血管内皮祖细胞靶向损伤血管内皮磁共振成像的实验研究

目的采用超顺磁性氧化铁（sPIO）作为磁共振示踪细胞的标记物,为血管内皮祖细胞移植防治血管内皮损伤性疾病提供实验依据。方法分离、鉴定并培养新西兰大白兔外周血血管内皮祖细胞（EPCs）,制备Fe2O3^-多聚左旋赖氨酸（PIJL）并体外标记EPCs。用2．5F球囊扩张兔右侧颈动脉,制作血管内膜损伤模型,进行EPCs局部移植。A组5只,移植Fe2O3-PLL标记的EPCs,B组5只,移植荧光标记的EPCs,C组5只为空白对照,局部注射生理盐水。细胞移植后7d,所有实验兔行MR颈动脉扫描,并取受损伤血管做病理组织学检查,并与MR信号变化进行对比分析。结果EPCs的Fe2O3^-PLL标记率〉95％,A组标记细胞移植后7d,MR扫描T2WI显示损伤血管壁明显低信号区,而B组和C组无明显异常信号改变;病理学检测显示A组损伤血管内膜有普鲁氏蓝染色阳性细胞黏附,B组损伤血管内皮有强荧光表达,C组损伤血管内皮无表达。结论利用1．5TMR仪进行活体成像技术,可示踪并检测磁粒子标记血管内皮祖细胞在损伤血管内皮的归巢、黏附及分布,为血管内皮祖细胞移植防治血管内皮损伤性疾病提供了实验依据。     

外周血内皮祖细胞移植对肺动脉高压兔模型肺动脉压力及其结构的影响

目的探讨外周血内皮祖细胞(EPCs)移植对野百合碱导致的兔模型肺动脉高压的治疗效果。方法选取健康新西兰兔50只,随机将其分为3组:(1)正常对照组(n=16);(2)野百合碱诱导肺动脉高压组(MCT模型组,n=16);(3)EPCs治疗组(n=18)。EPCs治疗组兔行外周血单个核细胞成功诱导、分化为内皮祖细胞之后,将其从兔尾静脉注入进行移植,正常对照组及MCT模型组注射相同剂量生理盐水3周后对3组肺动脉压、右心室肥大指数以及肺血管重构的情况进行观察与对比。结果与正常对照组比较,MCT模型组肺动脉压升高(30.13 mm Hg±3.12 mm Hg vs.15.99 mm Hg±2.23 mmHg),右心室肥大指数增大(0.51±0.06 vs.0.26±0.03),肺动脉管壁厚度增加(28.77μm±4.35μm vs.8.44μm±0.05μm),肺小动脉厚度增加(73.78μm±7.61μm vs.40.16μm±2.17μm),差异均有统计学意义(P<0.05)。与MCT模型组比较,EPCs治疗组各项指标均显著改善,肺动脉压为(22.78±2.71)mm Hg,右心室肥大指数为(0.41±0.05),肺动脉管壁厚度为(16.55±3.15)μm,肺小动脉厚度为(53.50±3.77)μm,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论外周血内皮祖细胞移植治疗兔模型肺动脉高压,可在一定程度上修复损伤的肺血管系统,有利于改善肺动脉高压。     

冠心病患者外周血内皮祖细胞数量与心血管危险因素的关系

目的:观察冠心病患者外周血内皮祖细胞(EPCs)数量与心血管危险因素之间的关系.方法:选择20例冠心病患者(G1组,n=20)和10例非冠心病患者(G2组,n=10),分别抽取外周血进行EPCs 的分离培养,于第10天对EPCs进行鉴定,并于倒置相差显微镜下计数内皮祖细胞克隆形成单位(EPC-CFU),评估外周血EPCs水平.分析外周血EPCs数量与心血管的各个危险因素(高血压、糖尿病、血清低密度脂蛋白(LDL)、总胆固醇、高敏C反应蛋白(hsCRP)水平)及整体危险性(用Framingham危险积分定量评估)的关系.结果:G1组外周血EPCs数量较G2组明显减少(10.3±2.5 vs 17.7±2.2),差异有统计学意义(P＜0.05).冠心病患者外周血EPCs数量与Framingham危险积分、高血压、血清LDL、hsCRP水平呈负相关.结论:冠心病患者外周血EPCs数量减少,并与Framingham危险积分呈负相关.     

血管生成素-1基因重组腺病毒转染兔外周血血管内皮祖细胞的研究

目的探讨重组腺病毒介导的血管生成素-1（Ang-1）基因转染兔外周血血管内皮祖细胞（EPCs）的方法及效果。方法从兔外周血中体外分离、扩增EPCs,采用免疫组织化学和荧光化学法鉴定EPCs,设EPCs细胞对照组（EPCs）、EPCs＋Ad空病毒载体对照组（EPCs＋Ad）及EPCs＋Ad-Ang-1组（EPCs＋Ad-Ang-1）。以携带Ang-1基因的重组腺病毒转染EPCs后,用荧光显微镜下观察转染效果,RT-PCR鉴定细胞内Ang-1基因在EPCs中的转录;ELISA法检测细胞培养上清中的Ang-1蛋白表达。结果 EPCs＋Ad-Ang-1组镜下观察到大部分细胞呈现绿色荧光;RT-PCR鉴定证实EPCs细胞内的Ang-1转录;ELISA检测证实EPCs＋Ad-Ang-1组细胞上清液中Ang-1的浓度高于EPCs组和EPCs＋Ad组（均P〈0.05）。结论腺病毒介导的Ang-1基因转染外周血EPCs可行。     

兔外周血源的血管内皮祖细胞体外扩增研究

目的探讨从兔外周血单个核细胞中富集血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）并在体外诱导培养和扩增的方法,试图证实外周血是获得血管内皮祖细胞理想来源之一。方法密度梯度法分离兔外周血单个核细胞（MNCs）,采用专用的EGM-2-MV完全培养基对单个核细胞进行诱导分化培养,动态观察细胞生长过程,并应用免疫组织化学和细胞荧光化学法分别鉴定培养细胞的内皮细胞表面标记和生物学功能。结果外周血单个核细胞经专用培养基体外诱导后,4 d左右可见多数细胞贴壁生长,9 d后可见位于中间的细胞聚集成团,4周后呈铺路石样内皮细胞形态。培养12 d细胞能表达的内皮细胞表面抗原,包括Ⅷ因子（VWF）,血管内皮生长因子受体（VEGFR-2）和钙粘素（VE-cadherin）等;并能特异性吸附异硫氰酸荧光素（FITC）标记的荆豆凝集素（UEA-1）,能内吞乙酰化低密度脂蛋白（ac-LDL）,具备内皮细胞的功能。结论兔外周血中存在具有增殖分化潜能的EPCs,经过特定的体外诱导培养可以收集和扩增。     

冠心病患者高敏C反应蛋白与循环内皮祖细胞的关系及临床意义

目的研究冠心病患者血清高敏C反应蛋白(hs-CRP)与循环内皮祖细胞(EPCs)水平之间的关系及临床意义.方法将46例研究对象随机分为稳定型心绞痛(SAP)组(n=18)、急性冠脉综合征(ACS)组(n=24)及对照组(n=36),并根据冠状动脉造影结果分为单支病变组(n=18)、双支病变组(n=14)及三支病变组(n=10).胶乳凝集反应法测定冠状动脉造影患者高敏CRP浓度,同时采集研究对象外周血进行EPCs的分离培养,倒置相差显微镜下计数细胞克隆形成单位评估循环EPCs水平.结果 ACS组hs-CRP浓度明显高于对照组和SAP组,而SAP组及ACS组循环EPCs水平明显低于对照组(P<0.05 );双支病变组与三支病变组hs-CRP水平较对照组显著升高(P<0.05),冠状动脉病变(单支、双支、三支)组EPCs水平均显著低于对照组(P< 0. 01).高敏C反应蛋白与循环内皮祖细胞水平呈负相关(r= -0.429,P<0.05).结论 CRP和EPCs与冠心病及冠状动脉病变程度具有相关性,且CRP和EPCs两者之间呈负相关.提示CRP可能通过抑制EPCs数量从而减弱EPCs参与损伤内皮修复的能力,与冠心病发生及临床表现相关.     

内皮祖细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢动脉缺血的动脉造影改变

目的 对比观察内皮祖细胞(EPCs)和骨髓单个核细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢动脉缺血的动脉变化.方法 将雄性Wistar大鼠30只诱导成糖尿病模型,其中25只成模,成模鼠结扎左下肢股动脉制造下肢缺血模型,此后随机分成3组,分别给于生理盐水(A组,n=7),内皮祖细胞(B组,n=9),骨髓单个核细胞(C组,n=9),沿股动脉走向、多点肌肉注射.继续喂养28 d后行下肢动脉造影检测下肢血流.结果 动脉造影结果显示EPCs移植治疗组缺血侧下肢动脉显影血管数多于对照组(P<0.05); EPCs移植治疗组血管数多于骨髓间充质干细胞移植治疗组,但无统计学差异.结论 EPCs移植治疗对糖尿病大鼠下肢缺血效果明确.     

冠状动脉慢血流患者外周血内皮祖细胞功能的改变

目的:观察冠状动脉慢血流患者外周血内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)功能的改变。方法:选择30例冠状动脉造影证实为慢血流的患者为CSF组,冠脉造影血流正常的患者30例为NCF组。以校正TIMI帧数>27,诊断为冠状动脉慢血流。采取外周血分离单个核细胞体外诱导培养1周,在显微镜下计数,并观察EPCs增殖能力、迁移能力、黏附能力。结果:CSF组外周血EPCs数量及增殖、迁移、黏附能力均显著低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:CSF患者外周血EPCs功能降低可能参与CSF现象发生的病理生理过程中。     

不稳定性心绞痛患者冠状动脉病变程度与外周血内皮祖细胞及高敏c反应蛋白的关系

目的探讨不稳定性心绞痛患者冠状动脉病变程度与外周血内皮祖细胞（EPCs）及高敏C反应蛋白（hs—CRP）的相关性。方法选取2010年12月～2013年6月在南方医科大学附属东莞市石龙人民医院心血管内科住院治疗的不稳定性心绞痛患者55例为实验组,选择同期无冠状动脉狭窄患者30例为对照组。使用流式细胞仪测定外周血单个核细胞中CD34及CD133双阳性细胞EPCs的数量,并且检测每位患者hs—CRP水平。于住院后次日行冠状动脉造影,使用Gensini评分系统定量分析冠状动脉的病变程度。统计冠状动脉病变程度与外周血EPCs数量及hs—CRP的相关性。结果实验组与对照组EPCs分别为（30．95±5．50）、（58．66±4．45）个／10万．而实验组与对照组hs—CRP分别为（40．25±9．80）、（3．45±1．68）μmol／L,差异均有统计学意义（均P〈0．05）;实验组内EPCs数量随着冠状动脉狭窄程度Gensini评分的增加亦随之升高（P〈0．05）。冠状动脉病变狭窄的程度与EPCs数量呈正相关（r=0．593,P〈0．01）,而hs—CRP同冠状动脉病变程度无明显相关性（r=0．114,P〉0．05）。结论不稳定性心绞痛患者外周血EPCs数量减少,而hs—CRP则明显增加,但随冠状动脉病变程度加重,外周血EPCs数量增多,hs—CRP则没有明显改变,EPCs可以反映冠状动脉病变狭窄程度．而hs—CRP反映冠状动脉不稳定斑块的活动程度。     

支架置入对ACS患者外周血EPCs数量和血清G-CSF浓度的影响

目的:观察支架置入术对急性冠脉综合征(ACS)患者外周血内皮祖细胞(EPCs)数量和血清粒细胞集落刺激因子(G-CSF)浓度的影响及意义。方法:32例行冠状动脉支架置入术的ACS患者根据不同临床类型分为:ST段抬高ACS急诊PCI组(n=7)和非ST段抬高ACS[包括14例非ST抬高心肌梗死(NSTEMI)和11例不稳定心绞痛(UAP)择期PCI组(n=25)],10例同期经冠状动脉造影(CAG)证实无冠状动脉病变者作为对照组(n=10)。分别于术中和术后3 d抽取外周血进行EPCs的分离培养,同时分离血清以备G-CSF浓度检测。于第10 d对EPCs进行鉴定并于倒置相差显微镜下计数内皮祖细胞克隆形成单位(EPC-CFU)以评估外周血EPCs水平。G-CSF浓度检测采用酶联免疫吸附法(ELISA)。结果:①急诊PCI组术前外周血EPC-CFU数量稍高于择期PCI组,但无统计学意义(P>0.05),且均明显少于对照组(P<0.01)。急诊PCI组术前血清G-CSF明显高于择期PCI组,且均明显高于对照组。②急诊PCI组和择期PCI组术后外周血EPCs数量及血清G-CSF均有增高,但后者外周血EPCs数量增加幅度明显大于前者,对照组外周血EPCs数量及血清G-CSF改变无统计学意义(P>0.05)。③择期PCI组外周血EPCs增加数量与血清G-CSF改变相关(r=0.261,P=0.009),急诊组则无。结论:择期PCI患者术后外周血EPCs数量明显增加,且与血清G-CSF改变相关。AMI后急诊PCI患者术后血清G-CSF浓度明显升高但与外周血EPCs数量增加无明显相关。     

G-CSF对动脉粥样硬化兔颈总动脉球囊损伤后内皮修复的影响

目的研究重组人粒细胞集落刺激因子（G-CSF）的骨髓动员作用能否促进动脉粥样硬化性血管内膜损伤后的再内皮化过程,来预防损伤血管再狭窄.方法将35只新西兰雌性大白兔,随机分为正常饲养组（对照组）5只;高脂饲料喂养组30只在喂养10周后随机抽取20只行右颈总动脉囊扩张损伤,术后随机将其分为：G-CSF干预＋损伤组（n=10）,予静脉注射G-CSF50μg/d,连续7d,NS＋损伤组（n=10）,术后静脉注射生理盐水2mL/d,连续7d;第12周处死所有试验动物,取右颈总动脉、胸主动脉行HE染色观察血管粥样硬化病变评价模型制作情况,弹力纤维染色计算内膜（）I、中膜面积（M）比值I/M以评价内膜增生程度;伊文氏蓝染色并计算内皮再生面积（An）、内皮总面积（A）t比值An/At以评价再内皮化率;CD31免疫组化染色检测损伤局部CD31细胞表达的阳性率以评价G-CSF对EPCs动员效果以及EPCs对受损内皮的修复情况.结果 （1）高脂饲料喂养12周后可形成典型的动脉粥样硬化斑块.（2）G-CSF＋损伤组与NS＋损伤组相比I/M值降低,差异有统计学意义（P〈0.01）.（3）An/At明显升高,有统计学意义（P〈0.01）.（4）免疫组织化学染色显示颈动脉内皮CD31细胞表达阳性率G-CSF＋损伤组高于NS＋损伤组,有统计学意义（P〈0.01）.结论 G-CSF可以动员骨髓EPCs到外周血并迁移到血管内膜受损部位,促进再内皮化,抑制内膜增生,有效预防血管损伤后再狭窄的发生。     

不稳定型心绞痛患者外周血内皮祖细胞与冠状动脉狭窄程度的关系

目的:探讨外周血内皮祖细胞(EPCs)的数量与不稳定性心绞痛患者冠状动脉病变程度的相关性。方法:选取不稳定性心绞痛患者53例作为患者组,同期无冠状动脉病变患者33例作为对照组。患者入院后即抽取静脉血,采用流式细胞仪检测单个核细胞中CD34及CD133双阳性细胞(EPCs)的数量。然后行冠状动脉造影,采用Gensini评分系统对冠脉病变程度进行定量分析。分析外周血EPCs数量与冠脉病变程度的关系。结果:不稳定性心绞痛患者外周血EPCs数量较对照组明显减少(P<0.05);冠状动脉狭窄程度严重的患者外周血EPCs数量明显高于狭窄程度较低的患者(P<0.05);冠脉狭窄的严重程度与EPCs数量呈正相关(P<0.05)。结论:不稳定性心绞痛患者外周血内皮祖细胞的数量明显降低,冠脉狭窄可导致外周血EPCs数量增多。     

吡格列酮对外周血内皮祖细胞数量与增殖能力的影响

目的观察吡格列酮对外周血内皮祖细胞（EPCs）数量与增殖能力的影响。方法采用Ficoll密度梯度离心法从外周血获得单个核细胞,将其接种于包被人纤维连接蛋白的培养板上,培养14d后收集贴壁细胞,加入不同浓度（10^-6、10^5、10^-4、10^-3mmol／L）UE格列酮分别培养24、48、72h,同时采用激光共聚焦显微镜鉴定,FITC—UEA—I和Dil—acLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPCs,并在倒置荧光显微镜下计数;后采用MTT比色法观察EPCs的增殖能力。结果在作用48h后,不同浓度的吡格列酮均增加了外周血EPCs数量和增殖能力;10^-5mmol／L毗格列酮作用48h时影响最为显著,EPCs数量和增殖能力（分别为54．0±2．9和0．593±0．033）明显高于对照组（分别为30．0±31和0．178±0.018）,差异均有统计学意义（均P〈0．01）.结论吡格列酮可增加EPCs数量并改善EPCs的增殖能力。     

兔外周血内皮祖细胞的分离、培养和鉴定

目的研究兔外周血内皮祖细胞（endothelial progenitor cell,EPCs）的分离、培养方法,并鉴定其功能。方法从兔耳中央动脉采集兔外周血30ml,采用密度梯度离心法分离单个核细胞,接种于人纤维连接蛋白包被的培养板上,分别予含20％胎牛血清低糖的DMEM培养基诱导培养,培养2周后通过免疫荧光、免疫组化、体外血管成形实验鉴定内皮祖细胞。结果兔外周血单个核细胞体外培养可成功获得内皮祖细胞,稳定表达内皮祖细胞相关抗原,并能在matrigel凝胶上形成稳定的血管腔样结构。结论兔外周血单个核细胞采用密度梯度离心及一定的培养条件能成功诱导、分化为内皮祖细胞。     

不同细胞生长因子组合对内皮祖细胞培养过程的影响

目的 观察不同细胞生长因子组合对体外培养过程中内皮祖细胞（EPC）数量和功能的影响。方法采用密度梯度离心法分离人脐血单个核细胞，接种至包被有人纤维连接蛋白的培养皿，按照处理方式不同分为4组：对照组（不添加细胞因子）、VEGF组[加入血管内皮生长因子（VEGF）】、VEGF＋ECGS组[加入VEGF及内皮细胞生长添加剂（ECGS）]、多因子组（加入多种细胞生长因子），6d后倒置显微镜下观察各组细胞集落形成情况，测定黏附能力及收获的EPC数量。结果VEGF组及ECGS＋VEGF组细胞集落形成能力（11.53±1.72、1310±2．09）均显著强于对照组（587±0．55）（均P〈0.01】；ECGS＋VEGF组细胞黏附能力（55．53±18.32）显著强于VEGF组（24.92±4．31）（均P〈0．01）；多因子组细胞集落形成及粘附能力（33．83±5．10、65.22±10、98）均明显强于其余各组（P〈0．05或0．01）。VEGF组及VEGF＋ECGS组收获的EPC数量分别为对照组的185、284倍，均显著增加（均P〈0.01）；多因子组EPC数量虽多于VEGF＋ECGS组，但差异并无统计学意义（P〉0．05）。结论EPC体外培养时，添加VEGF及ECGS是一种经济有效的方法，可显著改善EPC的集落形成及黏附能力，增加EPC的收获数量。     

蛭龙活血通瘀胶囊对心肌梗死大鼠内皮祖细胞动员

目的：探讨蛭龙活血通瘀胶囊对急性心肌梗死（AMI）大鼠内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）动员。方法：结扎SD大鼠左冠状动脉前降支制作AMI模型,将32只大鼠随机分为4组：AMI组、蛭龙活血通瘀胶囊低剂量组1.56 g/kg/d（简称：低剂量组）、蛭龙活血通瘀胶囊高剂量组6.24 g/kg/d（简称：高剂量组）、和假手术组,术后24 h用药灌胃,1次/d,5周后计数外周血EPCs数量、免疫组化法测定血清血管内皮生长因子（VEGF）的数量。结果：术后5周与假手术组比较,AMI组、低剂量组和高剂量组的血清VEGF数量、外周循环EPCs数量均明显升高（P〈0.05）;术后5周与AMI组比较,低剂量组和高剂量组血清VEGF数量明显增加（P〈0.05）。结论：AMI大鼠5周后骨髓EPCs的动员增加,蛭龙活血通瘀胶囊能促进AMI大鼠骨髓EPCs的动员,增加循环EPCs数量,从而为临床治疗心肌梗死提供新的治疗措施。     

兔颈动脉粥样硬化狭窄动物模型的建立及病理学评价

目的建立兔颈动脉粥样硬化狭窄模型，采用病理学检查评价其可行性。方法健康雄性新西兰大白兔30只为手术组，予以1．5％胆固醇喂养1wk后氮气损伤右颈外动脉，以左颈外动脉为自身对照组，术后继续1．5％胆固醇喂养。15只兔于4wk后组织取材行病理学检查，另15只兔于8wk后行病理学检查。另取5只雄性新西兰大白兔为空白对照。结果胆固醇喂养后兔血清总胆固醇、低密度脂蛋白较喂养前明显升高（P〈0．05）。4wk病理学检查示：右颈外动脉管壁区域性轻度增厚，管腔轻度狭窄。8wk病理学检查示：右颈外动脉管壁明显增厚，管腔狭窄较明显，5只右颈外动脉管完全闭塞；自身对照左颈外动脉无狭窄（P〈0．01）。空白对照组兔病理学检查未见动脉粥样硬化病变。结论氮气损伤加高脂喂养能有效地建立兔颈动脉粥样硬化狭窄模型，病变随时间进行加重。