基因芯片检测乙肝病毒YMDD变异及其临床意义

目的 检测拉米呋啶治疗慢性乙肝病人YMDD变异情况与血清HBV DNA、ALT水平等指标的关系。方法 利用基因芯片、ELISA及生化检测技术检测180例慢性乙肝患者服用拉米呋啶6～24个月后YMDD变异、HBV DNA及ALT水平变化。结果 180例患者中，168例HBV DNA、ALT不同程度下降，随用药时间的延长，部分患者（2g例）的YMDD出现变异，同时HBV DNA及ALT水平出现反跳。结论服用拉米呋啶的慢性乙肝患者的YMDD发生率与时间长短有关，血清HBV DNA及ALT与YMDD相关，由此可以预测拉米呋啶治疗的乙肝病人的YMDD发生率。     

基因芯片法检测HBV多位点变异和基因分型的临床价值

目的 运用基因芯片技术检测临床乙肝患者血清中HBV病毒的相关耐药基因突变及基因分型,评价该方法 在监测HBV耐药及基因分型中的作用.方法 在使用不同核苷类药物的260例乙肝患者血清中,采用寡核苷酸探针芯片检测其携带的HBV相关耐药基凶变异情况及基因型,并随机挑取40例第2次扩增产物进行DNA序列分析.结果 经基因芯片检测到拉米呋啶耐药31例(19.4%),阿德福韦酯耐药6例(6%).260例患者中C基因型180例(69.2%),B型59例(22.7%),BC混合型21例(8.1%).结论 基因芯片法可同时检测针对拉米呋啶、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比呋啶的多重耐药基因位点以及基因分型,与基因测序法比较,结果 完全一致,是一种可靠的检测方法 ,可为临床抗病毒药物的科学选择提供参考.     

PCR-ELISA检测血清中HBV 聚合酶YMDD基因变异

目的用PCR-ELISA检测HBV聚合酶YMDD基因的变异. 方法采用混合引物,并通过降低PCR反应体系中dNTPs、引物等成分的浓度,以及提高退火温度等措施,对YMDD基因的各种变异型进行特异扩增,再采用37℃液相杂交和ELISA方法对PCR扩增产物进行检测,从而实现PCR-ELISA方法进行YMDD基因变异的检测. 结果该方法可以检测出已知的变异YMDD基因序列,可以检测2×10个拷贝的模板量,同时可以从1000个正常YMDD基因序列中检测出1个变异的YMDD基因序列,检测结果不受正常YMDD基因序列干扰. 对30例经过6 mo以上拉米夫定治疗的患者血清进行检测,检测出4例YMDD基因变异,并经过测序证实. 结论该PCR-ELISA法可以对血清中HBV DNA YMDD基因变异进行检测.     

PCR微流芯片与基因芯片、基因测序在HBV基因型、病毒变异上应用比较

目的 对PCR微流芯片与基因芯片、基因测序在HBV基因型、病毒变异上应用进行比较。方法 分别采用PCR-微流芯片、基因芯片法对15例临床考虑拉米呋定耐药的患者血清进行HBV多点变异检测，从中随机抽取8例患者标本采用PCR-微流芯片、基因测序法进行HBV基因型、HBVYMDD检测。结果 基因芯片法与PCR--微流芯片检测HBV多点变异9／15三项完全一致，3／15两项一致；8例患者双份标本两种方法检测HBV基因型结果完全一致均为IIBVC型；基因测序法8例患者中1例HBVYMDD阳性，PCR微流芯片法8倒患者中栓出2倒HBVYMDD。结论 PCR-微流芯片法与基因芯片法、基因测序法有较好的一致性．适用于临床和流行病学调查研究。     

乙型肝炎病毒耐药变异与基因型检测在临床上的应用

目的 建立直接测序法检测HBV P区耐药变异情况并分析基因型.探讨HBV基因型与临床病情的关系.方法 检测46例乙肝患者血清样本,采用特异的引物对待检标本HBV P区进行PCR扩增后作基因序列检测,利用Chromas2.23软件对测序结果 进行分析有无突变产生,测序结果 用软件clustalx1.81进行基因分型分析.结果 可通过一次测序反应完成对HBV.DNA P区的基因检测及基因型分析.检出YMDD变异株8例,其中YIDD 5例,YVDD 3例.在检测的46例标本中23例为B基因型,阳性率为50.0%;有21例为C基因型,其阳性率45.6;D基因型2例,阳性率4.4%.B基因型HBV感染者中HCC 2例,占8.7%;C基因型HBV感染者中HCC 8例,占38.1%.结论 直接测序法分析HBV常见耐药突变位点及基因型准确可行,B基因型乙肝患者预后优于C基因型患者.     

乙型肝炎病毒核酸YMDD变异检测

拉米呋啶是常用的核苷类抗乙肝病毒药物，对乙肝病毒有明显抑制作用，但在长期用药过程中，部分病毒可出现耐药性。一般认为，此耐药性与HBV多聚酶基因YMDD氨基酸序列（酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸）中的核酸变异有关。本文对112例慢性乙肝患者血清标本进行了YMDD检测，同时监测其血清HBV—DNA和ALT水平变化以及与乙肝血清标志物的关系，旨在探讨YMDD变异对拉米呋啶治疗效果的影响。     

应用错配PCR和限制性片段长度多态性分析技术检测HBV YMDD变异株

目的：建立简便易行的检测乙型肝炎病毒（HBV）多聚酶基因（P基因）上YMDD变异株的方法，评价运用拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患对此变异的影响，方法：采用套式／错配聚合酶链反应（PCR）结合限制性片段长度多态性（RFLP）分析技术对108例治疗前HBV DNA（PCR）阳性正在拉米夫定治疗中的慢性乙型肝炎患者的HBV YMDD变异情况进行检测。结果：运用上述技术能有效区分HBV YMDD野生株和变异株，上述108例患者经拉米夫定治疗后，HBV DNA阴转者63例（58．3％），HBV YMDD野生株和变异株分别为23例（21．3％）和22例（20．4％），结论：建立的套式／错配PCR－RFLP分析技术可用于HBV YMDD变异株的临床监测，拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患者可导致部分患者的HBV多聚酶基因上YMDD发生变异。     

基因芯片技术在检测乙型肝炎病毒 P区YMDD变异中的研究

目的 用基因芯片检测未经抗病毒治疗的HBV DNA阳性血清中HBV P区YMDD变异情况,从分子生物学角度了解YMDD两种变异的状态,为科学合理地指导临床抗病毒治疗及预测患者临床预后提供有力的依据。方法 将150份未经抗毒治疗的HBV DNA阳性血清,用PCR方法扩增P区,扩增产物与基因芯片上的寡核苷酸进行杂交,杂交结果通过扫描仪扫描到计算机上,经软件分析可得到HBVY MDD野生型及其YVDD和／或YIDD变异型结果,并对部分阳性标本用基因序列测序证实。结果 150份HBV DNA阳性血清,用基因芯片方法检出阳性标本(包括YMDD野生型和变异型)共122例,占81．3％,阴性标本28例,占18．7％;在122例阳性标本中,单纯YMDD野生型(即无变异标本)有90例,占73．8％;YVDD变异28例,占22．9％;YIDD变异2例,占1．6％;YVDD和YIDD混合变异2例,占1．60A,,变异株检出率为26．2％,而且变异株均与野生株共存。其中8份阳性标本进行基因序列测序,证实与芯片检测结果完全一致。结论(1)用当前先进的基因芯片技术检测HBVP区YMDD变异,操作简便,结果可靠,特异性高。(2)基因芯片可快速、同时、多人份检出HBVYMDD野生株及其YIDD和／或YVDD突变株的共同感染。(3)部分HBV感染者在未经抗病毒治疗情况下已自然存在HBV YMDD变异,而且变异株均与野生株共存,其中以YVDD变异为多。(4)HBV感染患者在治疗前后有必要检测是否存在HBV YMDD变异株感染,为指导临床科学合理用药和制定治疗方案提供依据。     

分子病理学在临床上的应用

目的:举例说明北京大学基础医学院病理学系目前将分子生物学技术应用于临床病理诊断.方法:采用PCR、RT-PCR、PCR-RFLP、TGGE、DNA序列分析及免疫组化等分子病理学方法辅助诊断.结果:(1)滑膜肉瘤:有特征性的t(X;18)(p11.2;q11.2),产生融合基因SYT-SSX,故采用RT-PCR法检测滑膜肉瘤的SYT-SSX融合基因的转录子有助于滑膜肉瘤的病理诊断,SYT-SSX融合基因根据基因断裂点位置不同,分为SYT-SSX1和SYT-SSX2两种,其中SYT-SSX1阳性的滑膜肉瘤预后较差,因此可作为预后判断指标.(2)大细胞间变性淋巴瘤:部分病例显示t(2;5)(p23;q35),产生NPM-ALK融合基因和融合蛋白,通过免疫组化法检测NPM-ALK融合蛋白,将大细胞间变性淋巴瘤分为ALK(+)和ALK(-)两个亚型,ALK(+)预后较好,具有判断预后价值.(3)家族性高胆固醇血症(简称FH):研究FH的低密度脂蛋白受体基因(LDLR)的突变对于遗传监测和动脉粥样硬化的防治具有重要意义.我们采用温度梯度凝胶电泳(简称TGGE)及DNA测序方法研究LDLR基因突变.(4)长期拉米呋啶治疗所致的HBV DNA多聚酶基因YMDD突变的快速检测:拉米呋啶是目前最有效的抑制HBV复制的药物,但长期用药会导致部分患者的HBV DNA多聚酶基因发生YMDD区段突变而对拉米呋啶耐药.采用巢式PCR法扩增了患者血清中和肝穿石蜡组织中的HBV DNA多聚酶基因片段并测序,同时采用PCR-RFLP法检测患者HBV DNA多聚酶基因YMDD区段突变,显示PCR-RFLP结果与DNA测序结果完全吻合.因此PCR-RFLP法是一种准确、简便的检测HBV YMDD突变的方法.结论:传统的外科病理学诊断依靠组织标本的大体和镜下表现,并结合临床病史和实验室检查结果.组织病理学检查在病理诊断方面具有重要作用,但存在局限性,只有部分病例与临床预后相符.而采用分子遗传学方法重新将疾病分类则能克服组织学检查的某些局限性.     

HBV P基因YMDD变异的检测及临床应用的初步研究

目的采用错配PCR扩增方法进行HBVP基因YMDD变异的检测，对其临床意义进行初步的研究。方法应用分子克隆方法，构建YMDD、YVDD和YIDD变异的阳性质粒，并对该方法进行敏感性及特异性试验。对65例未经抗病毒治疗的乙型肝炎患者检测YMDD变异情况。结果经PCR方法、酶切鉴定及直接测序鉴定出YMDD、YVDD和YIDD质粒构建成功，且该方法具有较好的敏感性和特异性。65例未经拉米夫定治疗的乙型肝炎患者存在YMDD变异，出现变异6例，阳性率为9．07％；其中YIDD和YI／YMDD各1例，YVDD3例，YV／YMDD1例。结论本检测方法简便、实用，在未经抗病毒治疗的患者中可存在YMDD变异，其与野生株一样是自然存在的，抗病毒药物压力不是导致HBV YMDD变异的唯一因素。     

拉米夫定耐药株感染者基因型、HBV DNA及多聚酶P区基因变异的关系

目的分析拉米夫定耐药株感染者的基因型、HBVDNA及多聚酶P区基因变异的关系。方法应用PCR扩增和直接测序法检测83例拉米夫定耐药患者HBV基因型、HBVDNA及多聚酶P区的基因变异。结果83例拉米夫定耐药患者B基因型26例,C基因型57例,B型YIDD变异率69．2％（18／26）、YVDD变异率30．8％（8／26）,C型YIDD变异率63．2％（36／57）、YVDD变异率33．3％（19／57）,B、c基因型发生YMDD变异模式无统计学差异（P〉0．05）;B型rtM204I突变率53．8％（14／26）,综合变异率46．2％（12／26）,C型rtM2041变异率26．7％（15／57）,综合变异率73．7％（42／57）,B、C基因型变异位点类型有统计学差异（P〈0．05）;耐药变异时c型HBVDNA水平（6．60±1．42）lg拷贝／毫升高于B型（5．88±1．46）1g拷贝／毫升,YIDD变异时c型（6．40±1．48）lg拷贝／毫升、B型（5．68±1．32）1g拷贝／毫升,YVDD变异时C型（6．18±1．87）1g拷贝／毫升、B型（6．82±1．45）lg拷贝／毫升;rtM204I变异时B型（6．12±1．45）lg拷贝／毫升、C型（5．57±1．45）lg拷贝／毫升（P〉0．05）;综合变异时c型（6．68±1．51）lg拷贝／毫升,B型（5．76±1．57）lg拷贝／毫升（P〈0．05）。结论c基因型拉米夫定耐药发生率高于B型;基因型与变异位点类型有关,与YMDD变异模式无关;耐药变异时HBVDNA水平c型高于B型,与综合变异有关,与YMDD变异模式无关。     

PCR-反向斑点杂交法检测HBV YMDD模序混合感染

目的为HBV感染临床个体化治疗、指导临床用药寻找一种能更好地检测HBV YMDD模序混合感染的方法。方法28份已知乙肝病人血清,其中10份为HBV YMDD模序感染,5份为HBV YIDD模序感染,5份为HBV YVDD模序感染,2份为HBV YMDD和YIDD模序混合感染,2份为HBV YMDD和YVDD模序混合感染,2份为HBV YIDD和YVDD模序混合感染,2份为HBV YMDD、YIDD和YVDD模序混合感染,都用PCR产物直接测序和PCR-流过式反向斑点杂交(Flowthrough-RDB)方法检测。结果HBV YMDD模序单一感染标本用两种方法检测准确性都达到100%,对混合感染标本PCR-流过式反向斑点杂交方法检测准确性也可达100%,然而用PCR产物直接测序方法只能检测其中一种或两种型别。结论PCR-流过式反向斑点杂交方法是一种敏感、特异和快速的检测HBV YMDD野生型及其突变型模序单一感染和混合感染的有效方法,比PCR产物直接测序更优越,更有利于实现临床个体化治疗和指导临床用药。     

基因芯片检测拉米夫定引起的乙型肝炎病毒基因YMDD变异的研究

目的:建立乙型肝炎病毒(HBV)变异基因诊断芯片,对拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中出现的肝炎病毒P基因区YMDD变异进行快速准确的检测诊断。方法:设计特异性寡核苷酸探针。用点样法制备HBV变异基因诊断芯片。选择住院患者30例服用拉米夫定后,HBVDNA转阴[<500拷贝(opies/ml)]68周后又反跳≥5000copies/ml的患者进行基因芯片杂交检测。同时用PCR直接测序法对30例患者血清标本进行双盲HBVDNA聚合酶活性区域测序对照。结果:30例服药后HBVDNA反跳患者中基因芯片测得HBVYMDD变异21例,其中YVDD变异11例,YIDD变异10例。直接序列测定发现有核苷酸A741变为G,使氨基酸由蛋氨酸552变为缬氨酸(氨基酸基序由YMDD变为YVDD)11例,有6例核苷酸A669变为C,使氨基酸由亮氨酸528变为蛋氨酸;核苷酸G743变为T,使氨基酸由蛋氨酸552变为异亮氨酸(氨基酸基序由YMDD变为YIDD)10例。其中有3例伴有核苷酸T781变为C,使氨基酸由亮氨酸565变为脯氨酸。其结果与基因芯片完全一致。结论:HBV变异基因诊断芯片可以同时检测YVDD、YIDD变异,同PCR直接测序法比较,准确率达100%,无假阳性。     

乙型肝炎病毒基因型和基因变异在乙型肝炎病毒相关性肾小球肾炎中的意义

目的探讨HBV基因型及基因变异等病毒因素在乙型肝炎病毒相关性肾小球肾炎（HBV-GN）中的意义。方法选择41例HBV-GN患者,采用荧光PCR法检测HBV-GN患者基因型,HBV多态性芯片检测基因变异,同时测定尿常规、肾功能和血压等临床资料。结果41例HBV-GN患者,B基因型14例,C型24例（86．8％）,B＋C混合型3例。B型和C型患者间24h尿蛋白有显著性统计学差异（P〈0．05）,尿红细胞计数、血压、尿素氮和血清肌酐无显著性统计学差异（均P〉0．05）。12例为前C区1896位变异,1896位变异与未变异者间小便常规,血压和肾功能无显著性差异。结论HBV-GN患者HBV基因以B、C两型为主,C型为多。C型患肾脏损害可能更为严重。前C区1896位变异和YMDD变异对HBV-GN患者小便常规、血压和肾功能无明显影响。     

拉米夫定治疗中乙肝病毒多聚酶YMDD变异对患者临床经过的影响

研究乙肝病毒(HBV)多聚酶YMDD变异后HBVDNA复现对慢性HBV感染患者临床经过的影响。方法用mpPCR-RFLP技术检测24例拉米夫定治疗过程中出现HBVDNA复现的患者血清,对YMDD变异者的系列临床资料,应用SAS软件进行统计学分析。结果检出YMDD变异18例;YMDD变异后转氨酶水平较HBVDNA转阴时有显著升高,并反跳至治疗前水平。结论出现YMDD变异后,部分病例可有类似肝炎发作、甚至肝脏失代偿的表现。     

耐拉米夫定乙型肝炎病毒变异株全基因组克隆及鉴定

目的:扩增并克隆耐拉米夫定乙型肝炎病毒(HBV)变异株全基因组DNA,为构建含双体HBV YMDDDNA质粒和HBV YMDD变异株细胞模型及研究药物筛选奠定基础。方法:从一名耐拉米夫定的慢性乙型肝炎病人血清中提取HBV病毒DNA,用错配PCR结合限制性片段长度多态性(RFLP)进行变异分析,然后采用PCR方法在HBV负链开环缺口处及基因组中单一酶切点(SpeⅠ)处,设计两对引物从两个方向分别扩增1.15 kb和2.05 kb的单链及双链DNA区,利用基因重组技术,将两片连接后克隆至质粒pcDNA3.1-中,再进行DNA序列测定。结果:错配PCR结合RFLP分析证实该病毒存在YVDD变异,通过两段法克隆出HBV全基因组,经序列分析所得为HBV YMDD变异株全基因组。结论:成功克隆出HBV YMDD变异株全基因组。     

HBV耐拉米夫定多聚酶基因变异检测方法的建立

目的 建立一种简便，准确，实用的乙型肝炎病毒（HBV）耐拉米夫定多聚酶基因变异检测方法。方法 根据已公布的HBVDNA序列，在HBV多聚酶基因区设计并合成了两对寡核苷酸引物，其中一只为错配引物；应用巢式错配聚合酶链反应特异性扩增含有HBV多聚酶基因YMDD基序的片段，扩增产物用限制性内切酶（NdeⅠ）酶切，琼脂糖凝胶电泳，观察酶切后的目的片段限制性片段长度多态性（RFLP）图谱，部分标本进行DNA测序，结果 （1）所建立的巢式错配PCR-RFLP方法操作简便，快速，从DNA提取到酶切后电泳分析仅需要11小时；灵敏度高，可以检测到10^3copies/ml的HBVDNA；特异性强，结果准确，经DNA测序证实，（2）应用该方法对20例长期服用拉米夫定的慢性乙型肝炎患者的系列血清进行了检测，发现YMDD变异者（45%）9例，YMDD野毒株者（55%）11例，表明该方法可有效地鉴别HBVYMDD野毒株与变异株，结论 本实验所建立的巢式错配PCR-RFLP方法简单，敏感，特异，适合于一般实验室应用及大规模的人群调查。