糖尿病早期大鼠视网膜毛细血管细胞凋亡研究

目的：研究早期糖尿病视网膜病变大鼠视网膜毛细血管细胞凋亡及其特征。方法：腹腔内注射链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型。应用PAS染色、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记（TUNEL）法标记和透镜观察进行研究。结果：在糖尿病3月和6月,可见周细胞和内皮细胞鬼影;周细胞和内皮细胞核异染色质聚集靠边并随病程进展而加重;被TUNEL法标记的细胞核染色质分布不均,表现为环形核、新月形核等。结论：早期糖尿病视网膜病变大鼠视网膜毛细血管周细胞丧失的性质为细胞凋亡,内皮细胞亦存在凋亡。     

糖尿病大鼠视网膜毛细血管细胞凋亡及其凋亡相关基因的表达

目的 确定早期糖尿病大鼠视网膜毛细血管细胞凋亡并观测凋亡相关基因（Bax、bcl-2）在早期糖尿病大鼠视网膜的表达。方法 选择健康成年Wistar大鼠40只,随机分成正常对照组（contrast group,CON）和糖尿病（diabetes mellitus)1个月（DM1）、3个月（DM3）及6个月（DM6）组。腹腔内注射链脲佐菌素（streptozotocin,STZ)诱发大鼠糖尿病。制备大鼠视网膜血管辅片及切片,分别行TUNEL法和免疫组化ABC法染色,并对ABC法染色结果进行计算机图像分析。结果 TUNEL法标记的阳性周细胞核出现于DM3和DM6组,而内皮细胞见于DM6组,CON和DM1组未见阳性反应。TUNEL阳性反应细胞核染色质分布不均,表现为环形核、新月形核等典型凋亡细胞特征。ABC法染色：于CON及DM各组,Bax和bcl-2二基因的蛋白均在视网膜血管表达。随病程进展,其阳性反应强度逐渐增加。此外,bcl-2阳性反应在DM3组于色素上皮细胞出现。在DM6组进一步扩大到视杆内节和节细胞。而Bax在DM6组亦出现于细胞。结论 早期糖尿病大鼠视网膜毛细血管周细胞丧失的性质为凋亡,内皮细胞亦存在凋亡;Bax和bcl-2在早期糖尿病大鼠视网膜的表达增加。     

早期糖尿病大鼠视网膜毛细血管及视细胞超微结构变化

目的：探讨糖尿病性视网膜病变（diabetic retinopathy,DR简称糖网病）早期大鼠视网膜毛细血管及视细胞（视感受器）的病变发展规律。方法：选择健康成年Wistar大鼠,随机分成正常对照组（CON）,糖尿病1个月（DM1）组、3个月（DM3）组和6个月（DM6）组。按55mg/kg体重一次性向腹腔内注射链脲佐菌素（STZ）诱导大鼠糖尿病。取大鼠视网膜制备成超薄切片,用透射电镜观察并进行计算机图像分析。结果：病程1个月时,周细胞和内皮细胞核异染色质聚集靠边,视杆细胞膜盘模糊不清,膜盘间隙略有扩大。病程3个月时,周细胞和内皮细胞异染色质聚集严重,毛细血管扩张,基底膜增厚,膜盘间隙明显扩大,并发生局灶性断裂、溶解。视杆细胞膜固缩、异染色质浓集。视杆内节线粒体肿胀、甚至发生空泡变性。病程6个月时,以上改变更加严重,但毛细血管由扩张转为狭窄、变形、甚至闭塞。结论：糖网病早期大鼠视网膜毛细血管出现病变的同时,亦出现视感受器超微结构的改变。该两种变化随病程的进展而呈逐渐加重的趋势。     

周细胞与早期糖尿病视网膜病变的关系

糖尿病视网膜病变最早期主要特征是基底膜增厚、内皮细胞紧密连接丧失、周细胞选择性丧失等微血管的形态改变,伴随血管渗透性增加、毛细血管闭塞、微动脉瘤,随后出现内皮细胞丧失.周细胞调节着血管张力和灌注压,周细胞凋亡会打破周细胞与内皮细胞之间的紧密联系,从而导致视网膜新生血管形成,这是临床上能最早观察到的糖尿病视网膜的血管异常.高血糖和局部血压增高是引起周细胞凋亡、丧失以及细胞内糖代谢异常的主要原因,然而具体机制尚未完全明确,需要进一步研究并寻找新的预防糖尿病视网膜病变的有效药物.     

糖尿病视网膜毛细血管周细胞凋亡分子生物学机制的研究进展

随着糖尿病视网膜病变研究的进展,已证实糖尿病视网膜毛细血管周细胞的丧失是由细胞凋亡所引起的。糖尿病患者体内血糖水平的增加使视网膜毛细血管周细胞内氧自由基产生增加,导致DNA修复酶聚ADP核糖多聚酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)激活、线粒体内细胞色素C(cytochrome C,CytC)的释放激活半胱天冬酶(caspase)家族、周细胞内Ca2 浓度增加、激活核转录因子-κB(the nuclear factor-κB,NF-κB),从而引起细胞凋亡。糖尿病患者由于糖化血红蛋白的增多等原因,视网膜长期处于低氧状态。低氧则引起视网膜毛细血管周细胞DNA损伤、氧自由基的产生增加、细胞凋亡抑制基因Bcl-2的低表达,导致细胞凋亡。糖尿病患者体内高血糖水平和继发形成的糖基化终末产物(advancedglycation end-products,AGEs)都能够使视网膜毛细血管周细胞的Bax基因高表达与Bcl-2基因的表达减少,引起促凋亡、抗凋亡基因比例失衡,导致细胞凋亡。色素上皮衍生因子(pig-ment epithelium-derivedfactor,PDEF)可以增加视网膜毛细血管周细胞内谷胱苷肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)mRNA转录水平,阻止高糖引起的视网膜毛细血管周细胞内氧自由基的增加,因而具有细胞凋亡作用。糖尿病患者体内PDEF水平的降低,导致了视网膜毛细血管周细胞凋亡的发生。     

糖尿病大鼠早期视网膜神经节细胞凋亡机制的探讨

目的：探讨糖尿病大鼠模型早期视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)凋亡的机制。

方法：SD大鼠60只,随机分为对照组(CON)及糖尿病组(DM),糖尿病组一次性腹腔注射1% STZ诱发糖尿病鼠模型,两组于第4,8,12wk分别行HE、透射电镜及TUNEL法检测RGCs的凋亡情况,并应用激光共聚焦显微镜检测RGCs内钙离子浓度的变化。

结果：糖尿病组第8wk开始出现RGCs数量减少、细胞排列紊乱的病理改变,第12wk更为明显。糖尿病组透射电镜下可见第4wk时RGCs出现线粒体肿胀; 第8wk时RGCs内肿胀的线粒体更为明显、数目增多,染色质边集于核膜周边,部分细胞体积缩小、细胞器减少; 第12wk时出现RGCs体积变小,甚至出现细胞核断裂。TUNEL阳性RGCs最早于糖尿病组第4wk时出现,随病程延长凋亡的阳性细胞逐渐增多,凋亡指数与同期对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。糖尿病组第8,12wk时RGCs内钙离子浓度明显高于同期对照组,差异显著(P<0.01); 糖尿病组第8wk与第12wk比较,升高差异亦有统计学意义(P<0.05)。

结论：糖尿病早期出现了视网膜神经节细胞的凋亡,其机制可能与细胞内钙离子浓度升高有关。     

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶在视网膜毛细血管周细胞凋亡中的活性及意义

目的探讨糖基化终产物（AGE）在糖尿病视网膜病变（DR）发生中的作用。方法培养的牛视网膜毛细血管周细胞分别与不同浓度（0．47、1．88、7．50μmol／L）的AGE共同培养4d后,分别检测细胞凋亡、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase-3）活性及caspase-3抑制剂Z—DEVD-fmk对周细胞凋亡及凋亡调节基因Bcl-2／Bax比率的影响。结果AGE能以剂量依赖的方式诱导培养的牛视网膜毛细血管周细胞凋亡（r=0．867,P〈0．01）、增加细胞内caspase-3的活性,而选择性caspase-3抑制剂Z—DEVD—fmk能明显抑制AGE作用下的周细胞凋亡及提高凋亡调节基因Bcl-2／Bax的比率。结论凋亡是DR中视网膜毛细血管周细胞选择性丧失的机制之一,caspase-3活性的增加是AGE诱导周细胞发生凋亡的关键因素。     

糖尿病视网膜病变时血管周细胞的凋亡

周细胞因其自身特点,能够维持血管的稳定性,并能够控制内皮细胞的增殖。周细胞的缺失是糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)主要特征之一。当发生DR时,毛细血管周细胞的凋亡途径被激活。人们对周细胞增殖与凋亡机制的研究不断深入,将会从毛细血管周细胞方面找到更多DR治疗的切入点。     

Nogo受体在早期糖尿病大鼠视网膜神经节细胞凋亡中的作用

目的:探讨Nogo受体(nogo receptor,NgR)在糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠视网膜神经节细胞凋亡中的作用及机制。方法:链脲佐菌素诱导SD大鼠DM模型,实验分4组,对照组;DM组;siNgR组:DM大鼠玻璃体内给予NgR反义核苷酸序列;siRNA空白组:DM大鼠玻璃体内给予阴性核苷酸序列。1mo后TUNEL染色检测视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)凋亡,试剂盒检测视网膜丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,Western-blot检测视网膜NgR及caspase-3含量。结果:对照组、DM组、siRNA空白组及siNgR组MDA含量分别为3.74±0.49,7.21±0.96,6.41±1.34及4.02±0.53nmol/mg prot。与对照组相比,DM组及siRNA空白组视网膜RGC凋亡增加,NgR及caspase-3表达上调,MDA含量升高(P<0.05),而siNgR组视网膜RGC数量、NgR及caspase-3表达、MDA含量较对照组均无明显变化(P>0.05)。结论:NgR表达增加是糖尿病RGC凋亡的重要原因之一,其机制可能与NgR诱导视网膜氧化应激、上调caspase-3表达有关。     

细胞凋亡与STZ糖尿病大鼠视网膜微血管病变关系

目的探讨细胞凋亡与STZ糖尿病大鼠视网膜微血管病变之间的关系。方法建立糖尿病大鼠动物模型,随机分为糖尿病3月组(DM3)及6月组(DM6),制备视网膜消化铺片,采用核苷酸末端转移酶介导DUTP缺口翻译法(TUNEL)检测视网膜毛细血管细胞凋亡变化,PAS染色及图像分析,动态观测视网膜微血管形态的改变。同时设立正常对照组。结果3月时糖尿病大鼠视网膜微血管周细胞发生细胞凋亡,周细胞数目减少,对照组及DM3组周细胞数目分别为(6.71±0.45)个及(6.17±0.45)个,2组比较差异具有显著性(P<0.01);6月时细胞凋亡呈增加趋势,DM6组及对照组周细胞数分别为(5·66±0·60)个及(6.52±0.40)个(P<0.01);与DM3组相比DM6组周细胞数目明显减少(P<0.01)。内皮细胞各组间差异均无显著性(P>0.05)。无细胞毛细血管数目增多。结论糖尿病大鼠视网膜周细胞凋亡呈增加趋势,并与微血管病变有关。     

锌抗糖尿病大鼠视网膜神经细胞凋亡的实验研究

目的探讨锌对糖尿病大鼠视网膜神经细胞凋亡的作用及对凋亡相关基因表达的影响。方法链尿佐菌素诱导糖尿病大鼠模型,随机分成3组,即正常对照组、糖尿病模型组和硫酸锌治疗组,7周后处死实验大鼠,HE染色光镜观察视网膜组织结构和细胞形态,TUNEL技术检测细胞凋亡情况,免疫组化SP法测定Bcl-2、Bax以及Caspase-3蛋白表达水平。结果糖尿病模型组与正常对照组相比,大鼠视网膜神经细胞凋亡数分别为17.12±0.38和4.16±0.63(P<0.001);Bcl-2阳性细胞数分别为15.01±0.35和23.78±1.13(P<0.001);Bax和Caspase-3蛋白表达水平在糖尿病组为15.41±0.36和22.12±1.18,在正常组2者表达水平分别为6.48±0.82和4.92±0.59,2者差异均具有显著性(P<0.001);锌治疗组与模型组比较,TUNEL阳性表达减少(13.09±0.54),Bcl-2阳性细胞数增多(19.82±0.39),Bax和Caspase-3蛋白表达水平下降(11.20±1.25,18.36±0.43),2者各实验指标差异有统计学意义(P<0.01)。结论硫酸锌能减少糖尿病大鼠视网膜神经细胞的凋亡,其抗凋亡作用可能与上调凋亡抑制基因Bcl-2的表达及下调凋亡促进基因Bax以及Caspase-3蛋白酶的表达有关。     

高糖及不同幅度高糖波动下牛视网膜毛细血管周细胞增生与凋亡的研究

目的分析不同浓度葡萄糖培养下的牛视网膜毛细血管周细胞增生、细胞周期改变及凋亡与葡萄糖浓度及高糖波动幅度的相关性，并对比同一水平下恒定高糖与高糖波动对周细胞作用的强度。方法以体外培养3代近融合的牛视网膜毛细血管周细胞为对象。分另q在不同浓度高糖（15mmol·L^-1、25mmol·L^-1、35mmol·L^-1）、不同幅度的高糖波动（5．5／15mmol·L^-1、5．5／25mmol·L^-1、5．5／35mmol·L^-1）及对照组（5、5mmol·L^-1）下孵育7d，采用MTT比色法观察周细胞增生情况；流式细胞术观察周细胞细胞周期变化情况；TUNEL法检测培养后周细胞的凋亡率。结果（1）高糖及高糖波动抑制周细胞增生，与葡萄糖浓度及高糖波动幅度呈正相关（P〈0．01），同一水平下持续高糖组作用强于高糖波动组（P〈0.05）；（2）高糖及高糖波动阻滞用细胞周期，使G0／G1期细胞比例增加，S期细胞比例减少，G2／M细胞比例无明显改变；（3）高糖及高糖波动诱导周细胞凋亡，高糖各组凋亡率分别为23．78％、37．22％．48．73％，而高糖波动组分别为15．53％、28．73％、39.14％，与对照组的4.25%相比差异有显著性意义（P〈0.01）且周细胞凋亡率与高糖的浓度呈正相差（P〈0.01）；与高糖波动幅度呈正相关（P〈0.01）；同一水平下持续高糖组作用强于高糖波动组（P〈0.05）。结论同一水平下恒定高糖较高糖波动可能具有更强的周细胞增生抑制，周期阻滞及诱导凋亡作用，这些作用可能与葡萄糖浓度及波动的幅度正相关。【眼科新进展2007；27（2）：87-90]     

N-乙酰半胱氨酸和曲尼司特对糖尿病视网膜病变的作用

目的：观察N-乙酰半胱氨酸与曲尼司特联合使用对糖尿病大鼠视网膜相关检测指标的影响,评估其对血管内皮细胞和周细胞的保护作用。方法：用链脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型60只,分为曲尼司特（TNL）组、N-乙酰半胱氨酸（NAC）组、联合用药（COM）组、模型（DM）组和空白对照（NOR）组。常规饲养12wk测定大鼠血清GSH-Px与SOD,免疫组织化学检测视网膜TNF-α和NF-κB的表达,观察视网膜血管消化铺片形态,并行血管内皮细胞与周细胞计数。结果：与正常组相比,糖尿病模型各组GSH-Px与SOD均不同程度降低,其中DM与TNL组较NAC组和COM组降低显著。TNF-α与NF-κB在DM组表达均为最高,NOR最低,其余三组均不同程度降低,以COM组降低为著（P〈0.01）。血管铺片示DM组血管形态以及周细胞与内皮细胞的损害明显,用药后有改善,以COM组为著。结论：NAC与TNL联合使用对DR血管内皮细胞与周细胞的损害有明显治疗作用,其作用机制可能与拮抗自由基、炎症反应以及抑制肥大细胞释放细胞因子有关。     

Effect of N-acetylcysteine on the early expression of inflammatory markers in the retina and plasma of diabetic rats

Purpose:  The aim of this study is to investigate markers of inflammation and oxidative stress in an early model of diabetic retinopathy, correlate retinal and plasma results and evaluate the influence of treatment by N -acetylcysteine (NAC), a free radical scavenger.
Methods:  Four groups were studied: control (C), streptozotocin (STZ)-induced diabetic rats (D), STZ rats following 8 weeks of NAC (DT), and control rats following 8 weeks of NAC (CT). Plasma levels of free 15-F2t-isoprostane (15-F-2t-IsoP), superoxide dismutase (SOD) and tumour necrosis factor-alpha (TNF-α) were obtained. Primary antibodies against macrophages (ED-1), microglia (Ox-42), pericytes (NG-2), endothelial and perivascular cells (IB-4), haem oxygenase 1 (HO-1) and vascular endothelial growth factor (VEGF) were used.
Results:  Expression of NG-2 was robust in C, CT, DT, and mild in D. The intensity of IB-4 was higher in D and DT compared with the C and CT. Ox-42 and ED-1 expression was higher in the D than in the DT, C or CT. Expression of VEGF and HO-1 was non-specific across the four groups. Plasma levels of 15-F-2t-IsoP and TNF-α were higher in the D as compared with the C, CT and DT. SOD levels were lower in the D when compared with the C, CT and D.
Conclusions:  Macrophage/microglia activation, pericyte loss and endothelial/perivascular cell changes occur early in the pathogenesis of DR. These changes are associated with an increase in plasma markers of oxidative stress and inflammation and are minimized by treatment with NAC. The results suggest that therapies that reduce free radicals will help minimize the early events in diabetic retinopathy in the STZ model.     

罗格列酮对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞凋亡的影响

目的　观察过氧化物酶体增生物激活受体-γ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ-ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ-γ,ＰＰＡＲ-γ）激动剂罗格列酮对链脲佐菌素诱导的早期糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓ,ＤＭ）大鼠视网膜神经节细胞（ｒｅｔｉｎａｌｇａｎｇｌｉｏｎｃｅｌｌｓ,ＲＧＣｓ）凋亡的影响,进而从分子学水平上阐明ＰＰＡＲ-γ激动剂对糖尿病视网膜病变（ｄｉａｂｅｔｉｃｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ,ＤＲ）的保护作用,为预防及早期治疗ＤＲ提供一种新思路。方法　选择９０只健康的雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠随机分为三组:正常对照组、ＤＭ＋罗格列酮组和ＤＭ组,进一步将每组大鼠分为给药后４周、８周和１２周三个时间点进行观察。采用一次性腹腔注射５０ｍｇ?ｋｇ－１链脲佐菌素的方法建立ＤＭ大鼠模型。自ＤＭ模型成模后第３天起,ＤＭ＋罗格列酮组大鼠每天给予罗格列酮３ｍｇ?ｋｇ－１灌胃,正常对照组和ＤＭ组每天给予等体积的生理盐水灌胃。于给药后４周、８周和１２周处死各组大鼠,处死前测各组大鼠的血糖和体质量,然后摘除左眼球制成眼杯,采用ＴＵＮＥＬ法测定各组大鼠视网膜上ＲＧＣｓ的凋亡指数,并作对比。结果　给药后４周、８周和１２周,ＤＭ组和ＤＭ＋罗格列酮组大鼠血糖水平均明显高于正常对照组（均为Ｐ＜０．０１）;ＤＭ组和ＤＭ＋罗格列酮组大鼠的体质量均较正常对照组降低（均为Ｐ＜０．０５）。正常对照组大鼠ＲＧＣ层上仅见少量的凋亡细胞;各时间点ＤＭ＋罗格列酮组大鼠ＲＧＣｓ的凋亡指数较ＤＭ组明显降低（均为Ｐ＜０．０１）;ＤＭ组和ＤＭ＋罗格列酮组大鼠ＲＧＣｓ的凋亡指数均明显高于正常对照组（均为Ｐ＜０．０１）。结论　外源性ＰＰＡＲ-γ激动剂罗格列酮能够抑制ＤＭ大鼠视网膜上ＲＧＣｓ的凋亡,对早期ＤＭ大鼠视网膜具有保护作用,有望成为ＤＲ新的治疗手段。