结核分枝杆菌ESAT6基因克隆与表达质粒构建

目的　克隆结核分枝杆菌 (MTB)分泌蛋白ESAT6基因 ,并构建重组表达质粒。方法　根据Genbank中ESAT6基因序列 ,针对其编码区合成引物 ,采用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出ESAT6基因 ,并连接到T载体 ,然后定向克隆到原核表达质粒pGEX 4T 2 ,阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果　经双内切酶消化所切下的片段 ,大小与预计相符 ;测序结果证实基因序列正确 ,符合表达框架。结论　成功构建了重组原核表达质粒 pGEX ESAT6。     

结核分枝杆菌Ag85B基因克隆及表达质粒构建

目的 克隆并构建编码结棱分枝杆菌Ag85B分泌蛋白的重组表达质粒。方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法从结棱分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出Ag85B基因(978bp)，并克隆到T栽体，然后用双内切酶消化后，与同样酶消化的pGEX-4T-2连接，转入大肠杆菌E．coli DH5α，阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果 酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符，测序结果与文献报道一致，证实符合表达框架。结论成功地克隆并构建了Ag85B基因的重组表达质粒pGEX-Ag85BV。     

结核分枝杆菌ESAT-6基因的克隆与表达

目的 对结核分枝杆菌的ESAT-6基因进行克隆、鉴定与表达，为结核病的诊断、重组疫苗的应用打下基础。方法 以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，用聚合酶链反应(PCR)对ESAT-6基因进行扩增，将扩增的产物连接于测序载体pGEM-T上，经测序反应确定无误后，再将PCR产物与原核表达载体pET42b( )构建表达ESAT-6的重组质粒，将重组质粒先转化人大肠杆菌DH5a内并提取质粒，经酶切鉴定后，再转化入表达宿主大肠杆菌BL21菌株内，对转化菌株进行诱导后，破菌，进行SDS-PAGE电泳。结果 电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白，其表达的蛋白质相对分子质量为9900。结论 目的基因克隆到菌株内，重组结核分枝杆菌ESAT-6的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测等奠定了基础。     

结核分枝杆菌MPT64基因克隆与表达质粒构建

[目的] 克隆并构建编码结核分枝杆菌MPT64分泌蛋白的重组表达质粒。[方法] 采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出MPT64基因(687bp)，并克隆到T载体，然后用双内切酶消化后，与同样酶消化的pGEX-4T-2连接，转化大肠杆菌E．coil DH5α，阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。[结果] 酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符，测序结果与文献报道一致，证实符合表达框架。[结论] 成功地克隆并构建了MPT64基因的重组表达质粒pGEX-MPT64。     

结核分枝杆菌Ag85B基因克隆及表达质粒构建

目的　克隆并构建编码结核分枝杆菌Ag85B分泌蛋白的重组表达质粒。方法　采用聚合酶链反应 (PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出Ag85B基因 (978bp) ,并克隆到T载体 ,然后用双内切酶消化后 ,与同样酶消化的pGEX 4T 2连接 ,转入大肠杆菌E .coliDH5α,阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果　酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符 ,测序结果与文献报道一致 ,证实符合表达框架。结论　成功地克隆并构建了Ag85B基因的重组表达质粒 pGEX Ag85BV。     

ESAT6在结核病中的最新研究进展

结核病是由结核分枝杆菌(MTB)引起的人兽共患慢性传染病,是威胁人类的三大传染性疾病之一,目前全世界大约有20亿人感染结核分枝杆菌,每年大约有200～300万的人死于     

结核分枝杆菌有质粒吗?

答:目前结核分枝杆菌没有发现质粒.在分枝杆菌方面已检测带有质粒的分枝杆菌有胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、偶然分枝杆菌和耻垢分枝杆菌.     

结核分枝杆菌特异性抗原ESAT6的串联表达及其免疫原性研究

目的表达并纯化ESAT6c2融合蛋白,并对融合蛋白免疫原性进行鉴定,以用作结核菌特异性IFN-γElispot试剂盒的特异性抗原。方法全基因合成ESAT6目的基因,利用Bam HⅠ和BglⅡ同尾酶串联目的基因,构建ESAT6c2-p ET25b重组质粒,转化E.coli,诱导表达。Ni柱亲和纯化融合蛋白,测定浓度后应用到T.SPOT-TB试剂盒(Oxford)检测临床样本进行免疫原性研究。结果成功构建了ESAT6串联表达重组质粒,制备出高纯度的ESAT6c2融合蛋白。临床样本检测结果表明ESAT6c2融合蛋白作为刺激源,与临床诊断相比特异性为100%(20/20),灵敏度为84.61%(33/39);与T.SPOT-TB试剂盒TA检测孔有较强一致性(Kappa=0.932)。稳定性研究也表明,ESAT6c2融合蛋白经加速破坏试验后,与临床诊断相比特异性为100%(20/20),灵敏度为84.38%(27/32);依然与TA检测孔有较强一致性(Kappa=0.923)。结论 获得的高纯度ESAT6c2融合蛋白,可以应用于结核菌特异性IFN-γElispot试剂盒。     

结核分枝杆菌三种基因重组质粒的构建及原核表达

目的构建结核分枝杆菌ESAT-6、CFP10、phoS2/pET28a表达重组质粒,并原核表达重组蛋白。方法将目的基因亚克隆到pET-28a表达载体,转化入大肠埃希菌BL21（DE3）plysS,诱导表达重组蛋白ESAT-6、CFP10、phoS2。结果成功构建基因工程菌株ESAT-6、CFP10、phoS2/pET-28a/BL21（DE3）plysS,表达重组蛋白ESAT-6、phoS2,因以包涵体形式存在,无法纯化。结论成功构建结核分枝杆菌ESAT-6、CFP10、phoS2/pET28a重组质粒,分别表达分子量约10×103、31×103的ESAT-6、phoS2重组蛋白,但无法纯化,CFP10不表达。     

结核分枝杆菌融合基因Hsp65-Esat6荧光表达载体的构建及表达

背景:Hsp65和Esat6之间的Linker编码一段疏水性多肽,其具有良好的柔顺性和折叠性,有利于翻译成融合蛋白时融合蛋白之间的空间折叠,使融合蛋白保持与两个天然蛋白空间构象的一致性,从而形成正确的构型而提高它们的免疫原性。目的:从结核分枝杆菌(MTB)H37Rv株中克隆目的融合基因Hsp65-Esat6,与报告基因EGFP一起构建真核表达载体pEGHsp65-Esat6,通过免疫组织化学法分别检测细胞中Hsp65蛋白和ESAT-6蛋白的表达。设计:单一样本实验。单位:暨南大学医学院微生物免疫学教研室。材料:质粒pVAE由华南理工大学曹以诚教授惠赠,MTBH37Rv株、大肠杆菌DH5α、表达质粒pEGFP-C1为本实验室保存,Hela细胞由本教研室胡萍博士惠赠。方法:实验于2005-09/2006-06在暨南大学医学院微生物与免疫教研室和中心实验室完成。以MTB全基因组为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65基因(不含终止子),与pEGFP-C1载体进行重组,构建pEGHsp65(不含终止子)重组质粒。再以pVAE质粒为模板,经PCR扩增出Linker-Esat6基因,与pEGHsp65质粒(不含终止子)进行重组,构建真核表达载体pEGHsp65-Esat6。通过限制性内切酶图谱测定pEGHsp65-Esat6融合质粒大小;对质粒pEGFP-C1的多克隆位点内的DNA序列进行序列分析鉴定;将质粒转染Hela细胞,观察荧光的表达情况及转染效率,通过免疫组织化学法分别检测细胞中Hsp65蛋白和ESAT-6蛋白的表达。主要观察指标:①pEGHsp65-Esat6融合质粒大小。②pEGFP-C1DNA序列分析。③转染后Hela细胞的荧光表达情况。④细胞中Hsp65蛋白和ESAT-6蛋白的免疫组织化学结果。结果:①质粒pEGFP-C1的大小约为4.7kb,而pEGHsp65为6.4kb,融合质粒pEGHsp65-Esat6约为6.7kb,在琼脂糖凝胶电泳图上可以分辨出泳动速度的差异。②结果与结核分支杆菌H37Rv株的Hsp65和Esat6的基因序列完全相同。③转染融合质粒24h后,使用共聚焦显微镜可观察到有部分细胞表达荧光蛋白,说明融合质粒转染成功,转染率约为30%。未转染的Hela细胞则无荧光表达。④通过免疫组织化学法证实融合质粒在Hela细胞内能正确表达出具有生物学活性的Hsp65与ESAT-6蛋白。结论:采用Hsp65和Esat6搭配作为免疫原,成功克隆并构建了结核分枝杆菌融合基因Hsp65-Esat6荧光真核表达质粒。     

结核分枝杆菌Rv3407基因的克隆及重组质粒的构建

结核病（TB）是由结核分枝杆菌（MTB）所致的以呼吸系统感染为主的慢性传染病。目前全球约有1／3的人口感染MTB,我国是世界上结核病负担最重的22个国家之一,近年来,由于卡介苗（BCG）保护性不完善、多重耐药MTB的出现、与人类免疫缺陷病毒（HIV）的协同感染以及人口流动等原因使TB疫情日益严重,我国新生儿感染率为美国的8倍。     

DcR3基因克隆、重组质粒构建及表达鉴定分析

目的研究DcR3a基因克隆、重组质粒构建及表达鉴定。方法采用PCR技术克隆DcR3cDNA编码序列，构建真核表达载体，然后检测重组DeR3／pAAV—IRES—hrGFP质粒在真核细胞中的表达。结果DcR3蛋白的表达正确。我们进一步用激光共聚焦显微技术成功检测到重组DeR3／pAAV—IRES—hrGFP质粒在真核细胞中的表达，并证明质粒中GFP与DcR3在真核细胞中的表达具有一致性。结论可以将重组质粒转染的真核细胞中GFP的表达作为DcR3表达的标志。     

Mfn2基因克隆及pEGFPmfn2真核表达质粒的构建

目的利用基因工程技术克隆线粒体融合蛋白2(mitofusin-2,mfn2)基因并构建一种无细胞毒性、不激活原癌基因的真核表达的pEGFPmfn2质粒载体。方法采用高效Trizol试剂快速提取大鼠血管平滑肌细胞株A7r5总RNA,经RT-PCR获得mfn2cDNA,扩增、纯化、回收mfn2基因片段并将质粒pEGFP-N1和mfn2基因片段分别双酶切,前者纯化回收大片段,后者纯化回收2.2 kb片段,再将回收的pEGFP-N1大片段与mfn2基因片段(2.2 kb)重组。对重组pEGFPmfn2质粒进行PCR和双酶切鉴定并测序。结果成功地从A7r5中克隆了mfn2基因,并构建了以pEGFP-N1为载体的真核表达质粒。结论含mfn2基因新型表达质粒构建的成功将为研究mfn2功能、进一步研究该基因异常表达与心血管疾病发生的关系奠定基础。     

结核分枝杆菌ESAT-6基因的克隆与表达

目的　对结核分枝杆菌的ESAT - 6基因进行克隆、鉴定与表达 ,为结核病的诊断、重组疫苗的应用打下基础。方法 　 以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板 ,用聚合酶链反应 (PCR)对ESAT - 6基因进行扩增 ,将扩增的产物连接于测序载体 pGEM T上 ,经测序反应确定无误后 ,再将PCR产物与原核表达载体pET4 2b(+)构建表达ESAT - 6的重组质粒 ,将重组质粒先转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒 ,经酶切鉴定后 ,再转化入表达宿主大肠杆菌BL2 1菌株内 ,对转化菌株进行诱导后 ,破菌 ,进行SDS -PAGE电泳。结果 　电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白 ,其表达的蛋白质相对分子质量为 990 0。结论 　 目的基因克隆到菌株内 ,重组结核分枝杆菌ESAT - 6的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测等奠定了基础     

结核分枝杆菌耐药基因与检测方法的研究进展

结核分枝杆菌(MTB)的高耐药问题已成为新世纪结核病控制的三大难题之一[1].近年来,随着分子生物学技术的迅速发展,人们对MTB耐药的分子机制进行了深入研究,并已取得了很大进展.本文就此内容综述于下.     

结核分枝杆菌耐药基因突变的研究

结核病在许多国家出现回升的一个主要原因是细菌耐药性问题 ,随着联合药物治疗的使用 ,又出现了耐多药结核分枝杆菌 (结核菌 ) ,使许多结核病 ,难以治疗 ,增加了死亡率[1] 。目前对于结核菌的耐药机制的研究已有了较大的进展 ,细菌内一些酶的基因突变或缺失是导致耐药的重要原因。随着分子生物学技术的发展 ,通过聚合酶链反应 (PCR)等方法对耐药基因进行快速检测 ,大大缩短了检测时间 (2～3d) ,为耐药结核菌的治疗提供参考。本研究通过PCR -SSCP ,PCR -测序技术检测结核菌临床分离株的katG、rpoB和rpsL基因序列 ,分析济南军区结核菌…     

结核分枝杆菌mpt64基因突变研究

目的分析结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)mpt64基因突变情况。方法提取MTB标准株H37Rv和45株MTB临床株的DNA,扩增mpt64基因并进行序列分析。结果 MTB标准株H37Rv和44株MTB临床株的mpt64基因无突变,1株MTB临床分离株的mpt64基因存在63个碱基的缺失突变。结论结核分枝杆菌mpt64基因突变频率低。     

结核分枝杆菌抗原优势肽段融合抗原38kD-ESAT6-CFP10的构建与抗原性初步检测

目的为了提高结核病诊断试剂的特异性和敏感性,构建了结核分枝杆菌抗原优势肽段融合抗原38kD-ESAT6-CFP10,并且采用双抗原夹心ELISA方法初步分析了该融合抗原的抗原性。方法运用生物学软件分析抗原优势肽段并模拟其串联后的三维结构,以确保串联后仍保持良好的抗原性。通过PCR方法分别扩增38kD、ESAT-6和CFP40抗原优势肽段基因并将其进行连接,然后将融合基因分别连接入pBVIL1和pGEX-4T-2表达载体,在大肠杆菌菌株DH5α中进行表达。将两种不同载体表达的38kD-KSAT6-CFP10融合抗原分别作为包被抗原和标记抗原,以双抗原夹心ELISA方法初步评价其抗原性。结果获得了38kD、ESAT-6和CFP10的抗原优势肽段融合抗原38kD-ESAT6-CIW10,并在大肠杆菌中进行了高效表达,初步验证所获得的抗原具有良好的抗原性。结论该种抗原优势肽段融合抗原有望成为结核病血清学诊断的重要候选抗原,并且双抗原夹心ELITSA方法有助于提高检测的特异性和敏感性。     

依赖利福平结核分枝杆菌的分子生物学研究

目的　从分子生物学的角度研究依赖利福平结核分枝杆菌 (依R菌 )。方法　采用DNA自动测序仪 ,对菌株rpoB基因片段 ( 319bp)的序列进行分析 ;采用随机扩增DNA聚丙酰胺凝胶电泳 (RAPD PAG)指纹分型法 ,对菌株的DNA指纹进行分型 ;采用SDS聚丙酰胺凝胶蛋白电泳法 ,对菌株的菌体蛋白进行分析。结果　 30株依R菌rpoB基因的突变率为 96 7% ( 2 9/ 30 ) ,37株耐利福平结核分枝杆菌 (耐R菌 )为 81 1% ( 30 / 37) (P <0 0 1) ,依R菌和耐R菌的突变高发位点均为 5 31位( 37/ 5 9,6 3 2 % ;)密码子、突变 ,其次为 5 16位 ( 13/ 5 9,2 2 8% )和 5 2 6位 ( 7/ 5 9,12 3% ) ;依R菌和耐R菌两组菌株的DNA指纹结果可分为 5种类型 ,其中以Ⅱ型 ( 31/ 6 7,46 2 % )、Ⅰ型 ( 2 0 / 6 7,2 9 9% )和Ⅲ型 ( 13/ 6 7,19 4% )为主 ;3种主要类型的指纹在两组菌株中的分布无明显特殊性 ;依R菌在含R管和对照管中的菌体蛋白电泳图谱有 76 7% ( 2 3/ 30 )的不同 ,其在含R管中菌体蛋白表达丰富 ,且在分子量 310 0 0～ 43 0 0 0间有一宽带 ;37株耐R菌其两管的菌体蛋白电泳图谱各自均相同。结论　依R菌和耐R菌的基因型密切相关 ;依R菌的蛋白表达可依赖于R。