缺失型α—地中海贫血中的基因诊断新技术研究

目的 建立诊断我国最常见的三种缺失型α-地中海贫血（α-地贫）,即东南亚型缺失（--^SEA)、右侧缺失（-α^3.7)和左侧缺失（－α^4.2)的PCR技术。方法 设计三组PCR引物,优化PCR反应条件,运用PCR、琼脂糖凝胶电泳、UVP凝胶成像技术,根据电泳图谱检测并诊断三种缺失型α-地贫。结果 成功地检测这三种缺失型的纯合子、杂合子或双重杂合子,结果与Southern blotting分析一致。完成42例α-地贫样本的基因诊断。结论 本研究所建立的检测α-地贫缺失型的技术,准确、简便、重复性好,便于推广应用。     

单管多重PCR结合RDB技术在α-地贫产前诊断中的应用

目的 基因诊断结果在α-地贫的产前诊断中具有决定意义.采取两种不同技术原理的方法验证产前诊断结果,是保证产前诊断结果可靠性的基本要求.本文探讨检测常见非缺失型α-地贫的RDB技术作为单管多重PCR技术产前诊断α-地贫验证方法的可行性.方法 采用双盲法,对73例α-地贫产前诊断的标本分别采用针对中国人3种常见缺失型α-地贫突变的单管多重gap-PCR技术和针对常见3种非缺失α-地贫点突变的RDB法进行分析,根据单管多重PCR技术扩增产物电泳图谱和RDB膜条上显色的斑点分别判断某一个标本缺失型和非缺失α-地贫的突变类型,且与引产或出生后胎儿脐带血中Hb Bart′s定量结果进行比对.结果 单管多重PCR和RDB技术均能分别准确检出常见缺失型和非缺失型α-地贫各种突变类型.如将两者结合分析,还能提供相互佐证的重要信息:对于--SEA、-α3.7和-α4.2自身或相互组合的各种基因型标本,其RDB膜条的杂交斑点均不显色;而--SEA与αCSα、αQSα和αWSα组合的基因型标本该突变的正常对照点不显色.α-地贫产前诊断结果与胎儿脐带血电泳结果完全吻合.结论 单管多重PCR结合RDB技术同时应用于α-地贫的基因诊断,可保证产前诊断的可靠性,值得在临床遗传诊断实验室中推广应用.     

α地中海贫血的基因诊断及产前诊断研究

目的建立同时检测中国人中最常见的3种α地中海贫血(地贫)基因缺失的单管多重PCR(mPCR)技术，并运用于河北省一个α地贫家系的基因诊断与产前诊断。方法mPCR包含7条引物．运用mPCR、凝胶电泳及DNA测序技术进行α地贫的基因诊断和胎儿羊水细胞DNA的产前基因诊断：结果运用mPCR技术检测了42份α地贫患者DNA标本，证明其能准确、灵敏、快速、简便地诊断出完整的α珠蛋白基因型。查明河北省1例α地贫患儿为--^SEA和Hb^CS、双重杂合子，该家系第2胎胎儿羊水细胞DNA检查证明为完全正常胎儿，产后检测与产前诊断结果相符。结论所建立的α地贫基因诊断mPCR技术可用于3种缺失型α地贫的快速诊断和产前诊断。我国北方也有少量散在α地贫患者及家系，应引起重视，以免贻误诊断和治疗     

四重TaqMan实时荧光PCR检测α地中海贫血——~(SEA)、—α~(3.7)和—α~(4.2)缺失

目的建立并评价一种基于珠蛋白基因拷贝数相对定量技术的α地中海贫血(α地贫)--SEA、-α3.7和-α4.2缺失基因型快速检测方法。方法建立四重TaqMan实时荧光PCR体系结合2-ΔΔCt数据分析的方法,同时检测ψα、α2和α1基因相对拷贝数,快速诊断α地贫缺失基因型;以此方法检测28例已知α地贫缺失基因型标本和309例临床标本,并与gap-PCR平行对比检测,评价该方法的准确性与实用性。结果建立的检测体系扩增效率均接近100%;28例已知基因型及309例临床标本的检测结果显示其准确性达到100%,且能有效消除微量或少量外源污染导致的假阴性和假阳性。结论本研究建立的基于珠蛋白基因拷贝数相对定量技术的α地贫--SEA、-α3.7和-α4.2缺失基因型检测方法,操作简单快速,结果准确可靠,适合大规模人群筛查和常规分子诊断。     

德宏地区地中海贫血社区群体筛查和基因诊断

目的了解德宏地区地中海贫血(简称地贫)检出率和基因缺失突变类型。方法先以红细胞指数、微量血红蛋白电泳、HbA_2定量等进行初筛,然后以PCR和反向点杂交技术鉴定β-地贫基因突变类型;以跨跃断裂位点PCR(GAP-PCR)技术和凝胶电泳鉴定α-地贫基因缺失类型,最后再对所有β-地贫阳性样本进行α-地贫基因检测。在选定的先证者所能寻找到的家族成员中采集血样,直接检测基因类型并展开家系调查。结果 3018例受检者中检出α-、β-地贫阳性848例,总检出率为28.10%,其中α-地贫554例(18.36%)、β-地贫385例(包括HbE 375例)检出率为12.76%;β-地贫复合α-地贫检出率为22.60%;在4例家系调查先证者的56例家族成员中检出阳性44例(78.5%)。结论跨跃断裂位点PCR和反向点杂交技术能快速检测3种常见缺失型α-地贫和β-地贫基因突变,具有简便、快捷和准确的特点;德宏地区是我国地贫特别高发地区,需加强婚前检查及产前诊断。     

双重TaqMan实时荧光嵌套PCR快速检测α地中海贫血SEA缺失方法的建立与应用

目的 建立一种快速检测α地中海贫血(α地贫)SEA缺失的双重TaqMan实时荧光嵌套PCR方法.方法 收集2010年5-7月在广州市天河区妇幼保健院进行地贫筛查的外周血标本100份,2010年12月至2011年2月东莞东华医院进行产前诊断的胎儿标本7份(绒毛2份、羊水5份).从本实验室样本资源库中选取α地贫SEA缺失已知基因型标本50份.采用双重TaqMan实时荧光嵌套PCR技术,于同一检测体系同时检测各标本d地贫SEA缺失截短序列及缺失范围内正常序列,根据荧光PCR阳性扩增结果结合其Ct值差异诊断受检个体的α地贫SEA缺失基因型.同时采用检测α地贫SEA缺失的常规gap-PCR法,以PCR扩增结合产物凝胶电泳分析各标本α地贫SEA缺失基因型,以验证及对比分析新方法的准确性与实用性.结果 所建立的双重TaqMan实时荧光嵌套PCR优化体系中2个PCR的扩增效率分析曲线的斜率分别为-3.153(SEA缺失截短目的 片段)和-3.182(正常内参序列),扩增效率均接近100%.应用此方法检测50份α地贫SEA缺失已知基因型标本,结果显示该方法不但能实现其快速分子诊断,而且能准确判断受检标本中的外源性污染,从而有效避免假阴性或假阳性误诊.100份外周血标本中,两种方法分别检出SEA缺失标本11份,对比分析两方法的诊断符合率为100%.7份胎儿标本中,gap-PCR法检出SEA缺失3份,而本方法则检出SEA缺失标本2份、受-SEA/αα母源性污染的基因型为αα/αα的绒毛标本1份.结论 本研究建立的双重TaqMan实时荧光嵌套PCR可以快速准确检测α地贫SEA缺失,操作简单实用,适合大规模人群筛查和常规分子诊断.     

α-地中海贫血的产前基因诊断

目的:对可能生育α-地中海贫血(α-地贫)患儿的高危夫妇进行产前基因诊断,以杜绝重型α-地贫患儿的出生。方法:通过羊膜腔穿刺术或脐带穿刺术获得胎儿样本,提取DNA,进行多重PCR,琼脂糖凝胶电泳以分离PCR产物,根据扩增产物长度判断样本的基因型以得出诊断。结果:我们共对1964例样本进行了α-地贫的基因检测,并对其中263对夫妇α-地贫高风险妊娠进行了产前诊断,检出Bart's水肿胎49例,占18.63%,血红蛋白H病10例,占3.80%,轻型α-地贫117例,占44.49%,静止型α-地贫13例,占4.94%,正常74例,占28.14%。结论:单管多重PCR/琼脂糖凝胶电泳技术简便、快速、准确地同时检测-α3.7,-α4.2及--SEA3种缺失型,大大提高了诊断效率,更适合于广东地区的α-地贫产前诊断。     

基因芯片检测缺失型α地中海贫血的研究

目的：建立基因芯片检测技术为缺失型α-地中海贫血基因检测诊断提供良好的方法。方法：应用基因芯片检测技术对515例深圳市人民医院进行产前检查及产前诊断的妇女进行筛查。结果：其中85例缺失型α-地贫诊断为：-^SEA型65例占12．62％，-α^3.7型14例占2．72％；-α^4.2型4例占0．78％；-^SEA／-α^3.7型2例占0．39％。结论：应用基因芯片检测技术检测缺失型α-地中海贫血的诊断比用传统方法如：southern杂交、跨越断裂点PCR方法更具备微量、高效、敏感、自动化等特点，更能准确地从分子水平诊断疾病，从而可代替传统检测方法成为筛查的常规方法。     

海南昌江地区人群αβ复合型地中海贫血基因突变类型的研究

目的:研究海南昌江地区人群αβ复合型地中海贫血(地贫)基因突变类型及检出率.方法:采用膜反向杂交技术检测β地贫基因.用gap-PCR法检测三种常见α地贫缺失基因型:东南亚型缺失(--SEA)、右侧缺失(-α3.7)、左侧缺失(-α4.2),采用反向点杂交法检测3种常见的突变型α-地中海贫血基因(QSM、CSM和WSM).结果:海南昌江地区αβ复合型地中海贫血检出率高,在212例β地贫患者中检出复合α地贫的共102例,检出率为48.11%,β地贫杂合子复合-α4.2/α是本次研究中检出的主要复合型地贫类型,其次为-α3.7/αα,以轻型β地贫复合α地贫为主要突变类型.结论:海南昌江地区αβ复合型地贫检出率高.-α4.2/αα是本地区β地贫杂合子检出的主要复合α地贫基因型,其次为-α3.7/αα.准确诊断β地贫合并α地贫双重杂合子对本地人群正确进行遗传咨询和做好优生优育的准备都具有十分重要的意义.     

胎儿巴特(氏)血红蛋白定量分析在产前诊断α-地中海贫血中的价值

目的通过对胎儿脐血行血红蛋白(Hb)电泳检查,探讨胎儿巴特(氏)血红蛋白(HbBart′s)定量分析在α-地中海贫血(简称:α-地贫)产前诊断中的价值。方法于妊娠中晚期对夫妻双方均为α-地贫携带患者抽取胎儿脐带血行Hb电泳分析。对胎儿羊水样本行α-地贫3种缺失型基因和3种非缺失型基因检测。结果胎儿Hb-Bart′s定量分析对重型、中间型及轻型α-地贫检出的灵敏度、特异度和诊断符合率高,误诊率及漏诊率较基因检测低;而对静止型α-地贫检出的灵敏度、特异度及诊断符合率较低,误诊率、漏诊率基因检测较高。结论胎儿HbBa-rt′s定量分析对产前诊断α-地贫具有简便、快速且经济、准确的优点,结合家族史可作为孕娠中、晚期α-地贫产前诊断的常规方法 ,基因诊断结合HbBart′s定量分析有利于提高α-地贫的诊断准确率。     

罕见和未知基因型珠蛋白生成障碍性贫血的分析与鉴定

目的对珠蛋白生成障碍性贫血(简称地贫)血液学表型阳性但未检出常见地贫基因型的疑似个体做进一步分子水平检测,以明确诊断。方法收集2015年5月至2018年8月在清远市妇幼保健院就诊的地贫血液学表型阳性但常见地贫基因型检测为阴性的标本96例(包括疑似α-地贫88例和β-地贫8例),分别采用单管多重PCR、DNA测序法、荧光定量PCR和芯片捕获测序法检测罕见和未知缺失型地贫基因。结果从上述疑似α-地贫标本中共检出罕见α-地贫基因型17例,其中泰国缺失型(--^THAI/αα)5例,菲律宾缺失型(--^FIL/αα)2例,α^ΔCD303例,α珠蛋白基因拷贝数增加(ααα^anti3.7或ααα^anti4.2)5例,并且发现2例新的α-地贫突变,即α^ΔCD272-279delAGCTTCGG和CD167-169insT。在8例β-地贫特征个体中检出罕见β-地贫基因型Poly A(A>G)2例,-90(C>T)3例,CD37(TGG>TAG)1例,IVS-I-2(T>A)1例,另外还鉴定出1例新的缺失型β-地贫基因(缺失位置为ch11:5,246,000-5,250,500,缺失长度为4kb左右)。结论对未检出常见地贫突变但血液学表型阳性个体进行深度分析,既可提高地贫基因的检出率,有利于遗传咨询和产前诊断,又可能发现新的地贫突变,丰富了中国人群的地贫基因突变谱。     

基因芯片法诊断地中海贫血

ThalaChipTM是一种基于DNA芯片技术识别中国地区已知地中海贫血 (珠蛋白合成障碍性贫血 ,地贫 )基因型的新技术 ,专为快速检测α和 β珠蛋白基因中的DNA缺失和突变而设计的 ,能够同时检测中国地区最常见的 -α3 .7、-α4.2 和- SEA三种α地贫[1] ,以及 2 1种 β珠蛋白基因点突变[2 ] ,覆盖率达到 β地贫的 98%。我们对经初筛确诊或可疑地贫患者的血液标本首先用传统的PCR技术或PCR联合反向点杂交技术 (PCR/RDB)作基因检测 ,再与基因芯片技术检测结果进行比较 ,用DNA直接测序法鉴定差异结果。材料和方法1　样本来源　在健康人群…     

αβ复合型珠蛋白生成障碍性贫血的发生率及基因检测

目的研究广西钦州地区人群的αβ复合珠蛋白生成障碍性贫血的发生率及基因检测,以了解其检出情况及基因分布状况。方法应用单管多重聚合酶联反应(PCR)技术进行常见3种α缺失型基因检测以及反向点杂交法检测中国人常见的17种位点β-珠蛋白生成障碍性贫血(简称β-地贫)。结果 250例β-地贫杂合子中有39例复合缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血(α-地贫),占15.60%。其中β-地贫杂合子合并(--SEA/αα)α地贫24例(9.6%);合并(-α3.7/αα)α地贫10例(4%),合并(-α4.2/αα)α地贫4例(1.6%),合并(--SEA/-α4.2)α地贫1例(0.4%)。检出39例β-地贫基因突变类型共有8种,分别为41-42(TCTT)、TATAbox 28(A→G)、CD17(A→T)、IVSⅡ654(C→T)、CD71-72(+A)、βE(G→A)、CD43(G→T)及IVS1-1(G→T)。结论采用PCR技术可以有效减少αβ复合珠蛋白生成障碍性贫血漏检的可能,对杜绝重珠蛋白生成障碍性贫血儿童的出生和提高人口素质具有重要的意义。     

2例缺失型α地贫纯合子避免误诊的经验分享

<正>α地中海贫血(简称α地贫)的分子缺陷包括基因缺失和突变2种类型。我国常见的3种缺失型α地贫基因为东南亚缺失型(--SEA)、右侧缺失型(-α3.7)和左侧缺失型(-α4.2),但由于地贫异质性大,尚有其他罕见α珠蛋白基因变异类型未包含在目前国家批准使用的地贫基因分型诊断试剂盒检测范围内。鉴于基因检测方法学的局限性,实验室和临床应结合患者的红细胞参数和血红蛋白电泳进行综合分析,以避免因误诊而引起重型地贫患儿出生。本实验室发现2例常见地贫基     

多重聚合酶链反应在α-地中海贫血诊断中的应用

目的初步评价使用单管多重PCR对缺失型α-地中海贫血(α-地贫)的诊断效能。方法使用单管多重PCR基因诊断试剂对202例血液学方法筛检疑似α-地贫患者进行基因检测，并对其中部分标本进行测序。结果疑似为α-地贫的202份临床标本，基因检测证实其中136例为α-地贫，其结果经序列分析证实。与PCR检测相比，一管法红细胞脆性、MCV、MCH与RDW-CV检测的灵敏度分别为85．29％、99．44％、73．53％和61．03％，特异性分别为69．70％、66．67％、62．12％和60．61％。在136例α-地贫患者中，--^SEA/αα104例、-α3.7/αα14例、-α^4.2/αα例、-α^3.7/--^4.211例和-α^4.2/--^SEA3例，分别占76．47％、10．29％、2．94％、8．09％和2．21％。结论与血液学方法相比，多重PCR检测具有快速、准确的优点，可用于人群和临床样品的缺失型α-地贫的分子筛查以及产前诊断。     

6545例α-地中海贫血基因检测结果分析

目的了解广西南宁江南区α-地中海贫血(简称地贫)人群的基因型特点。方法选取疑似α-地贫患者及α-地贫基因携带者配偶6 545例,对其进行基因检测。提取患者DNA,并进行体外扩增。采用跨越断裂点聚合酶链反应对4种常见缺失型α-地贫基因(-α~(3.7)、-α~(4.2)、--SEA、--THAI)进行检测。采用聚合酶链反应结合反向斑点杂交法对3种常见非缺失型α-地贫基因(HbCS、HbQS、HbWS)进行检测。结果共检出α-地贫基因2 573例(39.31%,2 573/6 545),其中静止型α-地贫1 083例(42.09%,1 083/2 573),轻型α-地贫1 370例(53.25%,1 370/2 573),中间型α-地贫(血红蛋白H病)120例(4.66%,120/2 573)。检出缺失型α-地贫2 070例,以--SEA/αα、-α~(3.7)/αα、-α~(4.2)/αα为主。检出缺失复合突变型α-地贫77例,以--SEA/α~(WS)α、--SEA/α~(CS)α、-α~(3.7)/α~(WS)α为主。检出非缺失型α-地贫426例,以α~(CS)α/αα、α~(WS)α/αα、α~(QS)α/αα为主。结论广西南宁江南区人群α-地贫基因携带者较多,缺失型以--SEA/αα为主,非缺失型以α~(CS)α/αα为主,中间型α-地贫(血红蛋白H病)也并非罕见,应对该地区人群开展地贫筛查和基因检测。     

基因芯片用于检测缺失型α地中海贫血

地中海贫血 (珠蛋白生成障碍性贫血 ,地贫 )是我国长江以南发病率最高、危害最大的一种遗传病。我国南方地区常见的 3种缺失型α地贫分别是由 -α3 .7、-α4.2 和 - - ＳＥＡ基因的缺失引起的。传统的缺失型α地贫基因分析检测方法主要是用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交、聚合酶链反应 (ＰＣＲ)法。但由于α地贫珠蛋白基因缺失型的不同所需试剂及反应条件也不同 ,须分别进行检测 ,给临床筛查及快速诊断带来不便 ;同时 ,全套检测的累加费用较高 ,给患者造成了一定的经济负担。近年来基因芯片技术的发展给疾病的基因诊断提供了广阔的应用前景。我们运…     

PCR技术对α-地贫家系进行产前检测

目的：探讨PCR技术对α-地贫家系进行产前检测对优生优育的临床意义。方法：利用电泳和聚合酶链反应(PCR)技术，对筛查出的300例患者进行缺失型α-地中海贫血的产前诊断。结果：300例进行PCR诊断结果为：α地1杂合子140例，占46．7％；a地1纯合子24例，占8％。其中114对有不良孕产史的夫妇中有52对夫妇双方均α地1杂合子，占47％。HbH病患儿为α地1杂合子，其母也为α地1杂合子，其父α地1检测正常。结论：提示PCR技术用于α-地中海贫血的产前诊断，快速、准确。     

特殊α-珠蛋白基因结构合并东南亚缺失的α 地中海贫血1例

摘要:目的：探讨1例特殊α-珠蛋白基因结构合并东南亚缺失的α-地贫患者的分子遗传学机制。 方法：用血红蛋白（Hb）电泳分析该患者Hb含量,裂口PCR(gap-PCR)法检测缺失型α-地贫基因,反向斑点杂交技术（RDB）检测非缺失型α-地贫基因和β-地贫基因突变。 结果：Hb电泳结果显示,该患者HbA含量为93.43%,HbA2为6.57%;缺失性α-地贫的电泳结果出现1 900、1 700、1 200 3条罕见条带;非缺失型α-地贫基因检测未发现Hb^CS、Hb^WS、Hb^QS突变;β-地贫基因突变为β^41-42M/β^N基因型。 结论: 该患者为α-珠蛋白基因结构（α2-α2α1）合并东南亚缺失导致的非Hb H病,且存在β 地贫,临床症状不明显。     

PCR结合导流杂交技术在育龄妇女α和β地中海贫血诊断中的应用

目的探讨PCR结合导流杂交技术诊断试剂盒在育龄妇女d和p地中海贫血诊断中的应用。方法以平均红细胞体积（MCV）〈80fl筛查出141表型阳性病例,凯普α-和β地中海贫血诊断试剂盒检测地贫。结果检测出80例存在α-地中海贫血,包括9种类型,常见类型为-SEA／α、α-／α-．α42／αα-,其中4例存在两种缺失;53例存在β-地中海贫血,包括11种类型,常见α-地贫基因型B4142、p654、B17、1328,其中2例存在两种突变;5例同时存在α-地贫和β-地贫;13例未检测到缺失或突变;同时还检测出5例MCV〉80fl的α-地中海贫血病例,其中1例合并β-地贫。结论本试剂盒优势为同一基因芯片上进行仅和β地贫的测定,缩短了检测时间,降低检测成本,减少复合地贫漏诊,适合基层实验室用于常见地贫的诊断。但仅能检测常见类型α-和β地贫,具有一定局限性,在出现该试剂无法检测到的地贫基因缺失或突变,而MCV〈80fl时,建议进行缺铁性贫血的筛查和地贫基因序列的检测。