92.28%～102.62%;建立的生物参考区间为0.25～5.12 ngmL-1h-1 (立位);与RIA比较,结果相关性较好(r2=0.81,P＜0.05),但存在-18.5%的偏倚;LC-MS/MS所得PRA的醛固酮/肾素活性比值(aldosterone to renin ratio,ARR)对PA的诊断特异性与灵敏度分别为96.3%与91.0%,诊断性能更佳(AUC:0.983 vs.0.894)。结论    我们建立了准确检测PRA的LC-MS/MS方法,适合于临床早期快速筛查PA。     

汽油尾气致大鼠肺组织氧化损伤机制的研究

目的 探讨汽油尾气对大鼠肺DNA损伤、8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶-1(OGG1)表达和细胞超微结构的影响.方法 将汽油尾气的颗粒物、冷凝物和半挥发性有机物的二氯甲烷提取物以0、5.6、16.7和50.0 L/kg的剂量经气管滴注染毒SD大鼠,每周一次,共4次,末次染毒24 h后处死动物,用彗星实验检测肺组织细胞中DNA单链断裂水平,免疫组化检测肺组织中OGG1的含量,并在电镜下观察各型肺细胞超微结构的变化.结果 在汽油尾气16.7和50.0 L/kg组,肺组织细胞的拖尾率明显高于溶剂对照组(P<0.05),并有随剂量增加而增加的趋势,但各剂量组尾长的增加均无统计学意义;而汽油尾气中、高剂量组OGGI蛋白水平明显增加(P<0.05);在汽油尾气50.0 L/kg组,肺组织各型细胞中的线粒体发生肿胀和空泡化,且线粒体数量明显减少.结论 汽油尾气可诱导大鼠肺组织DNA单链断裂、OGG1蛋白含量增加和线粒体的损伤.     

LC-MS法测定人血浆中氨氯地平浓度及其生物等效性评价

目的建立液相-质谱联用（LC-MS）法测定人血浆中氨氯地平浓度，并进行两种制剂的生物等效性评价。方法采用随机双交叉试验设计，18名健康受试者口服受试制剂和参比制剂5mg，用LC-MS法测定人血浆中氨氯地平浓度。结果受试制剂和参比制剂的主要药动学参数：AUC0→t分别为（104．01±26．03）和（101．91±24．67）ng·h·ml^-1；AUC0→∞分别为（113．96±30．66）和（110．29±27．67）ng·h·ml^-1；Cmax分别为（2．44±0．40）和（2．43±0．38）ng·ml^-1；tmax分别为（7．28±2．92）和（7．50±3．04）h；t1／2分别为（33．33±6．30）和（30．93±4．18）h。受试制剂的相对生物利用度为（103．34±6．69）％。两种制剂主要动力学参数经统计学检验无显著性差异（P〉0．05）。结论该方法简单、快捷、准确，氨氯地平片的受试制剂和参比制剂具有生物等效性。     

两种不同类型的胃癌组织中DNA氧化损伤的水平及临床意义

目的检测胃腺癌、印戒细胞癌组织及正常胃黏膜组织中8-羟基脱氧鸟苷（8- oxodGsn）水平,探讨DNA氧化损伤与不同类型胃癌临床指标间的关系。方法提取42例胃癌（腺癌28例,印戒细胞癌14例）及癌旁5cm以外的正常组织的DNA,并采用核酸酶P1和碱性磷酸酶消化成单个核苷,再采用高效液相色谱-串联质谱法（LC- MS/MS）检测其8- oxodGsn的水平;同时联合免疫组化法对组织中的8- oxodGsn进行定位分析。结果不同类型胃癌组织与正常组织中8- oxodGsn水平的差异均有统计学意义（均P＜0.05）。8- oxodGsn主要分布于肿瘤细胞的细胞质和细胞核内,腺癌细胞中以细胞核分布居多,印戒细胞癌中以细胞质分布居多。不同类型胃癌组织中8- oxodGsn水平在癌组织浸润深度、淋巴结转移程度、远处器官转移程度、临床病理分期等差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论8- oxodGsn水平在两种类型的胃癌组织中均有不同程度的增加,提示DNA氧化损伤可能是胃癌发生、发展的重要因素。     

Fast evaluation of oxidative DNA damage by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry coupled with precision-cut rat liver slices

Objective To establish a fast and sensitive method for the detection of 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine (8-OHdG) in precision-cut rat liver slices by HPLC-MS/MS and to investigate isoniazid (INH) -induced oxidative DNA damage. Methods Precision-cut liver slices (300 μm) were prepared from male rats, and incubated with INH (0.018 mol/L) for 2 h after 1 h preincubation. DNA in the slices was extracted and digested into free nucleosides at 37℃ . The samples were injected into HPLC-MS/MS after the proteins were removed. The level of oxidative DNA damage was estimated using the ratio of 8-OHdG to deoxyguanosine (dG). Results The limit of detection of 8-OHdG was 1 ng/mL (S/N=3) and the intra-assay relative standard variation was 3.38% when one transition 284.3/168.4 was used as a quantifier and another two transitions 284.3/140.2, 306.1/190.2 as qualifiers. 8-OHdG and dG were well separated, as indicated by elution at 10.02 and 7.37 min, respectively. INH significantly increased the ratio of 8-OHdG to dG in rat liver slices (P<0.05). Conclusion 8-OHdG in precision-cut liver slices could be sensitively determined by HPLC-MS/MS. HPLC-MS/MS coupled with precision-cut tissue slices is a fast and reliable analytical technique to evaluate oxidative DNA damage of target tissues caused by procarcinogens and cytotoxins.     

ID-LC-MS/MS评估糖尿病大鼠DNA和RNA氧化损伤

目的 评估高血糖对DNA和RNA氧化损伤的影响。方法 以链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠为模型,运用放射性核素稀释高效液相-串联质谱（ID-LC-MS/MS）法检测大鼠肾性、心性、肝性、肺、脑、睾丸、附睾、血浆和尿中的核酸氧化标志物8-氧化脱氧鸟苷（8-oxo-dGsn）和8-氧化鸟苷（8-oxo-Gsn）的含量,并进行比较分析。结果 虽然不同脏器DNA中8-oxo-dGsn/10⁶ dGsn和RNA中8-oxo-Gsn/10⁶ Gsn的基础水平不一致,但是模型组SD大鼠不同脏器中8-oxo-Gsn/10⁶ Gsn和8-oxo-dGsn/10⁶ dGsn的水平均高于对照组,6月组糖尿病大鼠肾脏、肺脏和睾丸中8-oxo-dGsn/10⁶ dGsn的水平高于对照组相应脏器的水平（P<0.05）;3月组糖尿病大鼠肾脏、心脏和睾丸中8-oxo-Gsn/10⁶ Gsn的水平高于对照组相应脏器的水平（P<0.05）;除了脑和肺脏,6月组糖尿病大鼠各脏器中8-oxo-Gsn/10⁶ Gsn的水平均高于其对照组（P<0.05）;糖尿病大鼠血浆8-oxo-dGsn和8-oxo-Gsn浓度明显高于其同龄对照大鼠,且随着高糖血症的持续而增加。尿液检测结果的趋势与血浆中的检测结果一致,RNA氧化代谢产物8-oxo-Gsn均高于DNA的氧化代谢产物8-oxo-dGsn。结论 高血糖引起的氧化应激增强可以造成多器官DNA和RNA氧化损伤增加,DNA和RNA氧化损伤随着高糖血症的持续而增加;RNA氧化损伤水平高于DNA氧化损伤,其标志物尿液8-oxo-Gsn可以作为评估糖尿病氧化应激状态的良好指标。     

高效液相色谱-串联质谱同时测定人血浆中8种抗抑郁药的浓度

目的：建立同时测定血浆中米氮平、舍曲林、帕罗西汀、度洛西汀、阿米替林、去甲阿米替林、艾司西酞普兰及劳拉西泮8种抗抑郁类药物浓度的高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）。方法：内标为度洛西汀-d7,使用甲醇将血浆样品进行蛋白沉淀后分析。Waters Cortecs C18(2.1mm×50.0mm,2.7μm)色谱柱, 0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇溶液梯度洗脱,流速0.5mL/min,电喷雾阳离子源。通过实验对这一方法的专属性、精密度、回收率等进行考察。结果：米氮平、帕罗西汀、艾司西酞普兰在1~200ng?mL-1;舍曲林、去甲阿米替林、度洛西汀、阿米替林及劳拉西泮在2.5~500 ng?mL-1范围内均表现良好的线性关系,回收率在94.70%~101.31%之间,精密度（RSD）小于15%。结论：该方法在临床同时测定服药患者血液中抗抑郁药物的浓度时相较其他方法具有快速、灵敏、准确的特点,且具有专属性强,重复性好,稳定性高的优点。     

乙醇对雄性大鼠甲状腺和肾上腺皮质功能影响

目的研究乙醇对雄性大鼠甲状腺和肾上腺皮质功能的影响。方法给予雄性大鼠每天１５００ｍｇ／ｋｇ,３０００ｍｇ／ｋｇ和４０００ｍｇ／ｋｇ体重乙醇染毒连续７０天,并于染毒第３５天和７０天每组随机处死１０只,经腹主动脉采血,测定对照组及各剂量组血清ＦＴ３,ＦＴ４,ＴＳＨ和ＣＳ含量。结果染毒３５天各剂量组大鼠血清中ＦＴ３,ＦＴ４,ＴＳＨ和ＣＳ未发现有意义的改变;染毒７０天３０００ｍｇ／ｋｇ和４０００ｍｇ／ｋｇ组ＦＴ３含量较１５００ｍｇ／ｋｇ组下降,而４０００ｍｇ／ｋｇ组ＦＴ４含量较１５００ｍｇ／ｋｇ和３０００ｍｇ／ｋｇ组下降,差异均有显著性（Ｐ＜０．０５）;染毒７０天４０００ｍｇ／ｋｇ组ＣＳ含量较对照组升高,差异有显著性（Ｐ＜０．０５）,且存在明显的剂量－效应关系。结论乙醇在一定程度上损害了大鼠甲状腺及肾上腺皮质的功能。     

亚低温对大鼠脑缺血再灌注后ICAM-1表达的影响

目的　观察亚低温的不同时程对大鼠脑缺血再灌注后ICAM 1表达的影响。方法　 30只SD大鼠随机分为 5组 :假手术组 ,常温组 ,亚低温 1/ 2h组 ,亚低温 1h组 ,亚低温 3h组。每组各 6只 ,参照ZeaLonga的方法建立脑缺血再灌注动物模型 ,于缺血 3h再灌注 2 4h后 ,断头取脑 ,行ICAM 1免疫组化染色。其中 ,亚低温组于缺血即刻行不同时程 (1/ 2h、1h、3h)的亚低温治疗。结果　常温组可见在缺血梗死灶周围区ICAM 1表达阳性的微血管数较多 ;随亚低温治疗时间的延长 ,其阳性微血管数减少。常温组与亚低温组以及各组与假手术组之间均有显著差异 (P <0 .0 1)。结论　ICAM 1参与脑缺血再灌注损伤 ,亚低温治疗可抑制脑缺血再灌注后ICAM 1的表达 ,并具有神经保护作用。     

8-烷基黄连碱同系物的合成及体外降糖作用

目的 研究八角莲Dysosma versipellis根茎的化学成分。方法 运用硅胶、凝胶及RP-HPLC等多种色谱技术对八角莲根茎的化学成分进行分离纯化,并根据理化性质和波谱数据鉴定化合物的结构。结果 从八角莲根茎95%乙醇提取物的醋酸乙酯和正丁醇萃取部位分离并鉴定了14个化合物,其中木脂素类化合物10个,分别为4′,5′-二去甲基鬼臼毒素（4′,5′- didemethylpodophyllotoxin,1）、鬼臼毒素（podophyllotoxin,2）、4′-去甲基鬼臼毒素（4′-demethylpodophyllotoxin,3）、山荷叶素（diphyllin,4）、鬼臼毒酮（podophyllotoxone,5）、苦鬼臼毒素葡萄糖苷（picropodophyllotoxin-4-O-β-D-glucoside,6）、4′-去甲基鬼臼毒素葡萄糖苷（4′-demethylpodophyllotoxin-4-O-β-D-glucoside,7）、山荷叶素葡萄糖苷（diphyllin-4-O-β-D- glucoside,8）、鬼臼毒素葡萄糖苷（podophyllotoxin-4-O-β-D-glucoside,9）、八角莲醇（dysosmarol,10）;黄酮类化合物3个,分别为山柰酚（kaempferol,11）、槲皮素（quercetin,12）、山柰黄素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（kaempferol-3-O-β-D-glucoside,13）;甾醇类化合物1个,为β-谷甾醇（β-sitosterol,14）。结论 化合物1为新天然产物,化合物7和8为首次从该属植物中分离得到。     

高效液相色谱串联质谱法测定人血浆中拉莫三嗪的浓度

 目的 建立简单、快速和灵敏的高效液相色谱串联质谱法以测定人血浆中拉莫三嗪的浓度。 方法 血浆样品经甲醇直接沉淀蛋白后,采用Thermo Hypurity C18柱(4.6×250 mm,5 μm)分离,流速为0.20 mL/min,以甲醇∶0.1%甲酸＝80∶20为流动相等度洗脱。通过电喷雾离子源进入质谱,以二级质谱多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)方式进行检测。结果 拉莫三嗪的线性范围为8.19～2 096 ng/mL,平均相对回收率在80% ～ 120%范围内,日内和日间变异均 <15%。结论 本法简单、快速、重现性好,能够用于拉莫三嗪的人体药代动力学性研究。     

亚低温缺血预处理对大鼠肠缺血再灌注肾损伤的保护作用

目的探讨亚低温下缺血预处理对大鼠肠缺血再灌注肾损伤的保护作用。方法选用健康Wistar大鼠24只，随机分成3组（每组8只）：假手术对照组（sham组）、缺血再灌注组（I／R组）、亚低温预处理组（MHIP组）。夹闭大鼠肠系膜上动脉（SMA）60min造成缺血，再灌注2h后取出肾组织制成匀浆，测定超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化酶（GSH—PX）、Ca^2＋-Mg^2＋-ATPase的活性及丙二醛（MDA）含量，观察肾组织形态细胞学变化。结果MHIP组肾组织MDA含量明显低于I／R组（P〈0．01），SOD、GSH—PX、Ca^2＋-Mg^2＋-ATPase的活性均明显高于I／R组（P〈0．01），肾细胞形态学异常变化明显减轻。结论亚低温缺血预处理能减少大鼠脂质过氧化，改善ATPase功能，减轻大鼠肠缺血再灌注所致肾损伤。     

液相色谱串联质谱法同时测定化妆品中溴甲酚绿与溴百里酚蓝

目的：建立液相色谱串联质谱同时测定化妆品中溴甲酚绿与溴百里酚蓝的定性、定量方法。方法样品经甲醇超声提取,HLB固相萃取柱分离,再通过C18色谱柱(Kinetex C182.6μm 100A 100×2.10 mm)分离,采用电喷雾离子源及多反应监测模式(MRM)对目标化合物进行测定。结果溴甲酚绿与溴百里酚蓝的方法检出限分别是0.82 mg/kg、0.84 mg/kg。溴甲酚绿与溴百里酚蓝的线性范围均为0.02~4μg/mL,相关系数均大于0.9995(rBG=1.0000,rBB=0.9999),在不同剂型的化妆品中平均回收率在98.0%~109%范围内。结论该方法具有前处理简单,结果准确等特点,适用于化妆品中溴甲酚绿与溴百里酚蓝的测定。     

Expression of 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine in gastric carcinomas

Reactive oxygen species may be involved in the progression of gastric carcinomas. To clarify whether the pathology of gastric carcinoma are related to oxidative DNA damage, the expression of 8-hydroxy-2＇-deoxyguanosine （8-OHdG） was examined in 30 patients with gastric carcinomas. Methods： The expression of 8-OHdG and apoptosis in the gastric carcinoma were measured using the methods of immunocytochemistry and deoxynucleartididyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling （TUNEL）, respectively. Results： Of the 30 cases, 25（83%） showed stronger immunoreactivity than normal control. The patients with poorly differentiated gastric carcinoma had a larger tumor size and higher labeling indices of TUNEL- and 8-OHdG-positive cells than those with well and moderately differentiated gastric carcinoma. Conclusion： Our findings suggest that oxidative DNA damage is increased in association with necroinflammation in chronic gastric injuries and determination of 8-OHdG is useful in assessing high-grade malignancy in gastric carcinomas.