丙型肝炎病毒上调胶原三股螺旋重复蛋白1的表达

目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)对胶原三股螺旋重复蛋白1(CTHRC1)表达的影响。方法 RT-PCR和Western blot检测JFH-1株HCV病毒感染的Huh7.5.1细胞及其对照细胞中CTHRC1 mRNA和蛋白的表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测CTHRC1血清学含量。结果 HCV感染的Huh7.5.1细胞CTHRC1 mRNA和蛋白的表达水平较对照细胞高,与健康对照组相比,丙肝患者CHTRC1血清学水平显著升高(P<0.05)。结论 HCV能够在体内外上调CTHRC1的表达。     

丙肝病毒感染对C反应蛋白表达的影响

目的：探讨丙型肝炎病毒(HCV)在体内外对C反应蛋白(CRP)表达的影响。方法收集武汉大学中南医院2015年1月至2016年2月HCV感染患者标本106例和健康体检者标本110例,免疫透射比浊法检测其血清CRP水平,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HCV感染的Huh7.5.1细胞及其对照细胞中CRP mRNA的表达。结果 HCV感染患者血清CRP水平为(8.62±5.56) mg/L,显著高于健康体检者的(1.35±0.71) mg/L,差异有显著统计学意义(P<0.01);HCV感染的Huh7.5.1细胞中CRP mRNA的表达水平较对照细胞高,其CRP/β-actin灰度比值分别为0.31和1.5。结论 HCV感染能够上调肝细胞CRP的表达。     

乙型丙型肝炎病毒合并感染细胞模型的建立

目的：本文拟利用慢病毒载体,在可感染丙型肝炎病毒（HCV）的Huh7.5.1细胞中过表达人肝细胞乙型肝炎病毒（HBV）受体钠离子牛磺胆酸共转运蛋白（sodium taurocholate cotransporting polypeptide, NTCP）编码基因,建立Huh7.5.1- hNTCP细胞模型,使其可以被HBV、HCV共同感染。方法：使用携带人NTCP编码基因、GFP（green fluorescent protein）基因、嘌呤霉素抗性基因的GV358重组慢病毒载体,以50的感染复数（MOI）感染Huh7.5.1细胞。经过嘌呤霉素筛选获得稳定表达人NTCP基因的Huh7.5.1-hNTCP细胞株,并通过Western-blotting验证NTCP蛋白的表达。使用HepAD38细胞来源的HBV感染Huh7.5.1-hNTCP细胞,通过ELISA及qPCR等方法检测HBV感染后不同时间点HBsAg、HBeAg的表达以及HBV DNA的复制。HBV感染后24小时予以HCV-JFH1感染,检测合并感染状态下HBV DNA以及HCV RNA的复制。结果：Western-blotting 结果表明Huh7.5.1-hNTCP细胞株可稳定表达HBV受体NTCP。HBV感染Huh7.5.1-hNTCP细胞后ELASA、qPCR结果显示：HBsAg、HBeAg、HBV DNA合成逐渐增加,并在第9天达峰。HBV/HCV合并感染Huh7.5.1-hNTCP细胞后,qPCR检测结果显示不同时间点HBV DNA、HCV RNA复制逐渐增加。结论:建立了Huh7.5.1-hNTCP细胞模型,该模型可被HBV/HCV合并感染。     

表达载脂蛋白E-增强型绿色荧光蛋白的细胞系支持感染性丙型肝炎病毒的组装

目的 探讨表达载脂蛋白E-增强型绿色荧光蛋白(apolipoprotein E-enhanced green fluorescence protein,apoE-EGFP)的细胞系是否支持感染性丙型肝炎病毒(HCV)颗粒的组装.方法 利用shRNA基因沉默技术建立apoE稳定下调的Huh7.5.1细胞系,然后通过基因工程技术在该细胞系中建立稳定表达apoE-EGFP融合蛋白的细胞系.将HCV RNA转染进入野生型细胞(Huh7.5.1细胞)、对照组sh-NT细胞(转导非靶向野生型细胞基因的shRNA质粒的细胞)、apoE下调的Huh7.5.1细胞(sh-apoE细胞)以及表达apoE-EGFP融合蛋白的sh-apoE细胞(apoE-EGFP细胞)中,收集病毒液;通过半数组织培养感染剂量(TCID50)方法检测释放到Huh7.5.1、sh-NT、sh-apoE和apoE EGFP细胞培养上清液中的HCV的滴度.利用免疫荧光技术检测apoE与HCV的结构蛋白E2的相互作用,利用蛋白质印迹法检测用具有特异亲和性FLAG-gel纯化的HCV颗粒表面的apoE-EGFP的表达.结果 apoE-EGFP融合蛋白在apoE-EGFP细胞系中高效表达;apoE-EGFP细胞来源的HCV的感染性与Huh7.5.1、sh-NT细胞相比差异无统计意义;在apoE-EGFP细胞系中,apoE-EGFP融合蛋白与HCV结构蛋白E2存在共定位,并且可以在HCV颗粒表面上检测到apoE-EGFP融合蛋白.结论 apoE-EGFP融合蛋白是HCV颗粒的组分,apoE-EGFP细胞系支持感染性HCV颗粒的组装.     

多配体聚糖结合蛋白1过表达增加低密度丙型肝炎病毒颗粒的产生

目的　探讨syntenin-1蛋白对丙型肝炎病毒（HCV）颗粒组装的影响。 方法　用免疫印迹法分析人原代肝细胞中syntenin-1的含量。用慢病毒转染质粒在人肝癌细胞系Huh7.5.1构建syntenin-1过表达细胞系和绿色荧光蛋白（GFP）过表达细胞系。采用电转法将HCV RNA转入细胞后,通过荧光素酶分析、免疫印迹分析和病毒滴度测定方法分别从RNA复制、病毒蛋白表达和感染性病毒颗粒的分泌方面检测syntenin-1过表达对HCV的影响。用密度梯度分析法检测HCV RNA和感染滴度在不同密度组份的分布情况。 结果　人原代肝细胞中syntenin-1含量与实验室常用的肝癌细胞系Huh7.5.1相比较高。Syntenin-1过表达不影响HCV RNA在宿主细胞中的复制;syntenin-1过表达细胞来源的HCV 病毒的感染性与Huh7.5.1细胞或GFP过表达细胞的对照组相比差异无统计意义;在syntenin-1过表达细胞培养上清液中的HCV感染性颗粒从主要集中在1.08～1.16 g/mL区域变为有部分转移到密度为1.01～1.02 g/mL的低密度区域。 结论　Syntenin-1过表达改变了HCV感染性颗粒的密度组份分布,从主要集中在1.08～1.16 g/mL区域变为有部分转移到密度为1.01～1.02 g/mL的低密度区域,在低密度区域出现了具有更高单位RNA感染能力的病毒颗粒。     

维拉帕米通过下调硫氧还蛋白互作蛋白的表达抑制丙型肝炎病毒感染

目的 探讨抗高血压药维拉帕米是否可通过下调宿主硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)的表达而抑制丙型肝炎病毒(HCV)的感染.方法 用不同浓度梯度的维拉帕米处理人肝癌细胞系Huh7.5.1,用qPCR和蛋白质印迹法检测TXNIP的表达.用维拉帕米处理Huh7.5.1细胞,同时加入细胞培养产生的HCV (HCVcc),48 h后检测HCVcc感染情况.用TXNIP siRNA转染Huh7.5.1细胞,检测下调TXNIP表达后,维拉帕米对HCVcc感染的影响;用TXNIP启动子调控的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因表达质粒(pTXNIP-EGFP)转染Huh7.5.1细胞,分析维拉帕米对TXNIP启动子转录活性的影响.结果 与对照孔相比,维拉帕米(100、200、400 μmol/L)可下调Huh7.5.1细胞中TXNIP的表达,并呈现浓度依赖性(P＜0.05);并可抑制HCVcc对Huh7.5.1细胞的感染,且浓度越高抑制作用越明显(P＜0.05).进一步研究结果显示,与对照组相比,维拉帕米能够抑制pTXNIP-EGFP转染细胞中EGFP的表达水平(P＜0.05).结论 维拉帕米可下调TXNIP的表达从而抑制HCV感染,这可能是通过抑制TXNIP启动子的转录活性来实现的.     

人SR-BI基因表达抑制慢病毒载体构建及其稳定细胞株的筛选

目的 建立SR-BI表达抑制的肝癌细胞系,以作为研究SR-BI基因突变对HCV感染性影响的细胞模型.方法 构建SR-BI短发夹状RNA(Short hairpin RNA,shRNA)慢病毒重组质粒Lv-SR-BI-shRNA,挑取克隆进行PCR扩增和序列测定;将阳性重组质粒与慢病毒辅助质粒共转染HEK2973T细胞,包装SR-BI shRNA慢病毒并进行病毒滴度测定.SR-BI shRNA慢病毒感染人肝癌细胞株Huh7和Huh7.5.1细胞,嘌呤霉素筛选,Real-time PCR和Western blot法检测SR-BI mRNA转录和蛋白表达.结果 测序结果证实Lv-SR-BI-shRNA慢病毒载体构建成功并获得HEK293T细胞中包装的慢病毒,Lv-SR-BI-shRNA重组慢病毒感染Huh7和Huh7.5.1细胞,感染组SR-BI mRNA转录降低,蛋白表达降低.结论 建立了SR-BI表达抑制的人肝癌细胞株Huh7-siSR-BI和Huh7.5.1-siSR-BI稳定细胞系.     

RNA编辑酶ADAR1在Huh7.5.1细胞中抑制HCV复制的研究

目的：探究干扰素在Huh7.5.1细胞中对RNA编辑酶（adenosine deaminases acting on RNA 1,ADAR1）表达的影响,以及ADAR1对丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）复制的调控作用。方法：干扰素（IFN-α,30 IU/mL）刺激Huh7.5.1细胞后,利用real-time PCR和Western blot检测ADAR1表达水平的变化,同时HCV以一定滴度（0.2 MOI）感染Huh7.5.1细胞,观察IFN-α对HCV复制的影响;利用siRNA降低ADAR1表达,过表达质粒（ADAR1 p110和p150）增加ADAR1表达,并进一步利用基因编辑技术建立ADAR1稳定敲除细胞株,明确ADAR1与HCV的复制关系。结果：IFN-α诱导Huh7.5.1细胞ADAR1 p150表达（48 h：t=10.400,P=0.007;72 h：t=19.390,P=0.002）,而不影响ADAR1 p110表达（48 h：t=0.806,P=0.472;72 h：t=1.929,P=0.133）,同时IFN-α可显著抑制HCV复制（48 h：t=10.170,P=0.001;72 h：t=35.810,P=0.000）。ADAR1 p110和p150过表达48 h后,HCV病毒核酸和蛋白水平均明显低于空白对照（P=0.004,P=0.015）;ADAR1 siRNA干扰后,HCV复制增加了2倍以上,差异显著（t=13.530,P=0.000）;利用Crispr-cas9技术敲除掉Huh7.5.1中的ADAR1后,HCV复制也明显增加（t=5.259,P=0.023）;ADAR1干扰后IFN-α仍然存在对HCV明显的抑制作用（t=9.146,P=0.001）。结论：IFN诱导蛋白ADAR1可以抑制HCV复制,且ADAR1部分介导了IFN-α对HCV复制的抑制。     

肝癌细胞乙酰胆碱酯酶表达水平与丙型肝炎病毒感染之间的相互影响

目的 探讨丙型肝炎病毒（HCV）感染对乙酰胆碱酯酶（AchE）表达水平的影响以及细胞内AchE活性的变化对HCV感染的影响。方法 以细胞培养来源的HCV（HCVcc）感染人肝癌细胞系Huh7细胞,用蛋白质印迹法以及实时荧光定量PCR（qPCR）进一步验证HCV感染对AchE表达水平的影响,AchE活性检测试剂盒检测细胞内AchE活性的变化。以AchE抑制剂多奈哌齐和伊托必利处理Huh7细胞,同时用HCVcc感染,通过蛋白质印迹法以及免疫荧光法检测Huh7细胞的HCV感染情况。用针对AchE基因的小干扰RNA（siRNA）转染Huh7细胞,随后用HCVcc感染Huh7细胞,通过蛋白质印迹法和免疫荧光法检测AchE的表达以及HCV感染情况。结果 HCVcc感染Huh7细胞60 h后,AchE蛋白表达水平升高,同时酶活性也增强（P均<0.01）。AchE抑制剂呈浓度依赖性抑制HCV对Huh7细胞的感染（P<0.01）。用siRNA敲低AchE的表达后,HCV对Huh7细胞的感染降低（P<0.01）。结论 HCV感染Huh7细胞能上调AchE的表达并增强AchE活性,AchE表达增加和活性增强都能促进HCV的感染,表明AchE在HCV感染Huh7细胞的过程中起着正反馈增强感染的作用。     

维生素E脂质体纳米颗粒转运siRNA抑制丙型肝炎病毒核心蛋白表达的实验研究

目的 研究携带针对丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)RNA的小干扰RNA(siRNA)的维生素E(Vitamin E)脂质体纳米颗粒在体外靶向抑制HCV复制的作用.方法采取“薄膜水化法”制备Vitamin E脂质体纳米颗粒,应用激光粒度分析仪测量纳米颗粒VE-DC/siRNA的颗粒大小及zeta电位,应用透射电子显微镜观察VE-DC形态及分散性.以Huh7.5.1细胞株作为载体.CCK-8法检测纳米颗粒的细胞毒性,琼脂糖凝胶电泳检测纳米颗粒携带siRNA的血清稳定性,蛋白印迹技术和免疫荧光技术检测该siRNA纳米颗粒的转染效率及对HCV的抑制作用.结果 Vitamin E脂质体纳米颗粒形态呈球形,粒度分布为(125.5-9.0)nm,zeta电位为(39.1±4.8)mV,分散均一.相较同浓度商品化脂质体,VE-DC/siRNA对细胞的毒性相对较小.血清稳定性实验显示,VE-DC/siRNA在24 h后siRNA无降解,较裸siRNA稳定性显著提高.携带siRNA的Vitamin E脂质体纳米颗粒可以较高效率进入Huh7.5.1细胞内,并抑制HCV核心蛋白的表达.结论 Vitamin E脂质体纳米颗粒可以转运siRNA至Huh7.5.1细胞,并抑制HCV核心蛋白的表达.     

慢病毒介导的TSPY1对肝癌SMMC7721和Huh7细胞系增殖的影响

目的：观察转染睾丸特异性蛋白1（ TSPY1）慢病毒表达载体对肝癌细胞SMMC7721和Huh7细胞系增殖能力的影响。方法构建特异性的TSPY1慢病毒过表达载体稳定转染至SMMC7721和Huh7肝癌细胞系,采用荧光定量PCR和蛋白印迹技术检测TSPY1 mRNA和蛋白的表达情况,Cell Counting Kit-8（CCK-8）实验检测转染后细胞的增殖情况。结果在转染过表达TSPY1慢病毒的SMMC7721和 Huh7细胞中, TSPY1 mRNA和蛋白的表达均明显上调（ P＜0.01）。 CCK-8细胞增殖实验发现,过表达TSPY1组SMMC7721和Huh7细胞的增殖能力比对照组增强。结论 TSPY1慢病毒表达载体可明显上调TSPY1 mRNA和蛋白表达,并能够促进肝癌SMMC7721和Huh7细胞的增殖。     

丙型肝炎病毒1b基因型C区氨基酸70替代对细胞凋亡的影响

目的 探讨丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV） 1b基因型（genotype 1b,GT-1b）C区氨基酸（amino acid,AA） 70替代对细胞凋亡的影响.方法 利用前期构建的HCV GT-1b C区aa70野生型和变异型核心蛋白表达质粒瞬时转染体外培养肝瘤细胞系,采用PCR芯片检测细胞凋亡相关基因的表达,并以Annexin-V FITC/PI双染色法检测细胞凋亡率.结果 与野生型核心蛋白相比,转染表达变异型核心蛋白可使Huh7细胞84个凋亡相关基因中40个表达相对增强,44个表达相对减弱,但相差倍数均在3倍以内.HepG2细胞转染野生型和变异型核心蛋白表达质粒后,细胞凋亡率分别为9.4％±1.9％、9.1％±2.2％,低于空白载体对照组的14.3％±1.4％;以抗Fas抗体处理后,细胞凋亡率增高（52.4％±2.9％、56.1％±2.5％）,但仍明显低于空白载体对照组的72.6％±2.1％.结论 HCV核心蛋白表达可抑制细胞凋亡,但核心蛋白单纯R70Q/H变异并不足引起细胞凋亡相关基因表达及凋亡率的显著不同.     

环孢素A抑制丙型肝炎病毒JFH-1复制的实验研究

目的 探讨环孢素A(cyclosporine A,CsA)对全基因组丙型肝炎病毒JFH-1(hepatitis C virus,HCV JFH-1)在肝细胞中复制的影响.方法 以体外转录的HCV JFH-1 RNA转染Huh7细胞,制备含HCV病毒颗粒的感染上清,建立全基因组HCV JFH-1感染Huh7细胞模型,分为...     

丙型肝炎病毒1b基因型C区氨基酸70替代对干扰素刺激应答元件的影响

目的 探讨丙型肝炎病毒（hepatitis C Virus,HCV） 1b基因型（genotype 1b,GT-1b）C区氨基酸（amino acid,aa）70替代对干扰素刺激应答元件（interferon-stimulated response element,ISRE）的影响.方法 首先构建HCV GT-1b C区aa70野生型和变异型核心蛋白表达质粒,测序鉴定后瞬时转染肝瘤细胞系Huh7细胞,Western blot法鉴定HCV核心蛋白的成功表达;然后利用ISRE双荧光素酶报告基因实验检测核心蛋白表达对ISRE活化的影响,并以SYBR Green real-time PCR检测3种主要干扰素刺激基因（interferon stimulated genes,ISGs）的表达情况.结果 构建了HCV aa70野生型和变异型核心蛋白表达质粒,并在体外培养细胞中成功表达.但野生型和变异型核心蛋白表达对ISRE活化及3种主要ISGs表达的影响无明显差异.结论 单纯R70Q/H变异的核心蛋白似乎并不足以直接导致IFNα耐药.     

miR-150-5p与NCAPG的靶向关系及其对肝细胞肝癌Huh7细胞的抑制作用

目的：探究miR-150-5p与非SMC凝聚体Ⅰ复合物亚基G (NCAPG)的靶向关系及其对肝细胞肝癌(HCC)细胞生物学功能的影响,为HCC的临床诊断和治疗提供潜在靶点。方法：通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-150-5p与NCAPG的靶向关系。将HCC Huh7细胞根据转染质粒不同分为模拟物阴性对照(mimic NC)组、miR-150-5p模拟物(miR-150-5p mimic)组、miR-150-5p模拟物+过表达阴性对照(miR-150-5pmimic+ovNC)组和miR-150-5p模拟物+过表达NCAPG(miR-150-5p mimic+ovNCAPG)组。实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测各组细胞中NCAPG mRNA表达水平,Western blotting法检测各组细胞中NCAPG蛋白表达水平,5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷(EdU)实验检测各组细胞EdU阳性率,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Transwell实验检测各组细胞中迁移和侵袭细胞数。将裸鼠分为agomiR-NC组、agomiR-150-5p组、agomiR-150-5p+过表达阴性...