人转化生长因子β1重组腺病毒转染传代髓核细胞对细胞外基质合成的影响

目的探讨人转化生长因子融（transforming growthfactorβ，TGF-β1）对传代羊髓核细胞的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）和DNA合成调节因子的作用。方法取1岁龄成年山羊腰椎间盘，体外分离培养羊髓核细胞，传至第3代后以携人TGF-β1（humanTGF-β1，hTGF-β1）或lacZ基因的复制缺陷型腺病毒（Ad／hTGF—β1及Ad／lacZ）感染，分别为实验组和阴性对照组；未加病毒液的细胞为空白对照组；原代髓核细胞为原代组。然后继续单层或藻酸钙凝胶三维（3-D）培养10d。对两种系统培养的细胞分别行DNA荧光定量、Westernblot分析和蛋白多糖（glycosaminoglycan，GAG）定量检测。结果DNA荧光定量显示，单层培养时实验组细胞的DNA合成显著高于两对照组（P〈0．05），藻酸钙凝胶3-D培养各组间比较差异无统计学意义（P〉0．05）。Western blot检测hTGF—β1、Ⅱ型胶原、Ⅰ型胶原和Aggrecan的表达显示，两种培养系统中，实验组hTGF—β1、Ⅱ型胶原和Aggrecan的表达均显著高于两对照组（P〈0．05），Ⅰ型胶原的表达显著低于两对照组（P〈0．05），实验组Ⅱ型胶原／Ⅰ型胶原比值较两对照组显著增高（P〈0．05）。GAG定量结果显示，两种培养系统中实验组细胞的GAG合成均显著高于两对照组（P〈0．05）。结论hTGF-β1在很大程度上可起到维持髓核细胞表型，并在细胞传代后仍发挥表型的调节作用。通过基因工程方法使髓核细胞表达hTGF—β1，有望遏制、甚至逆转椎间盘退变；而以Ad／hTGF—β1感染过的髓核细胞，在藻酸钙凝胶3-D培养系统中培养则表现出原始表型。     

兔髓核细胞体外培养和重组人转化生长因子-β1对其代谢影响的研究

目的：探讨体外单层和立体培养兔髓核细胞时的变化及重组人转化生长因子-β1（rhTGF-β1，10ng／ml）对其代谢的影响。方法：体外培养兔髓核细胞，分为3组。A组，单层培养组；B组，Ⅱ型胶原支架立体培养组；C组，Ⅱ型胶原支架立体培养＋rhTGF-β1（10ng／m1）组。利用倒置显微镜、扫描电镜、RT-PCR、^3H-proline掺入法观察髓核细胞形态学、基因表达水平和总胶原合成的变化。结果：B、C组兔髓核细胞由A组的多角形转为类圆形；与A组相比，B组Ⅱ型胶原、集聚蛋白多糖基因表达水平升高（P〈0．05），总胶原合成升高（P〈0．01）。与B组相比，C组Ⅱ型胶原、集聚蛋白多糖、核心蛋白多糖基因表达水平增高（P〈0．01、P〈0．01、P〈0．05），总胶原合成升高（P〈0．01）。结论：兔髓核细胞由单层培养转到Ⅱ型胶原支架上培养时其基因表达和总胶原合成增强。rhTGF-β1（10ng／ml）增强立体培养的兔髓核细胞基因表达和总胶原合成。     

转化生长因子-β1和胰岛素样生长因子-1对人髓核细胞体外增殖活性的影响

目的：研究转化生长因子-β1（TGF—β1）和胰岛素样生长因子-1（IGF—1）单独及联合应用对人髓核细胞体外增殖活性的影响，并观察其量效和时效关系。方法：体外分离培养人髓核细胞．将传2代细胞种于96孔板，采用噻唑蓝（MTT）比色法，观察TGF—β1和IGF—1在1％和10％血清浓度下对人髓核细胞体外增殖的调节作用及其剂量、时间与作用效果的关系。结果：在1％血清条件下，IGF—1的作用不显著，TGF—B1具有促增殖作用。在10％血清条件下，TGF—B1和IGF—1均能提高细胞的增殖活性，并且在有效浓度范围内呈剂量效应关系，TGF—B1的作用强于IGF—1。二者联合应用效果更显著。结论：TGF—B1和IGF—1均能不同程度地促进入髓核细胞的体外增殖，其效应在一定范围内与剂量和时间呈正相关．联合应用促进增殖作用更显著。     

冲击波干预成人骨髓间充质干细胞后IGF-Ⅰ和TGF-β1的表达及意义

[目的]在体外成功分离培养骨髓间充质干细胞（hMSCs）和测得理想冲击波（ESW）干预能量的基础上，观察体外冲击波干预后成骨活性因子IGF-Ⅰ和TGF-β1表达，探讨其促进成骨作用。[方法]将5kV、100频次的体外冲击波作用于第1代骨髓间充质干细胞，采用免疫细胞化学法隔代观察（P1—P11）胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF—Ⅰ）和转化生长因子-β1（TGF—β1）的表达，计数阳性率；并进行统计学分析，设定P〈0．05为有统计学差异。[结果]ESW干预后的第3代细胞IGF-Ⅰ染色，胞浆及胞核中出现大量黄色一棕黄色颗粒，对照组无明显着色；第7代干预组IGF—Ⅰ呈强阳性（87．9％）；TGF-β1出现较晚，第9代细胞TGF—β1阳性率为72．2％，随后开始下降；与对照组差异显著（P〈0．01）。[结论]ESW干预能够提高hMSCs增殖活性，IGF—Ⅰ和TGF—β1等的不同时期和不同程度表达是体外冲击波促进hMSCs成骨活动的适时信号和有力证据。     

退变腰椎间盘细胞经体外转基因培养生物学活性的实验研究

目的构建转化生长因子（transforming growth factor,TGF-β3的真核表达载体pEGFP-TGF-β3转染椎间盘髓核细胞,研究转基因TGF-β3对退变髓核细胞生物学特性的影响。方法通过手术方法制作椎间盘突变模型,从而获取原代退变椎间盘髓核细胞,通过脂质体将真核载体pEGFP-TGF-β3导入髓核细胞,然后对细胞的形态和增殖活性（MTT法）进行观察,应用Westen Blot检测TGF-β3在髓核细胞的表达含量,应用免疫细胞化学方法检测转染后髓核细胞的Ⅱ型胶原的表达。结果髓核细胞转染后,细胞活性增强,TGF-β3表达增加,并随着时间的延长而增加。Ⅱ型胶原表达增加。结论TGF-β3转染退变髓核细胞可起到维持髓核细胞表型,并在细胞传代后仍发挥调节作用。TGF-β3确实具有促进髓核细胞增殖和Ⅱ型胶原合成的能力,从而有可能延缓甚至逆转椎间盘退变。     

转化生长因子β1诱导永生化人前软骨干细胞向髓核样细胞分化的实验研究

  目的 研究转化生长因子β1 (TGF-β1) 诱导永生化人前软骨干细胞 (IPSCs) 向髓核样细胞分化的可行性。方法 将体外培养的IPSCs 接种于温敏型壳聚糖水凝胶 (C/GP) 三维支架上,加入含TGF-β1的诱导培养基,低氧条件下进行诱导培养,观察三维支架上IPSCs的生长及分化情况。7 d后行Alcian Blue染色,分析细胞外基质糖胺聚糖（GAG）合成情况,并收集细胞,提取RNA。RT-PCR检测诱导前后髓核样细胞标志基因Ⅱ型胶原（Collagen Ⅱ）和蛋白聚糖（Aggrecan）的表达情况,Western Blot 检测诱导前后细胞内β-catenin蛋白表达水平的变化。结果 IPSCs在三维支架上生长状态良好,诱导7 d 后,Alcian Blue染色表明,细胞外基质GAG的合成明显增多,实验组（诱导培养基）明显多于对照组（普通培养基）。RT-PCR证实Ⅱ型胶原和Aggrecan的基因表达水平明显增高,实验组明显高于对照组;Western Blot证实细胞内β-catenin蛋白表达水平明显上调,实验组明显高于对照组。结论 IPSCs经TGF-β1诱导可在体外定向分化为髓核样细胞,诱导分化后的细胞具有良好的分泌功能,能够有效地分泌细胞外基质成分。TGF-β1可能通过上调细胞内β-catenin的表达诱导IPSCs向髓核样细胞分化。     

腺相关病毒载体介导hTGFβ1、β3体外转染退变腰椎间盘细胞的生物学效应

目的比较研究腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）载体介导人转化生长因子β1（human transforming growth factor β1,hTGFβ1）与hTGFβ3逆转兔腰椎间盘细胞退变的生物学效应.方法分离、培养兔腰椎间盘髓核细胞和纤维环细胞,并传代建立退变早、晚期细胞模型.采用荧光标记的pSNⅡ型腺相关病毒（pSNAV2）,分别检测其对不同退变程度兔腰椎间盘细胞的转染效率,并在此基础上应用pSNAV2-hTGFβ1和pSNAV2-hTGFβ3转染不同退变程度的兔腰椎间盘细胞.通过细胞形态、胶原的免疫组织化学染色和35S标记蛋白多糖等方法,检测比较pSNAV2-hTGFβ1和pSNAV2-hTGFβ3对于退变早、晚期兔腰椎间盘细胞基质合成的影响.结果pSNAV2可高效转染退变早期兔腰椎间盘髓核细胞和纤维环细胞,而对于退变晚期兔腰椎间盘细胞的转染效率低.hTGFβ1和hTGFβ3可显著促进退变早期兔腰椎间盘细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成,其中hTGFβ1的作用较hTGFβ3强.hTGFβ1可促进退变早、晚期兔腰椎间盘纤维环细胞Ⅰ型胶原的合成.hTGFβ3可促进退变晚期兔腰椎间盘髓核细胞Ⅱ型胶原的合成.结论pSNAV2-hTGFβ1和pSNAV2-hTGFβ3可促进退变早期兔腰椎间盘髓核细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成以及纤维环细胞Ⅰ型胶原的合成,从而延缓和逆转椎间盘退变.对于退变晚期兔腰椎间盘髓核细胞,hTGFβ3可促进Ⅱ型胶原的合成.     

反分化早、晚期髓核细胞的建立及AV-TGFβ1对其蛋白多糖的影响

目的建立反分化早、晚期兔腰椎间盘髓核细胞模型,并比较腺病毒（AV）介导TGFβ1对其蛋白多糖合成的生物学作用。方法选用一月龄纯种新西兰兔3只。无菌分离髓核组织,并用0．125％的胰蛋白0．25％的Ⅰ型胶原消化分离细胞。通过反复消化传代的方法建立反分化早、晚期髓核细胞模型并通过细胞形态的观察和Ⅱ型胶原表达水平的的检测对其鉴定。采用Antonopulos法检测AV—TGFβ1转染后反分化早、晚期髓核细胞蛋白多糖的含量。结果原代培养细胞呈多欠形或圆形,反分化早期细胞呈梭形,反分化晚期细胞类似于成纤维细胞。伴随着细胞形态的改变,Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达亦逐渐降低。AV—TGFβ1可促进反分化早期髓核细胞蛋白多糖的合成。而对于反分化晚期髓核细胞,AV-TGFβ1则抑制其蛋白多糖的合成。结论体外传代培养的方法可用于建立反分化早、晚期髓核细胞模型。AV-TGFβ1仅可促进反分化早、期髓核细胞蛋白多糖的合成。     

低频微动后转化生长因子β1与胰岛素样生长因子Ⅰ在新骨组织中的表达研究

目的 研究转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF—β1）与胰岛素样生长因子Ⅰ（insulinlike growth factor Ⅰ，IGF—Ⅰ）在低频微动引起骨折间接愈合过程中的表达与意义。方法 山东雌性高腿绵羊15只，行双侧胫骨中段横形截骨，形成2mm骨缺损，用带有微动装置的单边外固定支架固定。术后10d，随机选择一侧肢体为微动组，以频率1Hz，幅度0．25mm（30min／d）微动，4周结束；另一侧后肢不微动，为对照组。术后3、4和6周分别处死5只动物，应用免疫组织化学与RT—PCR检测骨痂组织中TGF—β1与IGF—Ⅰ的表达。结果免疫组织化学：术后3周，微动组TGF—β1在骨痂边缘的新生软骨细胞各区均有阳性表达，以增殖区最为显著；IGF—Ⅰ主要表达于软骨内骨化带边缘的成骨细胞，钙化并转化为新骨的软骨细胞与骨细胞中。对照组的相应区域，TGF—β1有少量表达，IGF—Ⅰ几乎无表达。4周，微动组新骨组织逐渐成熟，TGF—β1表达强度减弱，阳性信号主要位于细胞外基质与骨化带周围成骨细胞中；IGF—I的表达趋于高峰，主要集中在新骨表面的成骨细胞、趋于成熟的骨细胞及趋于钙化的类骨质。对照组TGF—β1与IGF—Ⅰ仅有少量表达。6周，微动组TGF—β1的表达显著衰退，IGF—Ⅰ仍有适量表达，主要在新生骨小梁骨细胞中。对照组TGF—β1与IGF—Ⅰ仅有微量表达。微动组术后3、4周TGF—β1，3、4、6周IGF—Ⅰ吸光度（A）值与对照组相比，差异有统计学意义（P〈0．05）。RT—PCR电泳示：术后3、4周，微动组骨痂中TGF—β1与IGF—Ⅰ的mRNA有较高的表达量；对照组骨痂中TGF—β1、IGF—Ⅰ的mRNA有轻度表达。术后6周，微动组TGF—β1、IGF—Ⅰ的mRNA表达量显著降低，但仍略高于对照组。微动组术后3、4周TGF—β1，3、4、6周IGF—Ⅰ A值与对照组相比，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论低频微动在骨折愈合早期，可以促进TGF—β1与IGF—Ⅰ的表达。它们协同调节软骨内骨化的进程；后期主要由IGF—Ⅰ调节骨细胞的分化与类骨质的矿化，其可能更多的参与调节微动各个时期的细胞生物行为。     

转化生长因子-β1对肌腱腱鞘、腱外膜和腱内膜细胞增殖和胶原产生的影响

目的 探讨兔屈趾肌腱腱鞘、腱外膜和腱内膜细胞增殖、胶原产生和转化生长因子（TGF）-β1对细胞的增殖和胶原产生的影响。方法 从兔屈趾肌腱分离腱鞘、腱外膜和腱内膜细胞并培养，在使用TGF-β1培养后，细胞的数量和胶原产生量被测量，并与不使用TGF-β1培养的对照组比较。另外，通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）测定使用TGF-β1前后各种细胞Ⅰ型胶原基因的表达。结果 所有3种细胞均可以产生Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原组织，TGF-β1使培养的细胞数量降低，但能显著性地增加Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原组织产生和Ⅰ型胶原基因的表达（P〈0．05）。结论 调节TGF-β1的水平能调节胶原组织的产生，可能为临床上防止肌腱粘连提供新的途径。     

pcDNA3+转化生长因子-β1单独转染及其与pAT153+胰岛素样生长因子-1共转染兔软骨细胞的研究

目的 探讨重组大鼠转化生长因子-β1基因（pcDNA3＋TGF-β1）单独转染及其与重组大鼠胰岛素样生长因子-1基因（pAT153＋IGF-1）共转染兔软骨细胞后细胞增殖及所分泌的TGF-β1因子、IGF-1因子、Ⅱ型胶原的变化。方法 兔软骨细胞体外分别用pcDNA3＋TGF-β1单转染、pcDNA3＋TGF-β1和pAT153＋IGF-1共转染，筛选阳性克隆后，进行原位杂交、免疫组织化学、免疫荧光检测、流式细胞仪检测、^3H．TdR（^3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷）检测。结果 基因转染组与空白组相比，TGF-^31、IGF-1、Ⅱ型胶原的含量均明显提高，空白组、基因单转染组、基因双转染组软骨细胞位于S期的比例分别为5．6％、33．4％、40．1％，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 基因pcDNA3＋TGF-β1、pAT153＋IGF-1转染软骨细胞后，细胞分泌的TGF-Ⅱ1、IGF-1及Ⅱ型胶原显著增多，细胞增殖明显增强，上述基因转染有助于软骨细胞活力的提高；pcDNA3＋TGF-β1和pAT153＋IGF-1双基因共转染软骨细胞后，细胞分裂增生活跃程度及分泌的TGF-β1、IGF-1和Ⅱ型胶原含量高于pcDNA3＋TGF-β1单基因转染，多基因共转染作为将来骨性关节炎基因治疗的方法，其治疗效果可能会优于单基因转染。     

诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的体外研究

目的 探讨转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF—β1）、胰岛素样生长因子1（insulinlike growth factor1，IGF-1）在诱导骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem ceils，MSCs）向软骨细胞分化过程中的相互作用，并研究细胞密度对MSCs向软骨细胞分化的影响。方法 取健康昆明种小白鼠骨髓，用全骨髓贴壁法筛选获得MSCs，体外培养传代。采用特定的诱导培养使MSCs向软骨细胞分化，按培养基内添加生长因子的不同分成3个实验组和对照组。实验组分别为：TGF—β1＋IGF-1联合应用组（TGF—β1 10ng／ml、IGF-1 50ng／m1）；TGF—β1单独应用组（TGF—β1 10ng／m1）；IGF-1单独应用组（IGF-1 50ng／m1）；对照组不添加任何生长因子。TGF—β1＋IGF-1联合应用组于诱导14d和21d，分别进行甲苯胺蓝染色及免疫荧光双染法鉴定；于诱导7、14和21d各组分别提取诱导细胞总RNA，进行RT—PCR扩增，检测TGF—β1、IGF-1对诱导细胞Ⅱ型胶原表达量的影响；比较MSCs在平板培养及细胞团培养时，Ⅱ型胶原表达量的差异。结果TGF—β1＋IGF-1联合应用组诱导培养14d，诱导软骨细胞甲苯胺蓝染色呈阳性，免疫荧光染色可见诱导软骨细胞的细胞外基质含有Ⅱ型胶原。各组基因扩增产物的凝胶电泳可见，TGF—β1＋IGF-1联合应用组和TGF—β1单独应用组Ⅱ型胶原扩增片段呈阳性；IGF-1单独应用组和对照组，未见Ⅱ型胶原扩增条带；凝胶成像系统灰度扫描示Ⅱ型胶原表达量TGF—β1＋IGF-1联合应用组各时间点均比TGF—β1单独应用组明显增加（P〈0．05）。细胞团培养模式下，诱导细胞表达Ⅱ型胶原比平板培养模式更加显著。结论 MSCs向软骨细胞诱导分化时，IGF-1对TGF—β1有明显的促进作用；细胞培养密度提高有利于MSCs成软骨细胞表型。     

TGF-β1干预下体内兔骨髓间充质干细胞对退变椎间盘治疗的实验研究

[目的]评价在TGF-β1干预下的兔间充质干细胞移植到兔退变椎间盘后是否可诱导向髓核细胞分化并增加蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量。[方法]采用体外细胞培养技术，将兔骨髓间充质干细胞白骨髓血中分离、纯化和培养，成功传代、纯化后并在TGF-β1干预下植入兔退变椎间盘的模型中。分别于2、4、6、8周用间苯三酚分光光度法测定蛋白多糖含量的变化；免疫组化法测定Ⅱ型胶原的含量变化。所得数据经SPSS 11．5统计学软件进行统计学处理。[结果]原代培养及传代培养显示兔骨髓间充质干细胞具有活跃的增殖倍增能力，并且8周内蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量的恢复实验组对比模型组增高明显，统计学显示差异有显著性意义。[结论]将TGF-β1干预下的兔间充质干细胞移植到退变椎间盘后可以在一定时间内增加蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量，从而延缓椎间盘退变。     

TGF-β1对UVA照射皮肤成纤维细胞Ⅰ型，Ⅲ型胶原合成和表达的影响

目的：探讨转化生长因子-β1（tansforming gowth factor—beta 1,TGF—β1）对长波紫外线（ultraviolet A,UVA）照射皮肤成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原合成和表达的影响。方法：通过MTT法检测TGF-β1干预后成纤维细胞增殖活性,选择UVA照射剂量为15J／cm^2,联免疫法（ELISA）测定不同剂量即TGF—β1小剂量组（UVA＋TGF—β1 0．1ng／ml）、中剂量组（UVA＋TGF—β1 1ng／ml）、大剂量组（UVA＋TGF—β1 10ng／ml）处理后成纤维细胞清夜中Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量,半定量RT—PCR检测成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达。结果：UVA照射体外培养的皮肤成纤维细胞,导致成纤维细胞增殖活性下降,给予不同剂量TGF-β1干预后,成纤维细胞增殖活性与UVA照射组比较,明显提高;成纤维细胞上清液中Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量增加,成纤维细胞内Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达增强。结论：TGF-β1可提高UVA照射体外培养成纤维细胞增殖活性;增加UVA照射体外培养的皮肤成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量,增强成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达,对皮肤成纤维细胞起保护作用。     

血管内皮生长因子抑制肾小管上皮间充质转化及其与结缔组织生长因子和PI3K-Akt信号通路的关系

目的　探讨血管内皮生长因子（VEGF）对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的肾小管上皮间充质转化（EMT）的作用,及其与结缔组织生长因子（CTGF）、PI3K-Akt信号通路的关系。 方法 （1）将体外培养的HK2细胞分为正常对照组、TGF-β1（5 μg/L,下同）组、VEGF组（100 μg/L,下同）、TGF-β1＋VEGF组。HK2细胞体外培养48 h,用免疫组化双染方法检测肾小管上皮细胞α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和E钙黏蛋白的表达。（2）将体外培养的HK2细胞分为正常对照组、TGF-β1组、VEGF组、TGF-β1＋VEGF组、PI3K-Akt信号通路阻断剂LY294002组（25 μmol/L,下同）、TGF-β1＋LY294002组、VEGF＋LY294002组、TGF-β1＋VEGF＋LY294002组。HK2细胞体外培养48 h,用Western印迹和RT-PCR方法检测α-SMA和CTGF的表达;用ELISA方法检测培养上清中纤连蛋白（FN）和I型胶原（ColⅠ）的表达。 结果 免疫组化结果显示,TGF-β1组α-SMA表达比正常对照组增强,而E钙黏蛋白表达减弱; TGF-β1＋VEGF组α-SMA表达比TGF-β1组显著减弱,而E钙黏蛋白表达增强。 TGF-β1组α-SMA、CTGF蛋白和 mRNA及FN、ColⅠ表达比正常对照组显著增强（均P < 0.05）;TGF-β1＋VEGF组α-SMA、CTGF蛋白和mRNA及FN、ColⅠ表达比TGF-β1组显著减弱（均P < 0.05）;TGF-β1＋VEGF＋LY294002组α-SMA、CTGF蛋白和 mRNA及FN、ColⅠ表达比TGF-β1＋VEGF组显著增强（均P < 0.05）。 结论　VEGF能抑制TGF-β1诱导的体外培养的HK2细胞发生EMT,其机制可能与VEGF下调HK2细胞CTGF表达及减少细胞外FN、ColⅠ合成有关。VEGF的这种作用可能部分通过PI3K-Akt信号转导通路实现,其确切机制有待进一步研究。     

低强度脉冲超声波对体外培养人退变腰椎间盘细胞的作用

目的 探讨低强度脉冲超声波(LIPUS)对体外培养人退变腰椎间盘细胞的作用.方法 体外培养人退变髓核细胞,台盼蓝染色法测定活细胞率.将每份髓核细胞样本分为对照组和LIPUS组.应用LIPUS每天作用20 min,作用后第0、2、4、8天,采用免疫组化法测定Ⅱ型胶原水平,采用酶联免疫吸附法检测聚集蛋白聚糖(aggrecan)水平.结果 体外培养人退变髓核细胞的活细胞率为90%～95%.LIPUS干预后第2、4、8天,LIPUS组Ⅱ型胶原的合成和aggrecan含量均较相应时间点对照组显著增加(P＜0.05).结论 LIPUS能够通过促进人退变髓核细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白多糖防治椎间盘退变.     

CDMP-1逆转人退变椎间盘髓核细胞的实验研究

[目的]通过CDMP-1促进退变髓核细胞外基质合成来逆转椎间盘退变.[方法]分离、培养人退变椎间盘髓核细胞,取第3代髓核细胞,应用CDMP-l分组进行干预实验.A组为对照组,B组和C组为实验组,B组加人100ng/ml CDMP-1,C组加入200ng/rnl CDMP-1.采用光学相差显微镜及透射电镜对对照组和实验组细胞形态和超微结构进行对比观察:XTT-PMS法检测各组髓核细胞12d的生长曲线,研究三组细胞间的生长动力学差异;实时荧光定量PCR检测髓核细胞,7,14,21d Ⅱ型胶原和糖胺多糖的mRNA表达.[结果]光学相差显微镜及透射电镜示:两剂量实验组形态学上没有明显差异,与对照组相比,CDMP-1实验组能较好的维持髓核细胞生物形态学特性,延长退变髓核细胞的衰老;三实验组12d的生长曲线一致,两剂量的CDMP-1没有增加退变髓核细胞的增殖;实时荧光定量PCR示100ng/ml CDMP-1组:Ⅱ型胶原mRNA表达总体均数及3个时间点均高于另外两组任一时间点(P<0.05);糖胺多糖mRNA表达总体均数及14、21d 2个时间点均高于另外两组相应时间点(P<0.05),且Ⅱ型胶原和糖胺多糖mRNA表达量随刺激时间增加而增加.200 ng/ml CDMP-1组:提高了糖胺多糖mRNA表达水平的同时,却降低了Ⅱ型胶原mRNA水平.[结论]100ng/ml的CDMP-l可以延长体外培养人退变髓核细胞的衰老,维持细胞生物形态学特性,提高退变髓核细胞Ⅱ型胶原和糖胺多糖mRNA表达水平,在一定程度逆转了椎间盘髓核细胞退变.     

缬沙坦对高糖环境下系膜细胞GLUT1表达的影响

目的：探讨葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）在糖尿病肾病发生、发展中的作用以及缬沙坦的肾脏保护机制。方法：体外培养大鼠肾小球系膜细胞,设正常对照组、甘露醇组、高糖非处理组及高糖＋缬沙坦组,Westernblot法检测GLUT1蛋白水平,RT-PCR法检测转化生长因子-β1（TGF-β1）mRNA水平,放免法测定细胞上清中Ⅳ型胶原含量。结果：高糖非处理组GLUT1蛋白、TGF-β1mRNA及细胞上清液Ⅳ型胶原含量均高于正常对照组（P〈0.01,P〈0.05）,缬沙坦干预后上述各指标明显降低（P〈0.01）。结论：高糖刺激使肾小球系膜细胞GLUT1蛋白表达增高;高糖状态下,缬沙坦具有不依赖于其调节肾脏血流动力学改变的肾脏保护作用,该作用可能与其抑制系膜细胞GLUT1过表达,减少TGF-β1与Ⅳ型胶原合成有关。     

β1转化生长因子浓度对体外诱导骨髓间充质细胞构建软骨的影响

目的 探讨β1转化生长因子（TGF-β1）浓度对体外诱导猪骨髓间充质细胞（BMSCs）构建组织工程化软骨的影响，明确TGF-β1诱导剂量对细胞分化的作用，为体外软骨构建提供适宜的诱导因子应用浓度参数。方法 抽取8周龄猪髂嵴骨髓，应用贴壁法分选单个核细胞，体外培养扩增后获得BMSCs，收集第2代细胞，以5×10^7个／cm。细胞的密度接种到聚羟基乙酸（PGA）制成的圆柱形三维支架材料上（直径5mm，厚度2mm），7d后应用不同浓度TGFβ1（A组：5ng／ml、B组：10ng／ml、C组：20ng／ml、D组：50ng／m1）与IGF-1（50ng／m1）及地塞米松（40ng／m1）组成诱导剂，分别进行体外诱导培养。8周后取材行大体观察，体积、湿重及聚合蛋白多糖（GAG）定量，组织学及Ⅱ型胶原免疫组织化学等检测。结果 B、C、D组形成细胞材料复合物组织学结构较为类似，有明显的软骨陷窝，分布有大量Ⅱ型胶原及GAG；A组软骨陷窝结构较少，胞外基质染色较浅。B、C、D组的组织湿重、体积和GAG含量均明显高于A组。结论 诱导三维支架上的BMSCs体外构建组织工程化软骨过程中，10ng／ml的TGF-β1诱导浓度具有良好的促分化效能，TGF-1的促分化作用并未表现出明显的剂量依赖性。     

Ⅱ型胶原、转化生长因子β1和碱性成纤维细胞生长因子在脊柱侧凸患者关节突软骨中分布及表达的实验研究

目的研究青少年特发性脊柱侧凸（AIS）和先天性脊柱侧凸（CS）畸形最严重部位一顶椎凸、凹侧下关节突软骨中Ⅱ型胶原、转化生长因子β1（TGF—β1）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的表达特点。方法22例AIS患者,18例CS患者作为研究对象。取两组患者的顶椎和端椎凸、凹侧的下关节突,采用苏木素-伊红（HE）染色、免疫组化和原位杂交方法观察关节突的病理改变和Ⅱ型胶原、TGF-β1及bFGF在关节突中分布的特点。将所得的免疫组化和原位杂交图像输入图像分析系统,进行半定量分析,并作统计学分析。结果Ⅱ型胶原、TGF-β1、bFGF在AIS和CS中的有基本相似的表达特点,免疫组化和原位杂交方法均显示顶椎凹侧的表达高于凸侧,差异有统计学意义（P〈0．05）;上下端椎的凸凹侧之间及凸凹侧的上下端椎之间的表达差异无统计学意义,顶椎、上下端椎各对应部位在AIS与CS之间的表达差异无统计学意义;Ⅱ型胶原在凸侧与凹侧顶椎的表达高于同侧上、下端椎,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论AIS和CS顶椎关节突软骨呈现退变及发育不全等征象,凹侧较凸侧明显。AIS和CS中Ⅱ型胶原、TGF—β1及bFGF在顶椎凹侧表达的增高可能为脊柱畸形后异常的生物力学引起了关节突细胞间基质重建而进行代偿的结果。压应力可引起TGF—β1及bFGF的表达增高;压应力和张应力均可以引起Ⅱ型胶原的表达增高,但顶椎凹侧压应力比凸侧张应力的影响更大。