白藜芦醇对秀丽隐杆线虫寿命的影响及其初步机制研究

目的：探讨不同浓度白藜芦醇对秀丽隐杆线虫寿命的影响及其机制。方法：观察25、50、100 µmol·L-1白藜芦醇处理的秀丽隐杆线虫野生型N2与daf-2、daf-16突变体的寿命变化。结果：与对照组比较,25、50、100 µmol·L-1白藜芦醇处理均可以显著延长三种秀丽隐杆线虫的寿命。结论：白藜芦醇可以显著延长秀丽隐杆线虫的寿命,其对寿命的影响不依赖于DAF-2/胰岛素样信号传导通路。     

秀丽隐杆线虫中与衰老相关的DAF-2/IGF-1信号通路研究进展

衰老是诸多疾病发生的关键因素之一。目前,生物学界关于衰老遗传学的大部分知识和信息都来自于对秀丽隐杆线虫的研究。秀丽隐杆线虫在抗衰老研究中发挥着先锋和主力的作用。DAF-2/IGF-1信号通路是第一个为人类所认识的衰老基因调控机制。该文综述了秀丽隐杆线虫作为模式生物在DAF-2/IGF-1信号通路研究进程中的引领和推动作用,为抗衰老研究提供可借鉴的科研思路和方法。     

Establishment and biological characteristics of sorafenib-resistant hepatocellular carcinoma cell lines

[目的]建立索拉菲尼诱导的PLC/PRF/5和Huh7耐药细胞株,并研究其耐药细胞的生物学特性.[方法]通过药物敏感性实验CCK8法测定索拉菲尼的半数抑制浓度IC50值;采用体外间歇诱导法,使用PLC/PRF/5和Huh7各自IC50值作为筛选浓度,建立索拉菲尼诱导的耐药细胞株模型;Real time-PCR检测5种耐药基因(GST-π、LRP、MDR1、MRP、TopoⅡ)在耐药组和对照组中的表达差异;Western blot检测MAPK信号通路中关键信号因子细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)ERK1/2在不同组别细胞中的磷酸化水平差异.[结果]所筛选的PLC/PRF/5和Huh7耐药组细胞与对照组细胞相比较,其细胞生存率有显著性提高(P＜0.05);5种耐药基因中MDR1的表达有显著性上调(P＜0.05);索拉菲尼作用靶点的下游信号因子ERK1/2的磷酸化水平上调.[结论]成功地在体外建立索拉菲尼诱导的PLC/PRF/5和Huh7耐药细胞株,其耐药机制可能与ERK1/2的磷酸化水平上调导致耐药基因MDR1高表达有关.     

索拉菲尼诱导的肝癌耐药细胞株的建立及其生物学特性

目的建立索拉菲尼诱导的PLC/PRF/5和Huh7耐药细胞株,并研究其耐药细胞的生物学特性。方法通过药物敏感性实验CCK8法测定索拉菲尼的半数抑制浓度IC50值;采用体外间歇诱导法,使用PLC/PRF/5和Huh7各自IC50值作为筛选浓度,建立索拉菲尼诱导的耐药细胞株模型;Real time-PCR检测5种耐药基因(GST-π、LRP、MDR1、MRP、TopoⅡ)在耐药组和对照组中的表达差异;Western blot检测MAPK信号通路中关键信号因子细胞外调节蛋白激酶(extra-cellular regulated protein kinases,ERK)ERK1/2在不同组别细胞中的磷酸化水平差异。结果所筛选的PLC/PRF/5和Huh7耐药组细胞与对照组细胞相比较,其细胞生存率有显著性提高(P<0.05);5种耐药基因中MDR1的表达有显著性上调(P<0.05);索拉菲尼作用靶点的下游信号因子ERK1/2的磷酸化水平上调。结论成功地在体外建立索拉菲尼诱导的PLC/PRF/5和Huh7耐药细胞株,其耐药机制可能与ERK1/2的磷酸化水平上调导致耐药基因MDR1高表达有关。     

3，4- 二羟基苯甲酸甲酯延缓秀丽线虫衰老的作用及作用机制研究

目的：本实验室前期工作发现3,4- 二羟基苯甲酸甲酯（methyl 3,4-dihydroxybenzoate,MDHB）具有神经保护、抗细胞氧化损伤及延长秀丽线虫寿命的作用。本论文以秀丽线虫（Caenorhabditis elegans,C.elegans）为模型动物,研究MDHB 给药前后对秀丽线虫寿命、应激能力等相关指标的影响,旨在进一步探明MDHB 延缓线虫衰老的作用及相关机制。方法：本文以秀丽线虫为模型动物测定MDHB 对秀丽线虫寿命、运动能力、生殖能力及抗压能力的影响。本实验主要考察了抑菌性、热量限制途径和daf-2/daf-16 参与的胰岛素/ 胰岛素样生长因子信号通路,通过CRISPR-CAS 9、特定基因突变、荧光显微镜分析、荧光酶标仪及Real-Time PCR 等方法进一步研究MDHB 延缓秀丽线虫衰老的作用及分子机制。结果：首先,本论文观察MDHB 对秀丽线虫寿命的影响,结果表明160 mg·L-1 MDHB 能显著延长野生型秀丽线虫寿命19%,高于阳性药白藜芦醇。此外,MDHB 给药后延长eat-2 突变株寿命,对于daf-2 和daf-2;daf-16 缺失突变体MDHB给药后抗衰老作用消失,对于daf-16 缺失突变株,MDHB 给药后寿命仍延长,但低于MDHB 对野生型秀丽线虫的延寿作用。表明热量限制并非MDHB 抗衰老的首要机制,MDHB 可能主要通过daf-2/daf-16 参与的胰岛素/ 胰岛素样生长因子通路延缓线虫衰老。其次,本文考察了压力胁迫下,MDHB 对野生型线虫和突变株线虫的影响,MDHB 给药后提高野生型线虫生存率,对daf-16缺失突变株线虫无延寿作用;MDHB 还能降低线虫体内活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）水平,提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性,表明MDHB 可提高抗氧化损伤能力从而延长线虫寿命。最后,Real-Time PCR 结果显示 MDHB 处理后线虫体内daf-2 下调,daf-16 转录活性上调;使用GFP 融合共表达株线虫观察MDHB 对daf-16 入核状态和sod-3 及hsp-16.2 表达水平的影响,结果显示MDHB 促进线虫daf-16 入核,影响一系列与压力应激和寿命相关的生理活动,如活化daf-16 靶基因sod-3 和hsp-16.2。表明MDHB 激活daf-16/FOXO 信号通路及其下游靶基因,提高线虫抗氧化损伤和抗热压能力,从而延缓线虫衰老。结论：MDHB 可能通过调控daf-2/daf-16 参与的胰岛素/ 胰岛素样生长因子通路提高线虫抗压能力从而延长秀丽线虫寿命。     

桑葚多糖T3-3分离及秀丽隐杆线虫抗衰老活性研究

[目的]研究桑葚多糖T2提取工艺优化,并对其抗衰老活性进行分析。[方法]以秀丽隐杆线虫为模型,用寿命、移动力分析、吞咽频率、产卵量和肠脂褐质综合评价不同剂量范围的桑葚多糖(T3-3)抗衰老活性。通过正交和优化实验确定最优提取工艺条件为:提取温度100℃,提取时间2 h,提取次数3次,料液比1∶30,提取率最高达8.48%。[结果]抗衰老活性研究表明,150 mg/L的T3-3能增强秀丽隐杆线虫的抗衰老能力。[结论]该提取工艺1)延长了秀丽隐杆线虫的寿命,秀丽隐杆线虫平均寿命延长了10.38%(P0.05),最大寿命延长了28.57%(P0.05),50%存活率对应天数延长了0.91%。2)秀丽隐杆线虫吞咽频率增加,吞咽频率比对照组高18.78%。3)产卵量无统计学差异。4)减少秀丽隐杆线虫肠脂褐质的产生量,比对照组平均荧光强度低11.14%(P0.05),实验末期,对照组的平均荧光强度增大了12.47%。     

HB-EGF对HSC-T6细胞Ras/ERK通路的激活及对MMP-2、TIMP-1表达的影响

目的 观察肝素结合性表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)激活肝星状细胞(HSC)过程中Ras/ERK信号通路的变化和对金属基质蛋白酶(MMP)及其抑制物的影响. 方法 传代培养HSC-T6细胞,分空白对照组、HB-EGF处理组(20,40,80 ng/mL),采用QRT-PCR法检测MMP-2、金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)及表皮生长因子受体(EGFR) mRNA的表达,并确定HB-EGF刺激HSC-T6 Ras/ERK通路(ERK1、ERK2、P38MAPK)活化的最佳浓度及最佳时间,检测该通路活化情况. 结果 QRT PCR检测提示,MMP-2的表达随HB-EGF干预时间的延长增加,TIMP-1的表达随干预时间的延长递减;40 ng/mL HB-EGF培养HSC-T6 48 h后,EGFRmRNA的表达较空白对照组明显上调(P＜0.05);选择40 ng/mL HB-EGF培养48 h为最佳刺激时间与浓度,该处理组ERK1 mRNA的表达较空白对照组明显上调(P＜0.05),但ERK2、P38MAPK的变化无统计学意义;Western-blot检测提示该处理组ERK1蛋白的表达较空白对照组上调(P＜0.05). 结论 HB-EGF可影响HSC-T6的MMP-2、TIMP-1的表达;HB-EGF通过促进HSC-T6表达EGFR、ERK1,有效激活细胞内Ras/ERK信号通路.     

鼻咽上皮细胞中过表达PIN1 激活JNK信号通路上调CyclinD1的研究

目的：研究肽脯氨酰异构酶PIN1（prolylisomerase,PIN1）可能影响的肿瘤信号通路和相关基因,探讨鼻咽癌早期发生发展的机制。方法：运用慢病毒表达系统在鼻咽上皮细胞系 NP69 中建立PIN1 过表达细胞克隆株,real-time PCR、Western blot检测PIN1表达情况;肿瘤信号通路阵列荧光素酶实验筛选PIN1可能影响的细胞信号通路,Western blot加以验证。结果：稳定表达 PIN1 的NP69 细胞可激活一系列肿瘤信号通路其中激活丝裂原活化蛋白激酶MAPK/c-Jun氨基末端激酶JNK（MAPK/JNK） 信号通路,差异具有统计学意义（P<0.01）,核转录因子－κB（P=0.036）、癌基因Myc（P=0.048）信号通路变化具有统计学意义（P<0.05）。Western blot结果显示与对照组相比,稳定表达 PIN1 的NP69实验组可明显上调JNK 信号通路重要的下游转录因子c-Jun、c-Jun Ser63、c-JunSer73的表达量,最终上调下游基因细胞周期蛋白CyclinD1（t=-7.295,P=0.002）的表达。结论：稳定表达 PIN1 的NP69 细胞可激活MAPK/JNK信号通路,明显上调JNK 信号通路重要的下游转录因子c-Jun、c-Jun Ser63、c-JunSer73的表达量,最终上调下游基因细胞周期蛋白CyclinD1的表达,PIN1与鼻咽癌早期的发生发展密切相关。     

氧化应激和炎症反应中Nrf2/HO-1与MAPK的相关性

核因子E2相关因子2(Nrf2)是一种细胞内转录调节因子,血红素加氧酶1(HO-1)是其最重要的下游调控产物之一,两者的级联反应在机体抗炎和抗氧化系统中十分关键。而促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)参与体内多种氧化应激和炎症反应过程并发挥重要调控作用。MAPK与Nrf2/HO-1信号通路间具有复杂的相互作用,且这一作用在不同的研究条件下并不一致。不同的MAPK可不同程度地影响Nrf2的活化,进而影响HO-1的表达;另外,HO-1降解胆红素的产物一氧化碳及其他Nrf2调控的基因也可能对一些MAPK具有调节作用。同时,细胞内其他信号分子的影响进一步增加了MAPK与Nrf2/HO-1信号通路相互作用的多样性。     

消瘤方对子宫内膜异位症患者子宫内膜基质细胞NF-κB/MAPK信号通路的影响

目的:探讨中药消瘤方对子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)患者在位和异位内膜基质细胞核转录因子(NF)-κB/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的影响。方法:采用改良筛网法原代分离、培养EMs患者在位、异位及正常人子宫内膜基质细胞;将分离出的子宫内膜细胞分为正常组、在位组和异位组,其中在位和异位组再随机分为空白对照组(生理盐水组)、西药对照组(孕三烯酮组)、中药低剂量组(消瘤方提取物5 g/L组)及高剂量组(消瘤方提取物10 g/L组),各组分别加入相应药物干预后采用RT-PCR方法检测内膜细胞NF-κB/MAPK因子的表达水平。结果:药物干预后发现,消瘤方高剂量组和西药组可抑制在位及异位子宫内膜细胞的NF-κB/MAPK p38信号因子的激活,降低NF-κB/MAPK p38因子的表达,差异具有统计学意义(P0.01,P0.05)。结论:子宫内膜异位症的发生与NF-κB/MAPK信号通路的激活密切相关,消瘤方可通过抑制子宫内膜细胞NF-κB/MAPK信号通路因子的表达,从而阻止内异灶的形成而起到治疗的作用。     

Ras-MAPK信号转导途径及其与肿瘤关系的研究进展

从某种意义看 ,肿瘤的发生反映了瘤细胞增殖和死亡之间平衡的失调 ,肿瘤细胞常表现为抵抗凋亡和促进增殖。生长因子受体介导的 Ras- MAPK信号转导途径是诸多信号途径中与细胞增殖、分化密切相关的重要信号途径。多肽生长因子与受体结合 ,激活下游信号分子如 Ras、丝裂原激活蛋白激酶( MAPK)等 ,通过级联酶促反应 ,影响基因表达 ,调控细胞增殖和分化。笔者就 Ras- MAPK信号途径、与其他信号途径间的“串线”,以及与肿瘤的关系作一综述。1　Ras- MAPK信号转导途径ras基因编码的小 GTP结合蛋白—Ras—是调节细胞生长的重要转导蛋白 ,有两种翻译后修饰方式 [1] :( 1 ) Ras C端 CAAX模体半胱氨酸的法尼基化 ( 1 5碳的异戊二烯基 ) ,Ras在胞质中法尼基化后结合到内质网 ,如酵母菌和哺乳动物 ,内质网具有多种酶催化水解 AAX残基 ,然后 C端羧基甲基化 ,CAAX模体的修饰使 Ras C端具有疏水性 ;( 2 ) N-或 H- Ras的半胱氨酸的 S-酰基化 ,长链的 S-酰基取代基使 Ras具有疏水性。这两种方式都促使 Ras瞄定细胞膜上 ,以 N-乙酰 - S-顺法尼...     

PI3K/Akt和MAPK信号通路在缺血性脑损伤中的保护作用

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路是细胞内重要的信号转导通路。研究发现PI3K/Akt和MAPK信号通路经下游多种靶点,即内皮型一氧化氮合酶、糖原合成酶激酶3、核因子κB、细胞外信号调剂激酶等促进脑缺血后神经细胞的存活PI3K/Akt和MAPK这两条信号通路在缺血性脑损伤中发挥重要的作用,在一定条件下,这两条信号通路的激活可以通过上述途径有效抑制神经元细胞的凋亡而发挥脑保护的作用。     

健脾化瘀方对人肝癌细胞ras/MAPK通路的影响

目的研究健脾化瘀方对人肝癌细胞ras/MAPK信号通路相关基因表达的影响。方法采用RT-PCR法,用凝胶电泳分析系统比较目的基因与-βactin基因的吸光度比值来反映基因的表达。结果ERK、SOS1、c-fos基因表达降低(P<0.05),MEKr、af、ras、Grb2基因的表达未见明显差异(P>0.05)。结论健脾化瘀方能通过抑制ras/MAPK信号通路的上ERK、SOS1、c-fos的表达,从而起到抑制肝癌细胞的生长,诱导细胞凋亡的作用。     

三卤甲烷对秀丽隐杆线虫生殖细胞及子代数的影响

目的 探讨3种三卤甲烷类饮用水消毒副产物对秀丽隐杆线虫生殖细胞发育与繁殖能力的影响。方法 以3种三卤甲烷(三溴甲烷、三氯甲烷、三碘甲烷)为研究对象,在秀丽隐杆线虫模型中检测不同浓度三卤甲烷暴露后生殖腺细胞凋亡和卵母细胞数,及最终产生的子代数目。结果 生殖腺细胞凋亡结果显示,50μmol/L处理组中三氯甲烷和三碘甲烷的暴露造成线虫生殖腺凋亡水平升高,且存在一定剂量依赖效应。卵母细胞数结果显示,在50μmol/L浓度暴露下,3种THMs的暴露均显著降低了线虫体内的卵母细胞数。子代数结果显示,仅有50μmol/L处理组的三碘甲烷暴露会显著降低线虫的子代数。结论 THMs会造成秀丽隐杆线虫的生殖毒性,且毒性与其携带的卤族元素有关。     

RASopathies在矮小症中的研究进展

RASopathies是一组由于Ras/丝裂原激活蛋白激酶(Ras/mitogen activated protein kinase,MAPK)通路中的组分或调节因子的编码基因发生突变引起的一系列疾病。Ras/MAPK通路在调控细胞发育过程中发挥重要作用，因此RASopathies涉及疾病众多，且临床表现相互重叠，诊断难度大。其中，矮小症是RASopathies最常见的临床表现之一，但导致矮小症的机制有待进一步探索，且生长激素治疗RASopathies的效果差异较大。本文就RASopathies及其在矮小症中的研究进展作一综述。     

秀丽隐杆线虫-多重耐药鲍曼不动杆菌感染模型的建立

目的 采用线虫液体培养法,建立秀丽隐杆线虫-多重耐药鲍曼不动杆菌(multidrug resistance acinetobacter baumannii,MDRAB)感染模型.方法 利用临床分离的MDRAB对线虫进行感染,通过考察线虫的存活率,探讨感染线虫模型所需的细菌浓度;感染后取不同时间点将感染线虫裂解,对上清液进行线虫肠道细菌鉴定及菌量计数,以验证模型的成功建立.结果 细菌浓度在1.20×109cfu/mL 的MDRAB组线虫的生存率明显低于E.coli OP50及空白对照组,差异有统计学意义(X2=112.75,P<0.001).实验所得上清液经细菌鉴定及药敏测试证实为MDRAB;MDRAB感染线虫4、8、12、24 h后,线虫体内菌量分别为(0.22±0.02)×105、(0.54±0.03)×105、(1.69±0.02)×105、(3.22±0.60)×105cfu/mL,采用One-Way ANOVA分析,不同时间点感染线虫肠道内菌量差异有统计学意义(F=27.32,P<0.001).结论 本实验成功建立了秀丽隐杆线虫-多重耐药鲍曼不动杆菌液体感染模型.     

PI3K和MAPK信号通路通过FOXO1转录因子诱导A549细胞周期的阻滞和凋亡的研究

目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)中磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/ERK信号通路通过FOXO1转录因子对细胞周期及凋亡的调节及其分子机制.方法 体外培养NSCLC细胞系A549,分别选用PI3K/AKT信号通路特异性抑制剂LY294002和MAPK/ERK信号通路特异性抑制剂UO126及2种抑制剂联合处理细胞之后,采用Western blot检测蛋白FOXO1、p-FOXO1及其下游蛋白Bim、p27kip表达的变化;流式细胞术分析对细胞周期的影响;Annexin-FITC双染方法检测细胞凋亡.结果 Western blot结果显示:与对照组相比,FOXO1的蛋白水平未见明显变化,而FOXO1的磷酸化水平明显下降,Bim、p27kip的表达相应增加.与对照组相比,LY294002和UO126均可促进A549细胞周期阻滞于G1期,并诱导细胞凋亡.LY294002和UO126联合作用较2种药物单独作用时,A549细胞凋亡明显增加.结论 抑制PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路可共同激活FOXO1转录因子的活性,协同促进细胞周期的阻滞,诱导细胞的凋亡.     

MAPK和PI3K信号通路在胃癌中的作用及意义

【目的】 已有研究表明MAPK和PI3K信号途径是两条重要的抑制凋亡和促进增殖的转导通路,与癌症的发生发展关系密切,本实验通过检测在Akt、Erk、Bcl-2、NF-κB在胃癌及癌旁组织的表达,探讨MAPK和PI3K信号通路在胃癌发展过程中的作用及意义。 【方法】 收集50对胃癌组织及其相应的癌旁组织,应用免疫组织化学技术检测胃癌及癌旁组织中Akt、Erk、Bcl-2和NF-κB蛋白的表达情况并进行分析。 【结果】 胃癌中Akt、Erk、Bcl-2、NF-κB蛋白的阳性表达率均高于其癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。 【结论】 胃癌的发生发展是一个多步骤、多基因突变的累积过程。PI3K/Akt和MAPK/ERK信号转导通路是细胞内两条重要的促增殖和抗凋亡通路。PI3K-Akt信号通路在细胞内影响细胞生长、增殖、凋亡,丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(Akt)处于中心环节,活化的Akt可激活下游信号分子,包括抑制凋亡的Bcl-2蛋白和转录因子NF-κB。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路参与基因表达调控,细胞功能活动以及个各种生理病理过程。胞外信号调节激酶(ERK1/2)是哺乳动物中5条并行的MAPK信号通路之一,通过激活下游靶位,包括重要的转录因子NF-κB和细胞存活调节器Bcl-2,调控基因表达,从而发挥抑制凋亡的作用。本研究结果显示人胃癌中Akt、Erk、Bcl-2、NF-κB蛋白的阳性表达率均高于其癌旁组织,说明上调PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路的活性与胃癌的发生发展过程密切相关。     

丹皮酚通过miR-21介导的p38 MAPK信号通路下调氧化低密度脂蛋白诱导的大鼠血管内皮细胞肿瘤坏死因子-α释放

目的观察微RNA-21(microRNA-21,miR-21)对p38丝裂原活化的蛋白激酶(p38mitogen-activated protein kinase,p38-MAPK)信号通路的调控作用,探究丹皮酚(paeonol,Pae)抑制血管内皮细胞(vascular endothelial cell,VEC)损伤的机制。方法组织块预消化贴壁法培养大鼠VEC;氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导VEC的损伤;用HiPerFect试剂将miR-21模拟物或抑制剂转染进入VEC;免疫印迹法检测p38MAPK信号通路相关蛋白的表达;酶联免疫吸附试验检测VEC中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的水平。结果 ox-LDL明显提高VEC中Ras、p-MKK3/6、p-p38蛋白表达水平,并诱导VEC分泌TNF-α;miR-21高表达可升高TNF-α水平及Ras、p-MKK3/6、p-p38蛋白表达水平;Pae明显降低损伤的VEC分泌TNF-α水平,且抑制由miR-21高表达引起的TNF-α水平上升及p38MAPK信号通路的激活。结论 Pae可抑制miR-21介导的p38MAPK信号通路,减少ox-LDL诱导的VEC中TNF-α的分泌。     

Ras/Raf/ERK信号通路与肝脏疾病

蛋白质的磷酸化与去磷酸化作为传递外界各种信息的信号传导机制,在细胞的生物学活动中发挥重要作用.一系列的蛋白激酶(PK)及其磷酸化构成了信号传导的级联反应.丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是细胞内一类丝氨酸/苏氨酸PK,存在于真核生物的大多数细胞内.目前真核细胞内已确定出四条MAPK传导通路,即细胞外信号调节激酶(ERK)通路、c-jun通路、P38通路及ERK5通路[1].其中Ras/Raf/ERK通路是迄今研究得最为活跃信号通路之一,该通路参与了细胞生长、发育、增殖、分化以及细胞间的功能同步和细胞恶性转化等多种生理、病理过程.