不同重组病毒载体转染大鼠骨间充质干细胞的效率及其基因表达

背景:利用基因工程细胞进行替代治疗和基因治疗中合适的供体细胞、靶细胞以及相应载体是细胞和基因治疗最为困难的部分.目的:检测重组腺病毒Ad5和Ad5F35、腺相关病毒rAAV1/2和rAAV2、慢病毒LV对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率和外源基因表达水平,拟筛选能够高效转导骨髓间充质干细胞的载体.设计、时间及地点:细胞基因工程对照观察,于2006-10/2007-03在上海市第一人民医院中心实验室完成.材料:清洁级SD大鼠10只用于制备骨髓间充质干细胞.所有重组病毒均携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因,AdS由本实验室制备,Ad5F35由解放军第二军医大学钱其军教授惠赠,rAAV2及rAAV1/2为本元正阳基因技术有限公司产品,LV由中科院上海生化与细胞生物学研究所郭礼和教授惠赠.方法:采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,传至第4代用于实验.按1×105/孔接种于24孔细胞培养板中,1 d后细胞贴壁,设立5组:第1组向细胞培养液中加入10,100,1 000 MOI Ad5-EGFP,第2组加入10,100,1 000 MOIAdSF35-EGFP,第3组加入1×104,1×105vg rAAV1/2-EGFP,第4组加入1×104,1×105vg rAAV2-EGFP,第5组加入30 TU LV-EGFP.Ad病毒感染2d,rAAV及LV病毒感染6d.主要观察指标:EGFP阳性表达及荧光强度.结果:Ad3-EGFP感染24 h后镜下可见EGFP阳性细胞,随着病毒用量的增加EGFP阳性细胞数目增多,荧光亮度增强,12d后阳性细胞开始逐渐减少,荧光亮度减弱.AdSF35-EGFP感染情况与Ad5-EGFP基本相似,但EGFP阳性细胞数和荧光亮度均增加.rAAV1/2-EGFP或rAAV2-EGFP感染6 d后,EGFP阳性细胞数和荧光亮度均较弱.LV-EGFP感染第2天即可见少量EGFP阳性细胞,随着时间延长EGFP阳性细胞数目逐渐增多,至第6天表达EGFP荧光的细胞数量及亮度不再有明显变化.结论:腺病毒Ad5、AdSF35与慢病毒LV能够有效感染体外培养的骨髓间充质干细胞,并表达外源基因,感染效率与病毒用量之间存在量效关系.腺相关病毒rAAV1/2和rAAV2体外感染效果不佳.     

Ad5-增强型绿色荧光蛋白和rAAV2-增强型绿色荧光蛋白转染脂肪间充质干细胞的对比

背景:利用基因转染技术诱导脂肪间充质干细胞成软骨细胞已有报道,但腺病毒和腺相关病毒转染脂肪间充质干细胞各有不同,且腺相关病毒载体能否转染脂肪间充质干细胞众说不一.目的:观察Ad5-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和Raav2-EGFP转染脂肪间充质干细胞后增强型绿色荧光蛋白的表达及转染后细胞增值能力的变化.方法:脂肪组织来源于6月龄新西兰大白兔颈背部.机械消化和酶消化法分取脂肪间充质干细胞,体外培养扩增.分别采用腺病毒载体(Ad5-EGFP)和腺相关病毒载体(Raav2-EGFP)转染脂肪间充质干细胞,并观察EGFP的表达.Raav2-EGFP转染后,需加入2 Μl丁酸钠(1 mol/L).采用MTT法检测基因转染对脂肪间充质干细胞增殖能力的影响.结果与结论:体外培养的脂肪间充质干细胞呈扁平状和长梭形,细胞形态均一,传代稳定.Ad5-EGFP组和Raav2-EGFP组均能观察到较多荧光细胞,转染效率分别达到88%和83%.腺病毒和腺相关病毒载体均能转染脂肪间充质干细胞,且转染效率很高.腺相关病毒需要借助丁酸钠来提高其基因表达水平.     

寻找基因转染人脂肪来源的成体干细胞合适载体：脂质体介导质粒pEGFP-N1、重组腺病毒Ad5-EGFP与重组腺相关病毒rAAV-2／1-EGFP

目的:观察脂质体介导质粒pEGFP-N1、重组腺病毒Ad5-EGFP、重组腺相关病毒rAAV-2/1-EGFP基因转染人脂肪来源成体干细胞后增强型绿色荧光蛋白的表达及细胞毒性,探讨适用于脂肪来源的成体干细胞的转基因方法。方法:实验于2006-01/07在国家人类基因组北方中心和北京大学第三医院完成。全髋关节置换术患者的皮下脂肪由北京大学第三医院骨科提供,均征得患者及其家属同意。pEGFP-N1(Clotech公司),Ad5-EGFP,rAAV-2/1-EGFP(本元正阳公司)。②自成人皮下取少量脂肪组织,经机械剪切及Ⅰ型胶原酶消化后获取脂肪来源的成体干细胞,体外培养扩增。③采用脂质体介导质粒pEGFP-N1、重组腺病毒Ad5-EGFP、重组腺相关病毒rAAV-2/1-EGFP3种转染方法,观察增强型绿色荧光蛋白的表达及对细胞毒性的影响。④细胞转染后24h,将5×104细胞悬液接种于24孔板中,每周换液3次,绘制细胞生长曲线。以正常未转染细胞作为正常对照。观察不同转染方法对细胞增殖的影响。结果:①不同转染方法的感染效率比较:pEGFP-N1脂质体转染后细胞毒性较大,且感染效率低,仅为10.5%。重组腺病毒Ad5-EGFP转染率高,当感染复数为5×102时,感染效率达82.5%;当感染复数低于1×103时,对细胞无明显损害。重组腺相关病毒rAAV-2/1-EGFP转染法不能有效感染人脂肪来源的成体干细胞。②不同转染方法对细胞增殖的影响:重组腺病毒Ad5-EGFP转染和重组腺相关病毒AAV-2/1-EGFP转染人脂肪来源的成体干细胞后,对细胞增殖能力无明显影响,基本同正常对照细胞(P>0.05)。而pEGFP-N1脂质体转染后细胞增殖能力较正常对照明显下降,转染后3～10d差异有显著性意义(P<0.05)。结论:重组腺病毒Ad5-EGFP可作为一种高效的脂肪来源成体干细胞的示踪工具,提示5型复制缺陷型腺病毒是其合适的转基因载体。     

LIF和bFGF对脐带间充质干细胞体外自我维持和更新的影响

目的:研究LIF联合bFGF对人脐带间充质干细胞hUC-MSC增殖、干性维持及衰老的影响。方法:实验分为4组:对照组加入完全培养基(含10%FBS的α-MEM)常规培养;LIF组,加入含10 ng/ml LIF的完全培养液;bFGF组,加入含10 ng/ml bFGF的完全培养液;联合组,加入含10 ng/ml LIF和10 ng/ml bFGF的完全培养液。采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)测定各组第4代hUC-MSC生长曲线;在倒置相差显微镜下观察各组hUC-MSC形态变化;β-半乳糖苷酶染色检测各组细胞衰老情况;RT-PCR检测表达情况。结果:4组细胞生长曲线均近似S形,细胞增殖速率表现为联合组bFGF组LIF组对照组。对照组细胞较早出现衰老,增殖减慢;LIF组细胞早期形态维持较好,但增殖相对缓慢,后期大部分细胞衰老;bFGF组部分细胞呈衰老改变,但增殖较快;联合组细胞增殖迅速,能长期维持hUC-MSC形态特征,仅有少量衰老细胞。RT-PC R显示,LIF和bFGF均能上调PCNA、OCT4、NANOG,下调P16、P21、P53的表达,其联合作用效果更明显。结论LIF联合bFGF不仅可以促进hUC-MSC增殖,维持其干性而且能够延缓hUC-MSC的衰老。     

不同浓度透明质酸对骨髓来源间充质干细胞成软骨分化的影响

目的探讨不同浓度透明质酸(HA)对骨髓来源间充质干细胞(MSCs)向软骨方向定向分化的影响。方法 取P3代未诱导的骨髓来源间充质干细胞,按培养液中添加的HA浓度不同分为两实验组,A组:低浓度组(基础培养基+HA0.1mg/ml);B组:高浓度组(基础培养基+HA0.2mg/ml)。同时设立空白对照组(基础培养基)及阳性对照组(基础培养基+10ng/mlTGF-β3),观察细胞形态、增殖情况并绘制生长曲线,分别于诱导后第7、14、21天行免疫组化染色及RT-PCR检测细胞Ⅱ型胶原表达。结果 经添加软骨诱导剂后,干细胞的细胞增殖速度放缓,形态由长梭形变为多角形、椭圆形,胞质Ⅱ型胶原免疫组化阳性,RT-PCR检测示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性,表现出软骨细胞的分化特点,半定量分析显示两实验组Ⅱ型胶原表达无差异,但均比阳性对照组弱,空白对照组无Ⅱ型胶原表达。结论 不同浓度外源性HA诱导兔MSCs向软骨细胞分化的能力无差异,且均比TGF-β3的诱导能力弱。提示HA作为细胞外基质的主要成分,有促进MSCs向软骨细胞分化的作用,但改变外环境中HA浓度不会影响MSCs的软骨分化。自体关节腔内环境支持以干细胞为基础的组织工程...     

重组人红细胞生成素促进体外培养的人骨髓间充质干细胞增殖

为了观察重组人红细胞生成素（rhEPO）对人骨髓间充质干细胞（MSCs）增殖活性的影响，抽取健康志愿者的骨髓液，贴壁培养获取第3代细胞，通过细胞形态特征、细胞表面抗原及诱导分化的方法进行MSCs鉴定；取经过鉴定的第3代MSC（P3-MSC）加入不同浓度rhEPO（0．5、1、5、10、50U／ml）后培养，应用细胞计数法及MTT法检测细胞增殖，用流式细胞术（FCM）分析细胞周期。结果发现：骨髓贴壁培养获取的第3代细胞同时表达CD105和CD90，不表达CD34和CD45，并可被诱导分化为脂肪、骨及软骨细胞，被鉴定为MSC。MTT结果显示EPO处理组的光密度值（OD）均高于对照组（P〈0．05）；50U／ml浓度EPO组作用最显著，细胞计数法获得的结果与其一致。FCM细胞周期分析表明，rhEPO能明显降低G0／G1期细胞比例，并提高S＋G2／M期细胞比例，与对照组相比，差异均具有显著统计学意义（P〈0．01）。结论：EPO能促进体外培养的人骨髓MSCs增殖，该效应与EPO调节其进入细胞增殖周期有关。     

小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定

目的探讨分离、培养、纯化和鉴定小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)方法,观察MSCs体外生长特征。方法取小鼠胫骨和股骨,取出骨髓细胞,用1.073g/ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过传代对MSCs进行纯化和扩增培养。进行形态学观察,测定生长曲线,用流式细胞仪检测P3代MSCs细胞周期及表面抗原。结果 新分离的MSCs呈小圆形,形态规整。培养传代后,细胞大小均匀,形态较一致,多为梭形。P1、P2、P3代MSCs生长曲线均呈S型。P3代MSCs 75.27%的细胞处于G0-G1期。P3代MSCs CD44表达阳性,表达率为88.71%,CD34表达阴性。结论利用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离纯化骨髓MSCs,在含15%FBS的DMEM-LG培养基中培养MSCs,可获得稳定生长的昆明小鼠MSCs。培养的MSCs细胞系性状稳定,表型稳定均一,适于做进一步研究。     

辛伐他汀诱导促进骨形成蛋白-7基因修饰的兔间充质干细胞的成骨转化

目的:研究辛伐他汀诱导对骨形成蛋白-7(BMP-7)基因修饰的间充质干细胞(MSCs)增殖和分化表型的影响。方法:将辛伐他汀诱导和未经诱导的兔MSCs分别转导BMP-7基因后,Westernblotting检测转导后细胞BMP-7的表达;通过观察细胞生长以及碱性磷酸酶活性和测定骨钙素含量,分析辛伐他汀诱导对BMP-7基因修饰的MSCs的增殖和分化表型的影响。结果:转导后BMP-7基因在诱导组和未诱导组MSCs中均有表达,诱导组细胞BMP-7表达量、碱性磷酸酶活性和骨钙素含量均比较未诱导组明显增高。结论:转导前辛伐他汀诱导能够促进BMP-7基因修饰的MSCs的成骨转化。     

重组腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染兔骨髓间充质干细胞

背景:目前仍没有合适的标记方法追踪观察兔骨髓间充质干细胞组织修复及基因治疗的效果.目的:观察重组腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因在兔骨髓间充质干细胞中的表达,及转染后干细胞活性的变化,以寻找稳定标记兔骨髓间充质干细胞的方法. 设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/05在南京市第一医院骨科干细胞实验室完成. 材料:健康2月龄纯种新西兰大白兔4只,由南京医科大学实验动物基地提供.重组腺病毒Ad5/F35-EGFP为北京本元正阳基因有限公司产品. 方法:用密度梯度离心法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,贴肇法纯化扩增.取传至第4代细胞,流式细胞仪检测细胞标志的表达,消化离心重悬后进行计数,平均分成5组,每组细胞数5.0×105个,接种于25 m2培养瓶,空白组加入50 μL的PBS液,剩余4组加入重组腺病毒Ad5/F35-EGFP进行转染,感染复数(MOI)分别为10,20,50,100,继续传代培养.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的生长状态及表面标志鉴定,转染后骨髓间充质干细胞增强型绿色荧光蛋白的表达及活性变化.结果:原代培养48 h后见细胞贴壁,8 d时细胞铺满瓶底80%以上,绝大多数呈梭形,传代后细胞增殖速度加快,三四天即可传代,第4代细胞CD29和CD44呈阳性表达,CD34与CD45呈阴性表达.转染后24 h可见绿色荧光,7 d时荧光最强,细胞转染率与感染复数值的呈线性增长关系,至49 d时仍可见绿色荧光.转染后0,7,14,28,49 d,感染复数=50组的骨髓间充质干细胞数量均与空白组基本相似(P均>0.05),即转染后细胞增殖能力无明显变化. 结论:重组腺病毒载体能高效标记骨髓间充质干细胞,感染复数为50时较为理想,增强型绿色荧光蛋白基因可持续表达49 d,且标记后不影响骨髓间充质干细胞的增殖活性.     

骨髓间充质干细胞对制动大鼠骨骼肌细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

目的 观察早期注射骨髓间充质干细胞(BMSCs)对制动大鼠骨骼肌细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。 方法 取幼龄大鼠(80～100g)胫骨和股骨，分离培养大鼠BMSCs。用可塑性石膏制备右下肢管型固定肌萎缩模型，根据随机数字表法将24只大鼠分成假手术组、干细胞组、磷酸缓冲液（PBS）组，干细胞组大鼠下肢制动48h后于比目鱼肌局部多点注射1×106个BMSCs；PBS组大鼠下肢制动48h后注射等量PBS；假手术组大鼠下肢包裹相同重量石膏且不限制关节活动，48h后注射等量PBS，14d后各组大鼠拆除石膏取标本分析。 结果 培养中的大鼠BMSCs以梭形细胞为主，呈放射状排列的细胞集落，细胞生长旺盛，可连续稳定传代10代以上。实验中第4代BMSCs表面标志CD44、CD90均呈阳性表达，阳性率分别为95.84%、96.00%，而CD34、CD45阳性率极低。与假手术组大鼠比目鱼肌中Bax和Bcl-2蛋白表达量［(0.14±0.11）、(0.81±0.06)］比较，干细胞组和PBS组Bax蛋白表达量［(0.41±0.08)、(0.63±0.10)］明显升高，两组Bcl-2蛋白表达量［(0.47±0.14)、(0.22±0.13)］明显降低；干细胞组中Bax蛋白的表达水平较PBS组低，Bcl-2蛋白的表达水平显著增高，差异有明显统计学意义(P<0.05)。 结论 制动大鼠骨骼肌早期注射BMSCs，可引起抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平上调、促凋亡蛋白Bax表达水平下调。     

人脐带源间充质干细胞临床输注前的优化制备

目的 探讨人脐带源间充质干细胞(HUC-MSCs)临床输注前制备成细胞悬液,细胞活性和细胞表面抗原的变化.方法 第3～5代人脐带源间充质干细胞用0.25％胰蛋白酶消化处理,PBS洗涤5次,分别重悬于磷酸盐缓冲液(PBS)或含有50 U/ml肝素-PBS、100 U/ml肝素-PBS、200 U/ml肝素-PBS中,放置于4℃、22C或37℃条件下,分别延长至1h、2h、3h,检测细胞存活率和细胞表面抗原的变化.结果 HUC-MSs收集后重悬于PBS中,在4℃条件下,随着在体外放置时间的延长,细胞的存活率在随之下降,但细胞存活率明显高于放置22℃、37℃条件下的细胞.将细胞收集后重悬于含有肝素的PBS溶液中,细胞既无聚集现象,而且随着肝素浓度的增加,细胞的存活率相对较高,体外短暂保存HUC-MSCs的效果较好.在含200 U/ml肝素的PBS溶液中,4℃条件下细胞放置3h后经苔盼兰染色镜下计数可知,HUC-MSCs存活率可维持在(91.3±3.08)％,而且HUC-MSCs表面仍高表达CD105、CD73、CD44、CD90.结论 临床输注前制备HUC-MSCs重悬于合200 U/ml肝素-PBS中在4℃条件下3h内可供临床有效输注.     

Stable transfection of MSCs by electroporation

Human marrow stromal cells (hMSCs) are an attractive source of adult stem cells for autologous cell and gene therapy. To transfect hMSCs without the use of viruses, we developed improved conditions for stable transfection of the cells by electroporation. hMSCs were isolated by adherence to plastic, and were electroporated at 600 V and 100 micros in a 2-mm gap cuvette with a plasmid containing enhanced green fluorescence protein (EGFP) and neomycin phosphotransferase gene (neo(r)). After electroporation of 10(6) cells with 10 microg of the linearized plasmid DNA, hMSCs with stable DNA integration were selected by culturing with 200 microg/ml G418. The transfected hMSCs were expanded another 300-fold in 14 days to obtain 89 million cells, of which 98% expressed EGFP. Chloroquine increased the number of hMSCs transiently expressing EGFP from 12% to over 50%, but decreased stable integration. Stable integration of plasmid DNA into rat MSCs by electroporation was also successful. The transfected MSCs retained their capacity to differentiate into both adipocytes and osteoblasts. Thus, MSCs were stably transfected with plasmid DNA and retained their differentiation capacity after expansion.     

人脐血间充质干细胞体外扩增和向神经元样细胞定向诱导分化的研究

目的　探讨人脐血间充质干细胞 (mesenchymalstemcells,MSC)的体外分离、纯化、扩增和向神经元样细胞的定向诱导分化条件。方法　无菌条件下采集正常人脐血 ,肝素抗凝 ,用相对密度为1.0 77的淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞 ,进而获得MSC。用MesencultTM 培养基进行纯化和扩增培养。用流式细胞仪检测MSC的表面标志。取扩增 2 ,5 ,8代的MSC分别向神经元样细胞诱导 ,免疫组化和组化法检测神经元样细胞特异性标志和结构。结果　脐血MSC每扩增一代 ,细胞数量增加约 2～ 3倍。 6 .6× 10 5个人脐血原代MSC在体外扩增 10代后获得 9.9× 10 8个细胞 ,扩增约 1.5× 10 3倍。流式细胞仪检测结果显示 ,脐血MSC不表达CD34 、CD1 1a和CD1 1b,强表达CD2 9,弱表达CD71 ,与骨髓MSC表面抗原特性一致。诱导后的细胞平均有 70 %左右呈现典型的神经元样表型 ,免疫组化法检测发现不同代数的MSC诱导后均表达神经丝蛋白 (neurofilament,NF)和神经元特异性烯醇化酶 (neuron specificenolase ,NSE) ;组织化学法检测可看到神经元特有结构尼氏体。结论　脐血MSC在体外有较强的扩增能力 ,能够向非间充质类细胞分化。     

不同剂量TPO对小鼠骨髓MSC增殖的影响

为了探讨不同剂量血小板生成素（TPO）对小鼠骨髓间充质干细胞（MSC）增殖的影响，将20只昆明小鼠（35±5g）随机分为低、中、高3个剂量实验组与对照组：给实验组分别腹腔注射TPO25、50和100μg／kg，而给对照组腹腔注射生理盐水0．1ml／g，每日1次，连用5日：每组分别于最后1次注射后12小时收集小鼠骨髓，计数骨髓有核细胞数（BMNC），以10^6／cm^2接种、培养并计数原代成纤维样细胞集落形成单位（CFU—F），同时对其进行成骨、成脂肪诱导分化，用流式细胞术检测BMNC中CD90^＋、CD105^＋、CD34^＋细胞比例并鉴定CFU—F的表型。结果显示：与对照组相比，实验组所获得的BMNC、CD90^＋、CD105^＋、CD34^＋细胞比例和CFU—F集落数明显增加（P〈0．05）。3个剂量中以50μg/kgTPO组增加最明显，但50μg/kg组的CFU—F集落数与100μg/kgTPO组的CFU—F集落数相比，差异无统计学意义（P〉0．05）。CFU—F样MSC具有成骨、成脂肪分化的能力。结论：TPO促进BMNC数、CD90^＋、CD105^＋细胞数和CFU—F集落数增多，即促进骨髓MSC的增殖，但是TPO促进骨髓MSC增殖的作用不随剂号的增加而增加．     

来源于骨髓、外周血与脐带血的间充质干细胞生物学特性比较

背景:间充质干细胞存在于人体多种组织,目前研究报道所用细胞来源单一,培养方法差异大,得出的结果不一致,不能证明分离、培养出的细胞是相同的细胞,难以比较.目的:课题提出在体外培养条件下可对同一个体来源的骨髓、外周血来源间充质干细胞及不同个体脐带血来源间充质干细胞的生物学特性进行比较的理论假设.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-06/2008-12在解放军海军总医院血液科完成.材料:解放军海军总医院血液科造血干细胞移植供者10例,取同一供者的骨髓、外周血细胞,细胞体积分别为20 mL与2 mL.解放军海军总医院产科10例健康仞产妇脐带血细胞,细胞体积为30 mL.方法:采用Percoll密度梯度+贴壁法分离骨髓、外周血、脐带血来源的间充质干细胞,加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基.当细胞生长汇合至80%～90%时胰蛋白酶-EOTA消化,制成5×10~8 L-1细胞悬液,计为P_0.重复上述操作,即为P_1,依此类推P_2～P_5.主要观察指标:细胞生长形态观察,细胞瑞氏-吉姆萨染色结果,细胞化学染色结果,细胞增殖数量,流式细胞仪检测细胞表面标记.结果:①骨髓间充质干细胞贴壁时间、汇合至50%时间、汇合至80%时间均早于外周血、脐带血间充质干细胞:骨髓间充质干细胞培养5～7 d时呈漩涡状生长,而外周血、脐带血间充质干细胞无此生长特性.②初始培养和传代培养后,骨髓间充质干细胞多为成纤维样细胞,仅有少量内皮样细胞;而传至第5代的外周血、脐带血间充质干细胞除有成纤维样细胞外,还有较多的内皮样细胞和单核-巨噬样细胞.③P1～P5骨髓、外周血及脐带血来源间充质干细胞PAS染色、碱性磷酸酶染色、苏丹黑B染色均里阴性.④与P_0细胞比较,传代培养至P_5后骨髓间充质干细胞增殖数量明显多于外周血、脐带血间充质干细胞(P＜0.05).⑤CD29,CD44,CD90,CD71,CD105,CD166和HLA-ABC阳性率,骨髓间充质干细胞接种后≤6%,P_0～P_5为55.9%～92.8%;外周血间充质干细胞接种后≤10%,P_0～P_5为19.7%～33.4%;脐带血间充质干细胞接种后≤20%,P_0～P_5为35.4%～93.2%.CD34,CD45和HLA-DR阳性率,3种来源的间充质干细胞均极低.CD14,CD31阳性率,骨髓间充质干细胞极低,外周血间充质干细胞为12.1%～28.3%,脐带血间充质干细胞为8.1%～21.3%.结论:结果显示在体外培养条件下,骨髓、外周血和脐带血均能较好地形成间充质干细胞,以骨髓来源的间充质干细胞含量最高,成分单一,而脐带血和外周血含量次之,细胞成分多.     

骨髓间充质干细胞移植对实验性肺气肿大鼠动脉血气及肺组织病理学变化的影响

背景:根据现有肺气肿的发病机制,肺气肿病理改变无法逆转。在多年研究肺减容手术和支气管腔内栓堵治疗肺气肿的基础上,作者提出肺毛细血管的损伤可能参与肺气肿发病的新发病机制。骨髓间充质干细胞具有分化成血管内皮细胞等多向分化潜能,因此,其可能促进肺血管生成并修复肺组织。目的:观察骨髓间充质干细胞移植对肺气肿模型大鼠动脉血气和肺组织病理学变化的影响,探讨骨髓间充质干细胞对肺气肿的治疗作用及肺气肿的发病机制。设计:随机对照的动物实验。单位:山西医科大学第二医院。材料:选用健康6周龄Wistar大鼠30只,体质量180～200g,雌雄不拘。购自山西医科大学生理实验动物中心。按随机数字表法分为骨髓间充质干细胞治疗组、模型组和对照组3组,每组10只。方法:实验于2005-04/2006-04在山西医科大学生理实验室完成。将骨髓间充质干细胞治疗组和模型组大鼠麻醉后气管内注入猪胰弹性蛋白酶250 U/kg制作肺气肿模型,对照组以生理盐水对照,4周后模型制成。将所有大鼠麻醉后取出股骨、胫骨,体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞。免疫细胞化学方法检测CD71的表达以鉴定骨髓间充质干细胞。溴氮胞苷标记骨髓间充质干细胞,经尾静脉注入治疗组大鼠体内,模型组和对照组注入等量PBS溶液。主要观察指标:①各组大鼠动脉血气变化。②取肺组织制作病理切片,观察并计算平均肺泡数、平均肺泡面积和平均肺泡间隔。③免疫组织化学染色测定CD34~ 细胞个数以确定肺泡毛细血管增生情况。结果:纳入的30只Wistar大鼠在造模过程中有3只死亡,另选动物补足,30只进入结果分析。①骨髓间充质干细胞的培养及鉴定:接种3d后,骨髓间充质干细胞基本全部贴壁,贴壁的骨髓间充质干细胞呈梭形。传至第3代,骨髓间充质干细胞表面有CD71的表达。②各组大鼠动脉血气分析比较:pH值,氧分压,二氧化碳分压和氧饱和度组间比较,差异无显著性意义(P>0.05)。③肺组织病理改变观察结果:治疗组病理改变明显轻于模型组。骨髓间充质干细胞治疗组平均肺泡数明显高于模型组,差异有显著性意义(F=80.201,P<0.05),平均肺泡面积和平均内衬间隔小于模型组,差异有显著性意义(F=26.755,26.875,P<0.05)。④肺组织CD34~ 表达比较:骨髓间充质干细胞治疗组和模型组CD34~ 相对阳性面积均小于对照组,差异有显著性意义(F=20.411,P<0.05)。骨髓间充质干细胞治疗组大于模型组,差异有显著性意义(F=20.411.P<0.05)。结论:骨髓间充质干细胞能逆转肺气肿的病理改变;肺毛细血管的减少可能是肺气肿主要的发病机制之一。     

间充质干细胞对活化T淋巴细胞的免疫调节作用

本研究的目的是探讨骨髓间充质干细胞（MSC）对活化T淋巴细胞的免疫调节作用及其在allo—HSCT相关GVHD防治中的作用。用终浓度为10μg/ml的PHA于不同时间作用T淋巴细胞，以^3H—TdR掺入法检测T细胞增殖功能；以不同数量的MSC分别与活化T淋巴细胞作用，根据MSC数量不同实验分为A组（对照组，不加MSC）、B组（MSC2×10^4）、C组（MSC4×10^4）、D组（MSC8×10^4），用^3H—TdR掺入法检测作用前后T细胞功能，FCM检测细胞免疫表型。结果显示，在终浓度为10μg／ml PHA作用下，T淋巴细胞的增殖能力随培养时间的延长而增强，48小时达高峰。FCM检测MSC细胞表型表明：CD44、CD105、CD29、FIK1表达阳性，不表达CD33、CD34、CD45、HLA—DR。随着MSC数量增加，与共培养前相比，T细胞的SI值逐渐降低（P〈0．05），但C组和D组间比较无差异（P〉0．05）。在低数量MSC作用下，CD3^＋CD4^＋表达低于对照组（P〈0．05），CD4^＋CD25^＋、CD4^＋CD152^＋高于对照组（P〈0．05）；C组和D组与对照组相比，CD3^＋CD4^＋表达明显降低（P〈0．01），CD3^＋CD8^＋、CD4^＋CD25^＋、CD4^＋CD152^＋明显增高（P〈0．01）。结论：丝裂原PHA可以使T细胞活化；骨髓MSC在体外可以使活化T细胞功能和细胞免疫表型发生改变，下调CD3^＋CD4^＋的表达，上调CD3^＋CD8^＋、CD4^＋CD25^＋、CD4^＋CD152^＋的表达。     

CD133-2在急性白血病病程中的表达及意义

目的 探讨CD133-2在急性白血病病程中的表达及其临床意义。方法 通过直接免疫荧光流式细胞术对67例不同病程急性白血病(AL)进行CD133-2的检测。结果 AL组CD133-2的阳性率(52.4%)及表达率(23.9%±21.5%)均明显高于对照组(0,2.2%±3.9%); 初治组、完全缓解期(CR)组及复发组CD133-2的阳性率分别为52.4%,0和40.0%,表达率分别为23.9%±21.5%,5.0%±6.0%和28.4%±25.6%,三组间的阳性率及表达率差异有统计学意义(χ2=12.777,F=5.906,P<0.05)。初治组及复发组的CD133-2阳性率及表达率均明显高于CR组。初治患者CD34+组的CD133-2阳性表达率明显高于CD34-组(40.5% vs 7.1%,χ2=8.636,P<0.05),并且CD133-2-/CD34-组的CR率则明显高于CD133-2+/CD34+组(83.3% vs 33.3%,χ2=6.078,P<0.05)。结论 初治AL患者CD133表达与CD34相关; CD133/CD34共同高表达可能是AL的一个不良预后因素; 检测AL患者骨髓中CD133-2的表达可以作为预测复发及监测MRD的指标之一。     

骨髓间充质干细胞移植对烟雾吸入性损伤兔早期肺组织的影响

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对烟雾吸入性损伤兔早期肺组织损伤的影响.方法 采用直接贴壁法体外培养兔MSCs,用流式细胞术鉴定MSCs.将48只兔制备烟雾吸入性损伤模型后按随机数字表法均分成致伤组和MSCs组.MSCs组伤后立即静脉给予含1×107个/ml MSCs的磷酸盐缓冲液(PBS)10 ml;致伤组则给予10 ml PBS.分别于干预后2、6和24 h活杀8只兔,取肺组织行组织病理学观察,同时进行肺损伤评分.结果 流式细胞术检测显示所培养细胞为MSCs.肺大体标本和光镜下均观察到MSCs组肺损伤程度较致伤组明显减轻.虽然MSCs组和致伤组伤后2 h肺损伤评分(分)比较差异无统计学意义(4.0±0.7比4.5±0.6,P＞0.05),但MSCs组伤后6 h和24 h肺损伤评分(分)明显低于致伤组(6 h:6.1±0.9比8.2±0.9,24 h:4.6±0.9比10.4±0.8,均P＜0.01).结论 MSCs移植能明显减轻烟雾吸入性损伤兔肺组织损伤,改善肺损伤评分.

Abstract：

Objective To explore the effect of bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs)engraftment on lung tissue at early stage of smoke inhalation injury in rabbits. Methods MSCs were proliferated by the method of whole marrow culture and identified by flow cytometry. Forty-eight rabbits were randomly divided into smoke inhalation group (S group) and MSCs group (M group) after reproduction of rabbit smoke inhalation injury model. 10 ml of phosphate buffer saline (PBS) containing 1 × 107/ml MSCs was intravenously injected in M group, meanwhile 10 ml PBS was injected intravenously in S group. Eight rabbits were sacrificed at 2, 6 and 24 hours after intervention, and the lung tissue was harvested for morphological and pathological observation, and lung injury score was used to evaluate smoke inhalation injury.Results Cultured cells were confirmed to be MSCs with flow cytometry. Lung injury in rabbits of M group was less serious in morphology and histopathology than that in S group. Though there was no significance in lung injury score between M group and S group at 2 hours after injury (4.0±0.7 vs. 4.5±0.6, P＞0.05),the lung injury scores in M group at 6 hours and 24 hours after injury were significantly lower than those in S group (6 hours: 6.1±0.9 vs. 8.2±0.9, 24 hours: 4. 6±0.9 vs. 10.4±0. 8, both P＜0. 01). Conclusion Intravenous engraftment of MSCs could ameliorate lung injury induced by smoke inhalation, and improve lung injury score significantly.     

骨髓间充质干细胞移植对脊髓损伤大鼠脑源性神经营养因子表达的影响

背景:近年来关于骨髓间充质干细胞移植对脊髓损伤修复方面的研究较多,但目前相关机制尚不清楚.目的:观察间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后脑源性神经营养因子表达的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2003-04/07在中国医科大学神经解剖学实验室完成.材料:选取鼠龄3个月的SD大鼠64只,雌雄不拘,体质量250～300 g,随机抽取4只大鼠用于骨髓间充质干细胞的分离与培养,其余60只用于制备脊髓横断损伤模型.方法:60只大鼠随机抽签法分为3组,细胞移植组(n=24):脊髓损伤后第7天,无菌条件下以微量注射缓慢注入含骨髓间充质干细胞(1×109L-1)的培养液5μL至脊髓损伤区;PBS组(n=24):注入等量(5μL)磷酸盐缓冲液体;空白对照组(n=12):注入生理盐水5μL.主要观察指标:分别于造模后7,14,28 d取材,观察骨髓间充质干细胞的形态变化;免疫组织化学法检测间充质干细胞移植后大鼠脊髓损伤区脑源性神经营养因子的表达.结果:60只SD大鼠均进入结果分析.10代以后细胞增殖能力有所减弱,胞体变得扁平,若加入碱性成纤维细胞生长因子,则可维持其增殖能力和形态.大鼠脑源性神经营养因子在正常大鼠脊髓组织中有一定表达,细胞移植后第7,14,28天,细胞移植组脑源性神经营养因子表达均高于PBS组和空白对照组(P＜0.05);空白对照组与PBS组脑源性神经营养因子表达无明显差异(P＞0.05).结论:骨髓间充质干细胞在移植后通过上调脑源性神经营养因子的表达从而促进轴突的再生,可能是治疗脊髓损伤的重要机制.