丙型肝炎病毒RNA与血清标志物的检测

临床上，诊断丙型肝炎多采用检测血清中特异性标志物抗HCV抗体及非特异性标志物丙氨酸氨基转移酶(ALT)，而检测丙型肝炎病毒RNA(HCV RNA)，则是诊断HCV感染最直接、最可靠的指标。随着定量PCR的出现，人们将其用于丙型肝炎的早期诊断和治疗监测中。我们利用荧光定量-聚合酶链反应(FQ—PCR)检测了HCV RNA，并与血清性标志物(抗HCV抗体、ALT)进行了对比研究，以探讨两者之间的关系。     

荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒DNA

目的 建立检测HBV病毒DNA的荧光定量PCR法（FQ-PCR）,并与运用常规凝胶电泳技术观察特异扩增带检测的结果加以比较。方法 合成扩增HBV DNA314bp特异保守序列的1对引物及1条带2个荧光基团的寡核苷酸探针。用PE-5700型定量PCR仪完成PCR反应及产物的荧光定量检测。同是PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,EB染色,UVP（凝胶成像仪）检出有314bp带者为阳性或弱阳性。结果 建立了检测HBVDNA的荧光定量PCR技术,用已知HBV阳性模板不同拷贝数的标准溶液测得标准曲线Ct,原始拷贝数在10^5/ml以上者为阳性,用定量及定性PCR2种方法检测698例血清标本的结果表明：用FQ-PCR技术共检测出204例为阳性,阳性率29.2%;用定量及定性PCR2种方法检测698例血清标本的结果表明：用FQ-PCR技术共检测出204例为阳性,阳性率29.2%;用定性PCR观察到193例有阳性特异带,阳性检出率为27.65%。没有发现用定性PCR检测为阳性而用FQ-PCR检测为阴性者。结论 FQ-PCR检测HBVDNA较普通定性PCR技术具有操作简便,灵敏度更高、减少发生污染可导致假阳性结果的可能性及自动化程度高等优点,值得在临床检验中推广应用。     

用热启动聚合酶链反应检测血清中乙型肝炎病毒DNA技术的建立和应用

建立了热启动聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测乙型肝炎病毒ＤＮＡ（ＨＢＶＤＮＡ）的技术。ＰＣＲ所有反应成分被２次加样。先加Ａ液（含ｄＮＴＰｓ、一对引物和ＭｇＣｌ＿２）与一粒石蜡珠。７０℃加热后冷却至室温，使蜡珠先融化后凝固形成蜡盖封住Ａ液，然后在向其上加入Ｂ液（含耐热性ＤＮＡ聚合酶、ＨＢＶＤＮＡ模板和ＫＣｌ）并开始循环扩增。当反应管内第一次变性温度升至６０℃以上时，中隔蜡层融化，蜡上浮形成防蒸发屏障，Ａ、Ｂ两液则由于热分子运动而混匀，从而保证引物与靶基因在较高温度下严格退火以减少错导非特异性扩增和引物聚体形成。提高了ＰＣＲ的特异性和灵敏性，应用这种技术对７６例肝炎血清进行了检测，结果ＨＢＶＤＮＡ检出率为６８％，其中ＨＢｓＡｇ（＋）、ＨＢｅＡｇ（＋）、抗－ＨＢｃ（＋）血清检出率为１００％；ＨＢｓＡｇ（＋）、抗－ＨＢｅ（＋）、抗－ＨＢｃ（＋）血清检出率为７０％；ＨＢｓＡｇ（＋）、抗－ＨＢＣ（＋）血清检出率为８９％；抗ＨＢＣ（＋）血清检出率为对％；标记全阴性血清检出率为３３％。     

多重引物聚合酶链反应扩增丙型肝炎病毒基因及基 …

利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术对丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）的５’－非编码区（５’－ＮＣＲ）、Ｃ及ＮＳ４基因区的３对引物分别及同时扩增，检测８０例抗－ＨＣＶ阳性患者的血清ＨＣＶ ＲＮＡ，并进行了ＨＣＶ基因分型研究。各不同引物所介导的ＰＣＲ检出ＨＣＶ ＲＮＡ的结果为：５’－ＮＣＲ基因区６０％（４８／８０），Ｃ基因区３７％（３０／８０），ＮＳ４基因区３０％（２４／８０）。以上３对引物同时扩增仅４２％（３４／     

用聚合酶链反应检测人肝细胞癌乙型肝炎病毒DNA和丙型肝炎病毒RNA

为研究乙型肝炎病毒ＤＮＡ（ＨＢＶＤＮＡ）和丙型肝炎病毒ＲＮＡ（ＨＣＶＤＮＡ）与肝细胞癌的关系，用聚合酶链反应（ＰＣＲ）和巢式ＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ）分别检测４２例肝肿瘤组织中ＨＢＶＤＮＡ和ＨＣＶＲＮＡ。结果：１例胆管细胞癌组织ＨＢＶＤＮＡ和ＨＣＶＲＮＡ均阳性，１例胆管囊腺瘤ＨＢＶＤＮＡ阳性。４０例肝细胞癌组织中，单纯ＨＢＶＤＮＡ阳性１９例，单纯ＨＣＶＲＮＡ阳性３例，二者均阳性１０例。ＨＢＶＤＮＡ阳性率７２．５％，ＨＣＶＲＮＡ阳性率３２．５％。ＨＢＶＤＮＡ和ＨＣＶＲＮＡ感染与肝癌组织学分型无关；且肝细胞癌中ＨＣＶ感染与ＨＢＶ未见相关。结果提示，我国ＨＢＶ感染仍是引起肝细胞癌的主要原因。但由于肝细胞癌患者中ＨＣＶ的感染率也较高，且有上升趋势，因此ＨＣＶ可能也是肝细胞癌发生的重要原因之一。     

逆转录—巢式聚合酶链反应检测庚型肝炎病毒RNA方法…

庚型肝炎病毒基因组为单链，正肌ＲＮＡ，全长９３９２ｂｐ。根据５‘－非编码区基因序列设计合成两对引物。随机选取酶联抗－ＨＧＶ阳性病人血清３份，阴性病人血清６份，应用逆转录－巢式聚合酶链反应进行检测。结果２份抗－ＨＧＶ阳性血清可见较强的特异扩增带，１份抗－ＨＧＶ阳性血清可见较弱的特异扩增带，其余６份抗－ＨＧＶ阴性血清均无特异性扩增带。     

用聚合酶链反应技术研究重型肝炎患者乙型和丙型肝炎病毒的混合感染

采用聚合酶链反应技术（ＰＣＲ）检测了３６例重型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）和丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）的复制状况，发现较普遍存在ＨＢＶ复制，阳性率高达７８％；ＨＣＶ复制亦较活跃，为６１％。提示病毒因素仍然是引起肝衰竭的重要原因。临床资料表明，同时感染两种病毒的重肝患者（４１％）预后较差，ＨＢＶ引起的肝坏死较ＨＣＶ引起的更为严重，两者在体内复制有互相抑制作用，但合并感染可造成肝脏的持续损伤。     

由特异基因扩增产物制备丙型肝炎病毒cDNA探针

应用逆转录聚合酶链反应技术自丙型肝炎病毒感染血浆中扩增ＨＣＶ－ｃＤＮＡ，经寡聚核苷酸探针杂交鉴定后以低熔点琼脂糖凝胶电泳分离，微柱亲和层析纯化，用于缺口平移制备＾３２Ｐ标记的ＨＣＶ基因探针，这种探针用于斑点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测非甲非乙型肝炎血产乐的ＨＣＶ基因扩增产物，能鉴定ＨＣＶ序列的特异性，且分别达到０．１ｐｇ和１ｐｇ的敏感性。     

乙型肝炎病毒基因聚合酶链反应分型方法的建立

根据乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的Ｓ区序列设计了３条引物：ＨＢＳ１、ＨＢＳ２和ＨＢＳ３，与ＨＢＳ１和ＨＢＳ２配对，经２次聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增。即可在检测有无ＨＢＶ－ＤＮＡ存在的同时对其基因型分类，可检出１０ａｇ的ＨＢＶ－ＤＮＡ，比免疫学方法更灵敏和特异。２５份不同亚型的标准血清中的绝大多数用Ｓ－ＰＣＲ和ＡＧＩＤ／ＲＰＨＡ的分型结果一致，Ｓ－ＰＣＲ的另一突出优越性的于能够对ＨＢｓＡｇ低滴度和阴性标本     

应用非同位素原位杂交检测肝组织中丙型肝炎病毒基因的分布

为了研究丙型肝炎患者肝组织中丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）基因的分布，我们应用地高辛标记的ＨＣＶ基因５＇端非翻译区的探针（长度为３２个寡核苷酸），对２４例急、慢性丙型肝炎患者活检的肝组织石蜡包埋切片进行了原位核酸杂交检测。结果显示：ＨＣＶ基因阳性的肝组织标本有１１例，检出率是４５．８％（１１／２４）。ＨＣＶ基因主要分布于肝细胞浆，偶见于肝细胞核内。此外在肝血窦的ｋｕｐｆｆｅｒ细胞、小血管内皮细胞和汇管区附近均有明显的ＨＣＶ基因阳性染色，而对照组均未发现ＨＣＶ基因阳性信号。     

Detection of GB Virus-C/Hepatitis G Virus RNA in Serum by Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

Three PCR methods based on the GB virus-C/hepatitis G virus (GBV-C/HGV) 5′UTR and NS3 genomic region were used for the detection of GBV-C/HBV RNA in serum of 62 patients with chronic hepatitis C virus (HCV) infection. Ten of 62 (16%) patients were found to have GBV-C/HGV RNA, which was confirmed by sequence analysis of the 5′UTR PCR amplicon. All methods appear to be specific, but methods based on the 5′UTR appear to be more sensitive. J. Med. Virol. 52:92–96, 1997. © 1997 Wiley-Liss, Inc.     

聚合酶链反应技术结合酶切杂交研究单项抗乙型肝炎病毒核心抗原阳性者的乙型肝炎病毒感染

以聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增单项抗乙型肝炎病毒核心抗原（ＨＢｃ）阳性血清的乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ＤＮＡ。内外两对引物均选自ａｄｒ、ａｄｗ和ａｙｗ３种亚型ＨＢＶ基因组Ｃ基因区的共有序列，扩增产物分别长４２８ｂＰ和６６４ｂＰ，共含一个ＢｇｌⅡ酶切点，酶切后前者产生２９９ｂＰ和１２５ｂＰ、后者产生４０６ｂｐ和２５４ｂｐ各一个限制性片段。以另一条基因位置处于内引物对之间的寡核苷酸制备３２Ｐ－５＇末端标记的探针对之进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ转移杂交，鉴定了扩增产物的特异性。结果从单项抗ＨＢｃ阳性的８／４２例慢性肝炎和２／１２倒无症状受测者血清中检出ＨＢＶＤＮＡ，提示现症低水平病毒复制和潜在的传染性。     

聚合酶链式反应技术在肾综合征出血热病毒基因分型中的应用

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法对２５株国内外病毒进行分型。病毒ＲＮＡ逆转录成ｃＤＮＡ后，用Ⅰ型（ＨＡＮ）和Ⅱ型（Ｒ２２）两种分型引物进行体外扩增。产物经凝胶电泳、核苷酸序列分析和打点杂交等技术证实其特异性。结果表明，Ⅰ型引物仅扩增野鼠型病毒ｃＤＮＡ；Ⅱ型引物也只扩增家鼠型病毒，无交叉反应。扩增片段的大小与预计一致。两种引物和探针可将２５株病毒明确地分为两种基因型，与血清学分型结果完全吻合。     

荧光定量聚合酶链反应检测慢性乙肝患者HBV DNA的意义

目的探讨荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测慢性乙肝患者血清乙型肝炎病毒(HBV)脱氧核糖核苷酸(DNA)的临床意义。方法回顾性分析248例慢性乙肝患者的资料,均采用FQ-PCR技术检测血清HBV DNA,检测乙肝病毒标志物(HBV-M)并对比不同HBV-M患者血清HBV DNA水平;对比不同病情患者血清HBV DNA水平;对比不同HBV DNA表达患者外周血T淋巴细胞亚群水平及异常率,分析患者血清HBV DNA水平与外周血T淋巴细胞亚群水平的关系。结果不同HBV-M患者血清HBV DNA水平对比:HBsAg+HBeAg+HBcAb>HBsAg+HBeAg>HBsAg+HBsAb+HBcAb>HBsAg+HBeAb>HBsAb+HBeAb+HBcAb>HBcAb/HBsAb+HBeAb/HBeAb+HBcAb,除HBcAb、HBsAb+HBeAb、HBeAb+HBcAb血清HBV DNA水平差异无统计学意义(P>0.05),其余每2样本比较差异均有统计学意义(P<0.05);不同病情患者血清HBV DNA水平对比:重度病情患者>中度病情患者>轻度病情患者(P<0.05);不同HBV DNA表达患者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+对比,HBV DNA阴性患者>低拷贝患者>高拷贝患者(P<0.05),CD3+、CD4+、CD4+/CD8+异常率对比,HBV DNA阴性患者<低拷贝患者<高拷贝患者(P<0.01);本组患者血清HBV DNA水平与外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均呈负相关(r=-0.789、-0.812、-0.706,P=0.012、0.007、0.001)。结论在慢性乙肝患者中FQ-PCR检测血清HBV DNA水平与HBV-M、病情和外周血T淋巴细胞亚群水平均有密切关系。