反义硫代磷酸酯寡聚核苷酸及其专一性

反义硫代磷酸酯寡聚核苷酸及其专一性１）刘红魏东芝２）（华东理工大学生物化学研究所生物反应器工程国家重点实验室，上海２００２３７）反义核酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）包括反义ＤＮＡ、反义ＲＮＡ和Ｒｉｂｏｚｙｍｅ三种．根据碱基互...     

高效液相色谱法分离和测定卡介苗素中游离核苷酸

目的：应用高效液相色谱法对卡介苗素中游离核苷酸进行分离及含量测定。方法：采用Ｃ１８柱，以甲醇－０．０５ｍｏｌ．Ｌ＾－１硫氢酸甲丁基铵（用氨试液调节ｐＨ为３．９）（２８：７２）为流动相，检测波长２６０ｎｍ。结果：卡介苗素中主要含有一磷胞苷、一磷尿苷、一磷鸟苷、三磷鸟苷及三磷腺苷５咱游离核苷酸，含量在０．３３％￣１．５８％之间，方法平均回收率为９６．７１％￣１０１．３％，相对标准偏差为１．１％￣１．９     

胰岛素-反义c-myb-硫代磷酸寡脱氧核苷酸对大鼠主动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的研究新制剂胰岛素 反义c myb 硫代磷酸寡脱氧核苷酸 (PS ODN)对平滑肌细胞增殖的抑制作用。方法大鼠主动脉平滑肌细胞 (SMC)置DMEM中培养。用 2 0 %胎牛血清刺激SMC快速增殖。胰岛素与反义c myb PS ODN在一定条件下 ,如反应液、pH、温度、离子浓度 ,共孵育形成交联物。通过高效液相色谱定性和纯化该交联物。用3H TdR掺入率反映SMC增殖抑制效率。结果在加 2 0 %FBS的DMEM中生长的SMC胰岛素结合力明显增强。交联物胰岛素 反义c myb PS ODN对SMC增殖的抑制作用比单纯反义c myb PS ODN的抑制作用强 ,抑制效率分别为 4 8.3 %和 2 9.5 %。结论胰岛素受体靶向途径可能为一种治疗再狭窄的有效方法。     

高效液相色谱法测定人红细胞硫鸟嘌呤核苷酸的浓度

目的建立测定人红细胞（RBC）硫鸟嘌呤核苷酸（6 TGNs）浓度的高效液相色谱法。方法RBC首先经70%高氯酸沉淀蛋白，并在酸性条件下100 ℃加热45 min，6 TGNs水解生成6 硫鸟嘌呤（6 TG）后进样分析。Hypersil GOLD C18柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm），检测波长342 nm，柱温35 ℃;流动相为20 mmol•L 1 磷酸二氢钾溶液（pH 3.3） 乙腈（95：5，V/V）;流速：1.0 mL•min 1。结果6 TG在8.09～809.89 pmol•（8×108） 1RBC浓度范围内线性关系良好（r=0.997 8），最低定量浓度为8.09 pmol•（8×108） 1 RBC。日内及日间RSD分别＜7.71%，6.64%，方法回收率为98.07%～108.08%，平均提取回收率＞60%。结论该法操作简便快速、灵敏，专属性强，可应用于患者服用硫唑嘌呤后RBC 6 TGNs浓度的测定。     

高效液相色谱法测定血清头孢唑肟浓度

目的建立高效液相色谱(HPLC)法测定血清头孢唑肟浓度。方法色谱柱为μbondaparC18(7.8mm×300mm,5μm),流动相:甲醇-0.01mol.L-1磷酸二氢钾(20∶80),内标为丙酮,检测波长:254nm,柱温:室温,流速:1.0mL.min-1。结果头孢唑肟的血药浓度在10~20μg.mL-1范围内与峰面积比有良好的线性关系。血清中头孢唑肟在24h内约降解60.0%。结论该方法简单,快速,准确,为头孢唑肟的血清浓度监测提供了分析方法。     

高效液相色谱法测定人血红细胞内硫鸟嘌呤核苷酸浓度

目的:建立以高效液相色谱法测定人血红细胞内硫鸟嘌呤核苷酸浓度的方法。方法:色谱柱为HypersilODS,流动相为甲醇-水(10∶90),检测波长为342nm;硫鸟嘌呤核苷酸经加热水解生成6-硫鸟嘌呤(6-TG),6-TG经提取至0.1mol/L盐酸中进样分析,以外标法定量。结果:6-TG浓度线性范围为30～1200pmol/8×108RBCs,水解时间以1h为宜,提取时pH值以11～12为宜,提取液中醋酸苯汞的量为1.3mmol/L。结论:在优化条件下,本方法测定硫鸟嘌呤核苷酸快速、准确、灵敏度高。     

高效液相色谱法测定普罗帕酮血清浓度

高效液相色谱法测定普罗帕酮血清浓度（上海市第六人民医院临床药学研究室２００２３３）张毅普罗帕酮（Ｐｒｏｐａｆｅｎｏｎｅ）又名心律平，是一种抗心律失常药。对冠心病、高血压所引起的心律失常有较好的疗效［１］。但其服用剂量与血药浓度的关系，有强弱代谢之说［...     

高效液相色谱法测定儿童血清异丙酚浓度

目的：建立儿童血清中异丙酚浓度的HPLC测定法，方法：以蒽酮为内标，采用HypersilODS-C18柱，甲醇：水：β-环糊精（68：32：0.01)为流动相，紫外检测波长为270nm，流速为0.8ml/min。结果：异丙酚与内标分离良好，血清中异丙酚平均回收率为98.62%，日内，日间RSD均小于10%，血清异丙酚浓度在0.1-8μg/ml范围内线性关系良好，r=0.9991。结论：该法操作简便，结果可靠，适用于异丙酚血药浓度的测定。     

HER-2反义寡脱氧核苷酸对乳腺癌细胞的影响

目的 乳腺癌发病率高,远期生存率低。原癌基因HER-2与乳腺癌的恶性转化密切 相关。本课题以HRE-2反义寡脱氧核苷酸(ASODN)抑制乳腺癌细胞目的mRNA的转录表达,观察 对细胞的影响。方法:HER-2寡脱氧核苷酸(ODN)与表皮生长因子(EGF)连结,形成ODN-EGF。 将6．8 μmol·L1 ODN-EGF250μl·d1加入对数生长期乳腺癌细胞SK-Br-3培养,每天给药一次,连 续给药3天。末次给药后24小时,消化和收集细胞。用RT-PCR逆转录扩增HER-2 DNA,进行凝 胶电泳。电镜检测细胞显微结构的改变。结果 5组药物细胞mRNA RT-PCR的扩增片断为98bp DNA。电泳条带灰度值ASODN-EGF组13 009．33±74．19,SODN-EGF组13 291．33±39．72, NODN-EGF组13 234．00±95．50,ASODN组13 216．33±77．78,正常对照组13 284．67±31．94。电 镜检测ASODN-EGF组细胞,核畸形,胞浆内有裂痕和自身围成的腺腔,脂滴空泡化改变,线粒体外 室轻度肿胀,上皮样细胞特征角蛋白表达减少。结论 ASODN-EGF具有抑制SK-Br-3细胞HER-2 mRNA转录和表达的作用。     

丝裂素活化的蛋白激酶反义寡脱氧核苷酸防治血管内膜增殖

目的：探讨Ca^2 -钙调蛋白依赖性蛋白激酶（丝裂素活化的蛋白激酶）（CCDPK）在生长因子诱导体外培养大鼠血管平滑肌细胞增殖中的作用及反义CCDPK寡脱氧核苷酸（ODN）对球囊损伤后大白鼠血管内膜增生的抑制作用。方法：利用脂质体转染17－mer CCDPK反义ODN进入培养的血管平滑肌细胞以抑制CCDPK活性,设正义及随机ODN作对照。用蛋白质印迹法测定CCDPK表达。[^3H]胸腺嘧啶核苷酸掺入测定平滑肌细胞DNA合成。用2F球囊导管造成大白鼠颈动脉再狭窄模型,利用多聚胶F127－ODN系统由血管外膜部位给药。于损伤后2周取样,固定及HE染色观察内膜增生情况。FITC标记的ODN观察体内外给药方法的分布及吸收情况。结果：CCDPK反义ODN能明显抑制PDGF及ET诱导的CCDPK蛋白表达及[^3H]胸腺嘧啶核苷酸掺入。在大鼠颈动脉再狭窄模型,能明显抑制血管内膜增生。结论：CCDPK介导了PDGF及ET诱导的血管平滑肌细胞增殖。针对p42-和p44-CCDPK起始部位设计的17－mer反义ODN能有效抑制生长因子诱导的血管平滑肌细胞的增殖及球囊损伤大鼠血管内膜增生。     

Pharmacokinetics of phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides

Phosphorothioate (PS) oligodeoxynucleotides represent the class of antisense drugs most advanced in development and clinical testing. Exploitation of antisense oligonucleotide technology for development of rationally designed therapeutic drugs has presented a unique set of challenges, some of which relate to their pharmacokinetic behavior in vivo. Pharmacokinetic studies of PS oligodeoxynucleotides demonstrate that they are well absorbed from parenteral sites, rapidly distributed broadly to all peripheral tissues, do not cross the blood-brain barrier, and are eliminated primarily by slow metabolism in tissues. In general, the pharmacokinetic properties of this class of compounds appear to be largely driven by chemistry rather than sequence.     

Livin mRNA的反义核酸诱导MCF-7乳癌细胞凋亡作用

目的：以livin mRNA为靶点设计反义硫代脱氧寡核苷酸(PS—ODNs)，探讨其体外抗肿瘤效应及其机制。方法：设计以livin mRNA为靶点的反义核酸并作用于MCF-7乳癌细胞，用MTT、RT—PCR和流式细胞仪检测等方法对其进行评价研究。结果：在设计的一些反义核酸中，YMZ05能够有效地抑制livin基因的表达，增加caspase-3的活性，诱导MCF-7细胞凋亡，明显抑制其生长，结论：通过抑制livin基因的表达能够抑制MCF-7乳癌细胞生长、诱导其凋亡，livin可能会成为抗肿瘤的新靶点。     

HPLC法测定血清中替诺昔康浓度

目的 :建立测定血清中替诺昔康 (TNX)浓度的HPLC法。方法 :色谱条件 :KR10 0 C8色谱柱 ,流动相为含 5mmol·L-1庚烷磺酸钠的磷酸盐缓冲液 (pH =2 8) 乙腈 ( 6 5∶35 ,V/V) ,流速 1mL·min-1,测定波长 35 5nm ,内标为吡罗昔康 ,以TNX与内标的峰高比定量。结果 :线性范围为 0 0 5～ 10mg·L-1,具有良好的线性关系 ,日内、日间RSD均 <10 % ,相对回收率 >90 %。结论 :该方法简便、快速 ,灵敏度和准确度较高 ,无干扰。     

Percutaneous absorption of antisense phosphorothioate oligonucleotidein vitro

Antisense oligonucleotides seem to provide a promising new tool for the therapy. Choiet al. (1995) reported antisense phosphorothioate oligonucleotides (PS-ODN, 25 mer) complementary to TGF-β mRNA designed for scar formation inhibitor to eliminate scars, which was caused by undesired collagen deposition due to overexpression of TGF-β, in wounded skin. PS-ODN were evaluatedin vitro for skin penetration using normal and tape-stripped damaged rat skin. Thein vitro skin transports were carried out with partially modified PS-ODN (6S) and fully modified PS-ODN (25S). The cumulative amount of PS-ODN (6S) penetrated through normal rat skin was 0.234±0.041 μg/cm² and that of tape-stripped damaged rat skin was 1.077±0.301 μg/cm² over 8 hrs. PS-ODN (25S) can not be found in receptor medium through normal skin due to high molecular weight (Mol.Wt.=8,000) and polyanionic charge. However, the cumulative amount of PS-ODN (25S) penetrated across damaged rat skin in PBS was 0.340±0.296 μg/cm² over 8 hrs. The absense of dermis raised the cumulative amount of PS-ODN (6S) penetrated through rat skin. And the fluxes of PS-ODN (6S) and PS-ODN (25S) at 8hrs across damaged rat skin were 134.63±37.67 ng/cm² h, and 42.50±36.95 ng/cm² h, respectively. While PS-ODN (25S) was stable in 10% heat inactivated fetal bovine serum (FBS) during 24 hrs, PS-ODN (6S) was less stable than PS-ODN (25S), but was markedly stable than unmodified phosphodiester. It is suggested that the cumulative amount of PS-ODN (6S) penetrated through damaged rat skin is larger than that of PS-ODN (25S) since the former is easier to degrade by nuclease than the latter and then is apt to penetrate into skin. Thus, PS-ODN represents a logical candidate for further evaluation due to the potential for delivery into the wounded skin.     

反义核酸药物KS0604在小鼠的组织分布

目的:研究小鼠静脉注射30 mg.kg-1 KS0604后血浆和组织中原形药物浓度-时间变化。方法:建立组织消化结合基于离子交换和反相分配原理的两步固相萃取法,并采用非胶筛分毛细管电泳技术分析小鼠血浆和组织中的KS0604。结果:小鼠血浆和组织中KS0604在标准曲线范围内呈良好的线性关系。小鼠给药后各组织中以全长序列即药物原形为主,给药后4 h内,血浆中的浓度逐渐下降,2 h和4 h仅个别个体可测到。各组织中肾浓度一直最高,在给药后2 h达峰;肝、肺、心、骨骼肌和脂肪中,均在给药后1 h达到最高,4 h内变化不大。而脾在给药后仅个别个体可测到,脑和胰组织中的浓度均低于定量下限。结论:非胶筛分毛细管电泳方法能满足反义核酸药物KS0604小鼠组织分布实验的要求。小鼠给药后各组织中以全长序列即药物原形为主,给药后4 h内,AUC0～t从大到小依次为肾、肝、肺、心、骨骼肌、脂肪和血浆。     

新型c-Myc反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸在小鼠体内的药动学

目的 :研究新筛选合成的c Myc基因反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸 (antisensephosphorothioateoligodeoxynucleotidestoc Myc ,c MycAS PS ODN )在小鼠体内的药动学、组织分布和排泄情况。方法 :给小鼠按 5 ,10 ,2 0mg·kg- 13个剂量静脉注射3H c MycAS PS ODN后 ,液闪仪测定不同时间点血浆药物浓度 ;按 10mg·kg- 1静脉注射3H c MycAS PS ODN ,测定不同时间组织器官中3H c MycAS PS ODN的含量和其在粪、尿中排泄率 ,药动学统计程序拟合分析。结果 :静脉注射后 3种剂量血浆药物浓度 时间曲线均符合二室分布模型 ,3种剂量下的AUC之间有明显的线性关系 ;多数组织药物分布浓度 2h达高峰 ,肝、脾、肾、肺和骨髓中药物浓度较高 ,2 4h尿、粪总排泄率 82 %。结论 :c MycAS PS ODN在体内分布快 ,除脑、生殖腺等亲脂性组织外 ,其他组织含量高 ;主要通过尿液排泄。     

HPLC—MS法测定人血清中舍曲林的浓度

目的:建立人血清中盐酸舍曲林浓度的 HPLC-MS 法,用于其血药浓度测定并进行临床药动学和生物等效性研究。方法:300μL血清样品经乙腈沉淀后,以0.1%甲酸溶液-乙腈(40:60,v/v)为流动相,流速:0.2 mL·min~(-1),采用 Alltima-C_(18)柱(2.1 mm×100 mm,3.0μm)分离,通过气动辅助电喷雾离子化(ESI)方式,以选择离子反应监测(SRM)方式进行检测。18例健康志愿者按标准的2×2交叉试验方案设计,分别口服参比制剂及受试制剂各50 mg,用该法测定给药后不同时间点血清中舍曲林的浓度。结果:盐酸舍曲林浓度在0.6733～67.33 ng·mL~(-1)范围内呈良好的线性,低、中、高浓度的相对回收率分别为111.1%,94.68%,99.17%。该法被成功用于临床药代动力学和生物等效性研究。结论:该法灵敏、准确,适用于盐酸舍曲林的临床药动学和生物等效性研究。     

互为内标法测定去甲万古霉素与万古霉素的血药浓度

目的:建立人血清中去甲万古霉素与万古霉素HPLC测定法.方法:血样处理采用10%三氯醋酸沉淀法,色谱分析采用Agilent C18分析柱,流动相为甲醇-乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾溶液(8:1:91,pH 3.2),紫外检测波长236 nm,流速1.0 mL·min-1,柱温35℃,去甲万古霉素和万古霉素互为内标.结果:去甲万古霉素和万古霉素的线性范围均为1～80 mg·L-1;平均回收率分别为100.6%和100.8%;日内、日间RSD均＜5%.结论:此法具有采血量少,检测快速、稳定、灵敏度高而成本低等特点,适合临床常规血药浓度的监测.     

HPLC determination of valproic acid in human serum

A HPLC method for the determination of valproic acid (VA) in human serum using diazepam as internal standard (I.S.) is described. The eluates were separated with a C18 250 x 4.6 mm internal diameter reversed phase column maintained at a temperature of 50 degrees C. A mobile phase consisting of acetonitrile and 0.05 M phosphate buffer (pH 3.0) 45:55 v/v was used at a flow rate of 1.2 ml/min. Wavelength was switched from 360 nm to 210 nm during valproic acid retention. The method was linear over a concentration range of 20 to 160 microg/ml for valproic acid. Recovery was greater than 94% over a concentration range of 20 to 120 microg/ml and the limit of quantitation was 1 microg/ml. The intra day and inter day relative standard deviation (R.S.D.) measured at 20, 60, 80 and 120 microg/ml ranged from 1.46 to 5.34% and 0.83 to 5.03% respectively. The method is simple, rapid, accurate and sensitive and it was used for Therapeutic Drug Monitoring (TDM) in Indian epileptic patient population. The results obtained with this method correlated well with clinical practice.