siRNA下调星形胶质细胞中PTEN表达对缺氧复氧诱导细胞凋亡影响

目的研究siRNA下调星形胶质细胞中第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)表达对缺氧复氧诱导的细胞凋亡影响。方法分离培养乳鼠星形胶质细胞,用携带PTEN siRNA的慢病毒载体感染星形胶质细胞,经缺氧复氧处理后,用Real time PCR和Western blot检测细胞中PTEN表达变化。MTT测定细胞增殖活力,二硝基苯肼比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出率,流式细胞术测定周期和凋亡变化,Western blot检测细胞中细胞周期依赖性蛋白激酶4(Cdk4)、p21蛋白水平和胞质中细胞色素C(Cytochrome C)蛋白水平,JC-1法测定线粒体膜电位。结果携带PTEN siRNA的慢病毒载体感染后的星形胶质细胞中PTEN表达水平降低。缺氧复氧处理后的星形胶质细胞活力降低,细胞LDH漏出率升高,细胞凋亡率升高,细胞G1期比例升高,Cdk4蛋白水平降低,p21蛋白水平升高,胞质中Cytochrome C蛋白增多,线粒体膜电位降低。敲低PTEN可以提高缺氧复氧条件下星形胶质细胞活力,降低细胞LDH漏出率,减少G1期细胞比例,降低细胞凋亡率,促进细胞表达Cdk4蛋白,减少细胞表达p21,减少胞质中Cytochrome C蛋白,提高线粒体膜电位。结论敲低PTEN可以减少缺氧复氧诱导的星形胶质细胞凋亡,作用机制与线粒体凋亡途径有关。     

PINK1介导缺氧损伤时星形胶质细胞对神经元的保护作用

目的探究星形胶质细胞内PTEN诱导假定激酶1(PINK1)缺失对缺血时神经保护作用的影响及其作用机制。方法离体培养原代星形胶质细胞,使用小干扰RNA(si RNA)沉默PINK1表达,氧糖剥夺(OGD)建立细胞缺氧模型,分为4组:PINK1沉默组(si RNA+转染剂)、空质粒组(空质粒+转染剂)、转染剂组(只加转染剂)和对照组(星形胶质细胞),各组均与神经元共培养;另设立神经元单独培养组。免疫荧光染色观察神经元凋亡情况。定量PCR及ELISA检测星形胶质细胞促红细胞生成素(EPO)及血管内皮生长因子(VEGF)表达量;Western blot检测星形胶质细胞内缺血诱导因子(HIF)及核因子κB(NF-κB)通路相关蛋白水平。结果 OGD损伤后神经元凋亡率较高,与星形胶质细胞共培养后神经元凋亡率显著降低(P0.05)。PINK1基因沉默后共培养神经元凋亡增加,星形胶质细胞EPO及VEGF分泌量减少、胞内EPO及VEGF转录水平降低(P0.05);HIF-1、HIF-2与NF-κB通路活化水平均显著降低(P0.05)。结论星形胶质细胞对OGD损伤神经元有保护作用,其作用通过EPO及VEGF实现;PINK1基因沉默后星形胶质细胞对缺血神经元保护作用减弱,可能与NF-κB通路活化水平降低、HIF激活受损进而下调EPO和VEGF表达量有关。     

Omi/HtrA2在无镁外液致痫海马神经元凋亡中的作用机制及其特异性抑制剂UCF-101的神经元保护作用

目的观察线粒体丝氨酸蛋白酶Omi/Htra2在体外颞叶癫痫模型中神经元凋亡方面发挥的作用及其机制,以及其特异性抑制剂UCF-101对痫性损伤神经元的保护作用。方法原代培养新生24 h内的SD大鼠海马神经元至10 d,随机分成对照组、无镁细胞外液处理后3 h组、8 h组以及24 h组,观察细胞形态学特征,采用免疫蛋白印迹法观察海马神经元中Omi/Htra2蛋白的表达变化;再随机将神经元分为对照组、无镁细胞外液处理后24 h组、UCF-101处理组以及DMSO组,采用TUNEL法检测各组神经元凋亡,免疫蛋白印迹法观察神经元XIAP、caspase3、HAX-1蛋白的表达变化。结果随着无镁外液作用时间的延长,Omi/Htra2在线粒体中的含量逐渐减少,胞浆中含量逐渐增多。与正常对照组相比,致痫24 h后神经元凋亡数目以及caspase3蛋白表达显著增多(P<0.05),且HAX-1蛋白表达下降(P<0.05),而XIAP蛋白的表达正常对照组与模型组相比无统计学差异。与致痫24 h组相比,UCF-101处理组神经元凋亡细胞数和caspase3的表达均明显减少(P<0.05),XIAP及HAX-1蛋白表达增多(P<0.05),DMSO组神经元凋亡细胞数、上述蛋白表达方面与致痫24 h组无明显差异(P>0.05)。结论神经元遭到无镁细胞外液作用后,Omi/Htra2从线粒体移位到了胞浆,其特异性抑制剂UCF-101能有效抑制神经元凋亡,下调神经元caspase3蛋白的表达,上调XIAP、HAX-1蛋白的表达,发挥神经元保护作用。     

低氧预处理激活神经元细胞JAK/STAT并促进血管内皮生长因子受体-2的表达

目的研究低氧预处理对神经元细胞Janus激酶(JAK)/信号转导和转录激活因子(STAT)信号通路以及血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)表达的影响。方法将培养的小鼠神经元细胞分为细胞对照组、细胞类缺血组和细胞低氧预处理组,细胞类缺血组细胞经95%NO2+5%CO2混合气体处理30min,细胞低氧预处理组细胞于89%N2、l%O2和10%CO2环境中处理8次,每次20min,2d后进行类缺血处理。定量分析各组细胞中VEGFR-2、JAK及STAT蛋白磷酸化(p-STAT)的表达变化。细胞转染JAK特异性小干扰RNA(siRNA),之后进行低氧预处理和类缺血处理,检测p-STAT和VEGFR-2的表达。另取45只BALB/c小鼠分为动物对照组(n=8)、动物对照+血管内皮生长因子(VEGF)组(n=7)、动物脑缺血组(n=8)、动物脑缺血+VEGF组(n=7)、动物低氧预处理组(n=8)和动物低氧预处理+VEGF组(n=7),分析各组海马神经元细胞pSTAT和VEGFR-2的表达,并检测细胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase 3)的活化情况。结果与细胞对照组相比较,细胞类缺血组细胞中VEGFR-2mRNA表达显著下调(P0.05);与细胞类缺血组相比,细胞低氧预处理组细胞VEGFR-2mRNA表达上调(P0.05),并促进JAK mRNA和蛋白的表达(P0.05)以及STAT蛋白的活化(P0.05)。与非特异性转染组相比,JAK沉默组细胞p-STAT和VEGFR-2的表达显著降低(均P0.05)。在小鼠体内,脑缺血降低p-STAT和VEGFR-2的表达(P0.05),而低氧预处理则可有效逆转缺氧对p-STAT和VEGFR-2的抑制(P0.05)。与动物脑缺血+VEGF组相比,动物低氧预处理+VEGF干预可显著抑制caspase3的活化(P0.05)。结论低氧预处理可以激活神经元细胞JAK/STAT信号通路并诱导VEGFR-2的表达,并增强VEGF的神经保护作用。     

RWD结构小泛素化增强子与缺氧诱导因子-1α在AtT-20细胞的表达

目的研究RWD结构小泛素化增强子(RWD containing sumoylation enhancer,RSUME)调控缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor 1-alpha,HIF-1α)对At T-20细胞侵袭的影响。方法通过氯化钴模拟小鼠垂体腺瘤At T-20细胞的缺氧环境,并应用实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测RSUME、HIF-1α的m RNA和蛋白水平的改变;然后运用HIF-1α小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)及阴性对照序列转染小鼠垂体腺瘤At T-20细胞,实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测RSUME的m RNA和蛋白水平的改变;运用RSUME si RNA及阴性对照序列转染小鼠垂体腺瘤At T-20细胞后,实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测HIF-1α的m RNA和蛋白水平的改变;并用Transwell及MTT法检测At T-20细胞侵袭的改变。结果氯化钴作用At T-20细胞后,细胞中RSUME的蛋白(P=0.003)和HIF-1α的蛋白(P=0.002)水平明显升高;HIF-1αsi RNA转染的At T-20细胞中RSUME m RNA(P=0.162)及蛋白(P=0.668)水平表达无明显变化;RSUME si RNA转染的At T-20细胞中HIF-1α蛋白水平表达明显降低(P0.001),而m RNA水平未见明显改变(P=0.136);RSUME si RNA转染组At T-20细胞侵袭率较RSUME阴性对照组及空白对照组低(侵袭抑制率=26.2%±8.4%)。结论缺氧可诱导RSUME的表达,RSUME可调控HIF-1α的蛋白水平的作用影响At T-20细胞的侵袭。     

去铁敏预处理对神经元缺氧性损伤的保护作用

目的 探讨去铁敏预处理对体内外神经元缺氧损伤的保护作用及可能机制.方法 体外培养皮质神经元,建立神经元去铁敏糖氧剥夺模型,采用细胞活力测定、细胞凋亡比率、形态学改变评价去铁敏预处理后的神经元保护效应.去铁敏预处理后不同时间点制作大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型,采用神经功能评分和梗死体积评价去铁敏预处理后的脑保护效应.用免疫荧光染色检测去铁敏预处理后神经元的缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)和促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)蛋白表达情况,RT-PCR检测HIF-1α和EPO的mRNA变化情况.结果 去铁敏预处理后再给予缺氧损伤后神经元活力下降至49%(无预处理组25%,t=8.544,P<0.05),凋亡细胞百分比为38%(无预处理组30%,t=4.409,P<0.05),预处理后细胞形态保持良好.去铁敏30 ms/kg预处理后第3天行MCAO手术,大鼠神经功能评分降低,梗死体积缩小8.5%.去铁敏100 mg/kg预处理后第2、3、7天行MCAO手术,与生理盐水组(8.13±0.17)相比,神经功能评分分别下降为7.44±0.39(t=2.903,P<0.05)、5.60±0.47(t=10.143,P<0.01)、6.97±0.73(t=3.142,P<0.05),脑梗死体积分别缩小12.0%(t=5.056,P<0.05)、32.3%(t=10.993,P<0.01)、10.6%(t=4.385,P<0.05).免疫荧光染色显示:体外培养的皮质神经元在预处理后出现HIF-1α和EPO蛋白表达,大鼠预处理后脑内神经元也出现HIF-1α和EPO蛋白表达上调.RT-PCR显示去铁敏化学缺氧能上调体外培养的神经元HIF-1α及EPO mRNA表达.结论 去铁敏预处理有确切有效的抗缺氧保护效应,这种效应与保护神经元有关,其机制可能是去铁敏诱导了神经元HIF-1α和EPO的表达增加.     

H2S对缺血再灌注神经元的保护作用及机制

目的研究H2S对缺血再灌注损伤后神经元存活信号转导通路ERK1／2／P^90RSK的影响。方法将培养7d的海马神经元随机分为5组：正常培养组（C组）、缺血再灌注组（I/R组）、缺血再灌注＋NaHS组fNaHS组）、缺血再灌注＋NaHS＋U-0126（ERK抑制剂1组（U组）、缺血再灌注＋NaHS＋Rapamycin（RS6K抑制剂）组（R组）。C组神经元按正常培养方法培养。NaHS组神经元在神经元进行缺血再灌注时加入NaHS使其终浓度为150μmol／L。U组和R组在加入150μmol／LNaHS的同时分别加入U-012610μmol／L或Rapamycin 10nmol/L.各组行细胞存活力、神经元凋亡、cAMP、磷酸化ERK1／2（PERK1／2）和磷酸化P^90RSK（PP^90RSK]蛋白表达的检测。结果NaHS显著增加了cAMP的浓度（与FR组比较，P〈0.01）、PERK1／2蛋白（与FR组比较，P〈0.05）和PP^90rks蛋白（与I/R组比较，P〈0.05）表达，同时增加了神经元存活率（与I/R组比较，P〈0．05）、降低了神经元凋亡率（与隙组比较，P〈0．05）；U-0126抑制了PERK1／2蛋白（与NaHS组比较，P〈0.05）和PP^90RSK蛋白（与NaHS组比较，P〈0.05）表达同时使神经元存活率降低（与NaHS组比较，P〈0.05）、神经元凋亡率升高（与NaHS组比较，P〈0.05）；Rapamycin抑制了PP^90RSK蛋白（与NaHS组比较，P〈0.05）表达同时使神经元存活率降低（与NaHS组比较，P〈0．05）、神经元凋亡率升高（与NaHS组比较，P〈0．051而不影响PERK1／2的表达（与NaHS组比较，P〉0.05）。结论H2S通过cAMP激活了ERK1／2／P^90RKS信号通路，在海马神经元缺血再灌注时抑制了神经元的凋亡，保护了神经元。     

人参皂苷Rb1对癫痫大鼠海马组织线粒体的保护作用和机制探讨

目的探讨人参皂苷Rb1对戌四氮(PTZ)致痫大鼠海马线粒体结构和功能的作用及机制。方法采用PTZ 40mg·kg~(-1)·d~(-1)腹腔注射制备癫痫动物模型,绐予人参皂苷Rb1低剂量20mg·kg~(-1)·d~(-1)和高剂量80mg·kg~(-1)·d~(-1)连续干预30d后,分别检测海马组织中细胞内活性氧(ROS)和线粒体膜电位(△Ψm)的水平,MDA和SOD的含量,及胞质中Cytochrome c和Caspase3的表达,并观察海马CA1区线粒体的超微结构。结果与对照组相比,模型组大鼠海马中ROS水平升高,△Ψm水平降低(P0.01);MDA含量升高,SOD活性减低(P0.01),胞质中Cytochrome c和Caspase3的表达亦相应增加(P0.05),且线粒体结构明显空泡化;而人参皂苷Rb1干预组剂量依赖性逆转了上述指标的异常改变。结论人参皂苷Rb1可挽救致痫大鼠海马组织中线粒体继发损伤,其机制可能与抗氧化、抗凋亡有关。     

MCPG在神经元氧糖剥夺模型中的抗凋亡作用

目的通过神经元氧糖剥夺模型研究Ⅰ组代谢型谷氨酸受体拮抗剂α-甲基-4-羧苯基甘氨酸（MCPG）对神经元损伤的保护作用,并初步探讨其机制。方法大鼠皮层神经元原代培养2w后,采用氧糖剥夺法建立损伤模型,通过乳酸脱氢酶（LDH）活性测定及碘化丙啶（PI）/Hoechst33342双染鉴定神经元损伤程度;加入Ⅰ组代谢型谷氨酸受体拮抗剂MCPG（1mmol/L）,通过脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）检测神经元凋亡情况,并采用蛋白印迹法研究凋亡相关因子caspase-3、细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）的表达变化,讨论MCPG抗凋亡作用与ERK1/2信号通路的关系。结果 MCPG能抑制ERK1/2信号通路的活化并降低凋亡相关因子caspase-3的表达,减轻氧糖剥夺造成的神经元凋亡。结论 MCPG能够通过ERK1/2信号通路减轻氧糖剥夺造成的神经元凋亡。     

亚低温对培养神经细胞缺氧状态下保护作用的研究

目的:亚低温对体外培养神经细胞缺氧下的保护机制。方法:培养大鼠脑皮质神经元,分低温组(３４℃)及常温组(３７℃),缺氧相应时段观测细胞形态、细胞存活率、细胞活力,缺氧后４ｈ的细胞电镜观察线粒体。结果:亚低温组各项指标均优于常温组(Ｐ＜０．０５)。结论:亚低温延迟缺氧级联反应的过程,机制与降低细胞代谢水平及对线粒体的保护有关。     

Dickkopf-1在脑出血大鼠神经元凋亡中的作用及机制研究

目的探讨Dickkopf-1(DKK-1)在脑出血大鼠神经元凋亡中的作用及机制。方法采用随机数字法将40只成年雄性SD大鼠分成对照组(n=13)、假手术组(n=13)及脑出血组(n=14)。通过颅内注射自体外周血制作脑出血模型。采用平衡木行走实验和肌力测验进行脑出血模型评估,并利用Real-time PCR和Western blot检测大鼠脑组织中Bcl-2、Bax、p-Akt、Akt及DKK-1蛋白和mRNA表达水平。分离培养原代大鼠皮质神经元,分为对照组、空载体组、DKK-1过表达组、BTBD10(Akt磷酸化激活剂)过表达组,检测细胞中DKK-1表达水平和Akt磷酸化水平,利用流式细胞术检测各组细胞凋亡。结果脑出血组大鼠平衡木行走得分高于对照组和假手术组(P0.05),而肌力测验评分低于对照组和假手术组(P0.05)。与对照组和假手术组比较,大鼠脑出血部位脑组织Bcl-2表达降低(P0.05),而Bax表达则升高(P0.05),p-Akt表达水平下降(P0.05),DKK-1表达水平上升(P0.05)。DKK-1过表达组神经元凋亡率及p-Akt表达水平均高于空载体组和对照组(均P0.05)。Akt磷酸化激活剂BTBD10过表达组p-Akt水平、Bcl-2蛋白表达高于对照组和空载体组,而Bax蛋白表达则低于对照组和空载体组。BTBD10过表达组神经元存活率高于对照组和空载体组(均P0.05),且BTBD10和DKK-1共转染组大鼠神经元存活率高于DKK-1转染组(P0.05)。结论 DKK-1可能通过抑制Akt的磷酸化促进出血性脑卒中大鼠神经元的凋亡。     

肌萎缩侧索硬化症相关基因VAPB对皮质神经元存活及突触蛋白表达的影响

目的探讨肌萎缩侧索硬化症(ALS)致病基因VAPB P56S突变对原代培养皮质神经元的细胞活性及突触蛋白表达的影响。方法以非转基因(nTg)和VAPB P56S转基因(P56S Tg)新生小鼠为细胞来源,体外培养皮质神经元10d和20d后,分别利用MTT法和Western blot法检测皮质神经元存活率以及突触蛋白表达水平。结果与nTg小鼠的皮质神经元比较,VAPB P56S转基因小鼠的皮质神经元在体外培养20d时细胞活力显著降低(P0.0001),而在体外培养10d时无明显差异(P=0.5140),但突触囊泡膜蛋白SV2C(P0.0001)、突触囊泡结合蛋白VAMP2(P=0.0047)、突触小体相关蛋白SNAP25(P0.0001)和突触后致密蛋白PSD95(P0.0001)表达水平均显著降低。结论 VAPB P56S降低原代皮质神经元活性,并在神经元变性死亡前即损害突触结构和功能相关蛋白的表达。     

siRNA沉默USP22基因对胶质瘤细胞增殖的抑制作用

目的探讨小干扰RNA(si RNA)沉默泛素特异性肽酶22(ubiquitin specific protease 22,USP22)对胶质瘤细胞增殖的影响和作用机制。方法合成USP22 si RNA及阴性对照si RNA(control si RNA),用脂质体Lipofectamine 2000转染至人胶质瘤U87和U251细胞,分别设为实验组和阴性对照组。通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测两组胶质瘤细胞USP22 mRNA和蛋白表达水平的变化。采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)检测USP22 si RNA对两组胶质瘤细胞的增殖抑制率。流式细胞术定量检测USP22 si RNA对胶质瘤细胞凋亡及细胞周期分布的影响。Western blot检测胶质瘤细胞凋亡蛋白和周期调控蛋白的表达。结果与阴性对照组比较,实验组胶质瘤细胞中USP22 mRNA和蛋白表达显著下降(P0.05),细胞增殖明显受到抑制(P0.05),凋亡率明显上升(P0.05),细胞周期中G2/M期的细胞比例明显增高(P0.05)。Western blot结果显示:细胞凋亡蛋白Procaspase-3、Procaspase-8、Procaspase-9表达明显下降(P0.05);细胞周期蛋白CDK1、CDK2、Cyclin B1表达水平明显下降(P0.05),Cyclin D1表达水平无明显变化(P0.05)。结论 USP22基因在胶质瘤细胞的增殖中发挥重要作用,其机制可能为调节细胞凋亡和细胞周期。     

白藜芦醇通过SIRT1/AMPK信号通路减轻MPTP诱导的小鼠多巴胺能神经元丢失

目的观察白藜芦醇(RV)对帕金森病(PD)小鼠的神经保护作用,并探索其发挥神经保护作用的可能机制。方法将48只小鼠随机分为CON组、MPTP组、RV+MPTP组和EX527+RV+MPTP组,每组12只。腹腔注射MPTP建立PD小鼠模型,并给予RV灌胃、SIRT1特异性抑制剂EX257腹腔注射处理,利用免疫荧光、western blot等检测相关蛋白表达。结果给予RV后,与MPTP组相比,RV+MPTP组SIRT1蛋白表达显著增加(P0.001),p-AMPK蛋白水平显著升高(P0.01),Cleaved caspase 3蛋白水平显著下降(P0.01),小鼠黑质区TH阳性神经元丢失率明显降低,纹状体组织中TH蛋白表达显著增加(P0.01)。给予EX527后,阻断了RV的上述作用,p-AMPK蛋白水平显著降低(P0.01),Cleaved caspase 3显著升高(P0.01),小鼠黑质区TH阳性神经元丢失率明显升高,纹状体组织中TH蛋白表达显著下降(P0.001)。结论 RV可能通过激活SIRT1/AMPK信号通路,SIRT1与AMPK相互调控,减少MPTP小鼠黑质区多巴胺能神经元丢失。     

线粒体Miro1蛋白对无镁致痫海马神经元氧化应激损伤的保护作用

目的探讨线粒体Miro1蛋白在体外颞叶癫痫模型中氧化应激方面的保护作用及其机制。方法原代培养新生24h内的SD大鼠海马神经元,通过无镁细胞外液诱导体外癫痫模型。培养至14d的海马神经元随机分为对照组(CON)、无镁诱导组(AE)、无镁诱导+rAd转染组(AE+rAdv)、无镁诱导+rAd-Miro1转染组(AE+rAd-Miro1),CON组及AE组分别用正常细胞外液和无镁细胞外液作用3h后,更换为正常维持液,腺病毒转染组于无镁诱导48h前转染腺病毒,各组分别于造模后24h终止细胞培养,采用Western blot法检测细胞内Miro1、ND6的表达,免疫荧光法检测细胞内ND6表达,比色法测定MDA、GSH的表达。结果与CON组比较,AE组Miro1表达升高,ND6表达降低,MDA表达升高,GSH表达降低,差异均具有统计学意义(P0.05);与AE组比较,AE+rAdv组Miro1表达升高,ND6表达降低,MDA表达升高,GSH表达降低,差异均无统计学意义(P0.05);与AE组比较,AE+rAd-Miro1组Miro1、ND6表达升高,MDA表达降低,GSH表达升高,差异均具有统计学意义(P0.05)。结论线粒体蛋白Miro1对无镁致痫海马神经元有保护作用,其机制可能与降低线粒体氧化应激损伤,提高ND6、GSH蛋白表达,降低MDA蛋白表达有关。     

神经肽Y对小神经胶质细胞活化状态和生成IL-1β的影响

目的探讨神经肽Y(NPY)对原代小神经胶质细胞生物活性及生成IL-1β的影响。方法培养的原代大鼠皮层小胶质细胞,将细胞分为Control组、LPS组、NPY+LPS组、NPY组和BIBP3226+NPY+LPS组,每组3个样本,培养各组细胞6h。经免疫细胞化学荧光染色后,显微镜下观察小胶质细胞的形态学变化。Elisa方法检测培养液中IL-1β蛋白含量,RT-PCR方法检测小胶质细胞中IL-1βm RNA表达水平。结果孵育各组小胶质细胞6h后,LPS组培养液中IL-1β蛋白的含量及细胞中IL-1βm RNA表达水平分别为(961.00±83.50)pg/m L和5.59±0.87,显著高于Control组的96.33±24.58 pg/m L和1.05±0.12(P0.05),小胶质细胞处于活化状态;LPS+NPY组IL-1β蛋白含量和m RNA表达水平分别为(411.33±55.00)pg/m L和1.93±0.45,与LPS组相比显著降低(P0.05),小胶质细胞活化水平降低;IBP3226+NPY+LPS组IL-1β蛋白含量和m RNA表达水平分别为(886.00±97.53)pg/m L和4.51±0.71,与LPS+NPY组相比显著增高(P0.05);LPS组和IBP3226+NPY+LPS组之间无统计学意义。NPY组与对照组无统计学意义。结论 NPY通过作用于NPY Y1受体降低小神经胶质细胞的生物活性,抑制其生成IL-1β。     

体外癫痫模型海马神经元中线粒体衔接蛋白Miro1表达的改变及其意义

目的探讨体外癫痫模型海马神经元中线粒体衔接蛋白Miro1表达的改变及其意义。方法原代培养新生24 h内的SD大鼠海马神经元,通过无镁细胞外液诱导体外癫痫模型。培养至14 d的海马神经元随机分为对照组(CON组)、无镁诱导组(AE组)、AE+对照腺病毒组(AE+r Ad组)、AE+sh RNA腺病毒组(AE+r Ad-Miro1-sh RNA组)。CON组及AE组分别用正常细胞外液和无镁细胞外液作用3 h后,更换为正常维持液。AE+r Ad组、AE+r Ad-Miro1-sh RNA组分别于无镁诱导48 h前转染对照腺病毒、靶向大鼠Miro1基因的sh RNA重组腺病毒真核表达质粒。各组分别于造模后24 h终止细胞培养。采用Western blot法检测细胞内Miro1、ND6蛋白的表达,免疫荧光法检测细胞内ND6蛋白的表达,比色法测定丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)的蛋白浓度。结果与CON组比较,AE组、AE+r Adv组大鼠海马神经元Miro1表达明显升高,AE+r Ad-Miro1-sh RNA组大鼠海马神经元Miro1表达明显降低(均P0.05);AE组、AE+r Adv组、AE+r Ad-Miro1-sh RNA组大鼠海马神经元ND6表达及GSH蛋白浓度明显降低,MDA蛋白浓度明显升高(均P0.05)。AE+r Ad-Miro1-sh RNA组大鼠海马神经元Miro1、ND6表达及GSH蛋白浓度明显低于AE组和AE+r Adv组,MDA蛋白浓度明显高于AE组和AE+r Adv组(均P0.05)。结论线粒体衔接蛋白Miro1可能对无镁致痫海马神经元有保护作用。抑制线粒体Miro1蛋白表达后,ND6、GSH蛋白表达减少,MDA蛋白表达增加,加重线粒体氧化应激损伤。     

大鼠蛛网膜下腔出血后细胞外调节蛋白激酶1/2激活介导海马区神经细胞自噬

目的探讨大鼠蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)后海马区细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases,ERK1/2)激活与神经细胞自噬的关系。方法 120只雄性SD大鼠随机分成假手术组、SAH组、ERK1/2抑制剂U0126组、自噬诱导剂雷帕霉素(rapamycin,Rap)组。采用枕大池二次注血法制作SAH大鼠模型;U0126组和Rap组分别于造模前30min侧脑室注射U0126(5μg/μL)和Rap(10nmol/μL)。光镜观察海马区神经细胞形态结构;免疫组化法和实时荧光定量PCR法检测海马区磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、ERK1/2 mRNA和自噬标志蛋白(Beclin-1和Beclin-1mRNA、LC3-Ⅱ和LC3mRNA)表达水平。结果与假手术组比较,SAH组神经细胞死亡率增加(14.9%±5.7%,28.3%±9.8%,44.2%±10.9%)(q值依次为27.56、35.65、44.81;均P0.05),ERK1/2 mRNA、Beclin-1 mRNA和LC3 mRNA水平增加(1.83±0.01,2.82±0.06,1.34±0.04;1.46±0.02,1.76±0.02,1.35±0.02;1.52±0.04,1.89±0.01,1.31±0.04)(q值依次为42.99、60.66、48.08,71.26、72.46、49.50,48.49、82.40、41.18;均P0.05),p-ERK1/2、Beclin-1和LC3–Ⅱ蛋白水平增加(均P0.05);与SAH组比较,U0126组神经细胞死亡率增加(19.6±6.5%,36.2±7.7%,58.2±12.7%)(q值依次为9.59、10.43、14.66;均P0.05),U0126组ERK1/2 mRNA、Beclin-1 mRNA和LC3 mRNA表达降低(1.23±0.02,1.40±0.02,1.12±0.02;1.22±0.04,1.48±0.06,1.24±0.03;1.34±0.04,1.33±0.02,1.14±0.04)(q值依次为75.66、65.35、31.11,37.18、26.70、15.56,16.79、51.85、22.58;P0.05),p-ERK1/2、Beclin-1和LC3–Ⅱ蛋白水平降低(P0.05);与SAH组比较,Rap组神经细胞死亡率降低(9.1%±4.6%,18.8%±8.6%,28.21%±9.2%)(q值依次为11.86、12.54、16.74;均P0.05),Rap组Beclin-1mRNA和LC3mRNA增加(1.78±0.02,2.27±0.05,1.86±0.04;1.97±0.06,2.31±0.08,1.85±0.00)(q值依次为49.57、48.63、72.12、41.96、38.88、71.73;P0.05),Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白增加(P0.05),ERK1/2 mRNA变化差异无统计学意义(q值依次为2.63、2.65、2.83,P0.05),p-ERK1/2蛋白变化差异无统计学意义(P0.05)。结论 SAH后激活的ERK1/2激活,可促进Beclin-1和LC3-Ⅱ表达介导神经细胞丢失。     

CircTLK1通过miR-424-5p/FBXO3轴对氧糖剥夺/复氧诱导的神经细胞损伤的影响

目的 探讨环状RNA TLK1(CircRNA TLK1,CircTLK1)对氧糖剥夺/复氧(Oxygen glucose deprivation/Reoxygenation,OGD/R)诱导的神经元HT22损伤的影响以及对微小RNA(microRNA,miR)-424-5p/F-box蛋白3(F-box protein 3,FBXO3)的调控作用。方法 将HT22细胞分为对照组、OGD/R组、sh-NC组、沉默环状RNA TLK1(Silencing circular RNA tlk1,sh-circTLK1)组、sh-circTLK1+抑制剂NC组、sh-circTLK1+miR-424-5p抑制剂组、sh-circTLK1+miR-424-5p抑制剂+sh NC组、sh-circTLK1+miR-424-5p抑制剂+sh FBXO3组,除对照组外其余各组细胞均行OGD/R操作,细胞计数试剂盒8(Cell counting Kit 8,CCK-8)法测定HT22细胞活力; 脂连蛋白V-异硫氰酸荧光素(Adiponectin V-fluorescein isothiocyanate,Annexin V-FITC)细胞凋亡试剂盒测定HT22细胞凋亡; 测定HT22细胞乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)漏出率; 实时荧光定量聚合酶链反应(Real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-qRCR)法测定HT22细胞miR-424-5p,FBXO3 mRNA水平; 蛋白免疫印记法(Western Blot)检测B淋巴细胞瘤-2关联基因X(B lymphoma-2 gene association X,Bax)、活化半胱天冬酶-3(Cleaved caspase-3)、FBXO3水平; 双荧光素酶测定CircTLK1与miR-424-5p以及miR-424-5p与FBXO3靶向关系,并使用RNA下拉实验验证CircTLK1与miR-424-5p关系。结果 与对照组比较,OGD/R组miR-424-5p,HT22细胞活力降低(P<0.05),circTLK1,FBXO3 mRNA水平,HT22细胞凋亡率、Bax,Cleaved caspase-3水平、LDH漏出率升高(P<0.05); 与OGD/R组比较,sh-circTLK1组HT22细胞活力增加(P<0.05),HT22细胞凋亡率、Bax,Cleaved caspase-3水平,LDH漏出率降低(P<0.05); 与sh-circTLK1组比较,sh-circTLK1+miR-424-5p抑制剂组细胞活力降低(P<0.05),HT22细胞凋亡率、Bax,Cleaved caspase-3水平、LDH漏出率升高(P<0.05); 与sh-circTLK1+miR-424-5p抑制剂组比较,sh-circTLK1+miR-424-5p抑制剂+sh FBXO3组细胞活力升高(P<0.05),HT22细胞凋亡率、Bax,Cleaved caspase-3水平、LDH漏出率降低(P<0.05); CircTLK1与miR-424-5p以及miR-424-5p与FBXO3均存在靶向关系。结论 CircTLK1沉默可能通过调控miR-424-5p/FBXO3对OGD/R诱导的HT22细胞损伤来发挥保护作用。     

线粒体钙单向转运体在匹鲁卡品致痫大鼠海马神经损伤中的作用

目的研究线粒体钙单向转运体(mitochondrial calcium uniporter,MCU)在氯化锂-匹鲁卡品(pilocarpine,PILO)癫痫大鼠模型神经损伤中的作用。方法将84只雄性SD大鼠随机分成空白对照(CON)组、PILO组(2 h、8 h、24 h和72 h 4个亚组)、Ru360组和精胺(Spermine)组。观察各组大鼠行为学改变,并荧光染色法测定海马组织线粒体Ca~(2+)浓度,TUNEL染色检测海马CA3区神经元凋亡,并采用Western Blot法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cyt C和caspase-3表达变化。结果 (1)与CON组比较,PILO组海马神经元线粒体Ca~(2+)浓度明显升高,凋亡明显增加(P0.05);与CON组比较,PILO组海马Bax表达水平、线粒体Cyt C释放及caspase-3激活明显增多,而Bcl-2表达水平明显减少(P0.05)。(2)与PILO组比较,Ru360组海马神经元线粒体Ca~(2+)浓度明显降低,凋亡明显减少(P0.05);与PILO组比较,Ru360组海马Bax表达水平、线粒体Cyt C释放及caspase-3激活明显减少,而Bcl-2表达水平明显增多(P0.05)。(3)与PILO组比较,Spermine组海马神经元线粒体Ca~(2+)浓度明显升高,凋亡明显增加(P0.05);与PILO组比较,Spermine组海马Bax表达水平、线粒体Cyt C释放及caspase-3激活明显增多,而Bcl-2表达水平明显减少(P0.05)。结论 MCU在PILO癫痫大鼠海马神经损伤中发挥重要作用,抑制MCU可发挥对海马神经元凋亡的保护作用,其机制可能是通过抑制线粒体介导的细胞凋亡途径。