臂丛根性撕脱伤激活脊髓表达磷酸化CaMKⅡ的时程及定位研究

目的研究大鼠臂丛根性撕脱伤后磷酸化CaMKⅡ的时间和空间定位。方法将SD大鼠（6-8周龄）在手术显微镜下做臂丛根性撕脱伤手术后,应用Western blot方法测定相应脊髓节段（C7、C8）磷酸化CaMKⅡ在1、2、3d时间点及正常大鼠的表达水平。同时应用免疫荧光染色方法检测目标蛋白在1d时间点大鼠脊髓节段的表达水平及空间定位。结果正常大鼠脊髓相应节段检测不到磷酸化CaMKⅡ,在臂丛根性撕脱伤后1～2d对应脊髓节段的磷酸化CaMKⅡ表达明显升高,撕脱伤后3d明显下降并接近正常水平;免疫荧光结果显示：臂丛根性撕脱伤后1d,损伤侧脊髓前角运动神经元和中间神经元明显表达磷酸化CaMKⅡ,对侧脊髓前角运动神经元和中间神经元也有表达。但强度较撕脱侧明显减弱。结论臂丛根性撕脱伤诱导磷酸化CaMKⅡ在损伤节段1d时高表达,然而在3d时逐步下降到正常水平。     

RNA干扰技术抑制nNOS基因对根性撕脱伤脊髓运动神经元的影响

目的研究神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)基因在臂丛神经根撕脱伤中的作用地位。方法设计、筛选并构建针对nNOS基因的siRNA表达载体,建立C5～T1神经根撕脱伤SD雄性大鼠模型,于撕脱后14d脊髓鞘内给予nNOS的siRNA干预,3d后用NADPH-d酶组化反应结合中性红染色评估撕脱伤脊髓运动神经元的nNOS基因表达水平和创伤神经元的存活率。结果臂丛C5～T1根性撕脱伤17d后,C7节段损伤侧前角运动神经元的存活率在siRNA组、siRNA序列对照组和生理盐水组分别为(80.51±9.16)%、(88.26±2.95)%和(89.13±3.47)%;C7节段损伤侧前角运动神经元的nNOS阳性率为(18.10±6.63)%、(42.21±2.29)%和(39.46±2.41)%。nNOS的siRNA能显著减低撕脱伤诱导的nNOS蛋白在前角运动神经元内的表达水平。虽然与对照组相比,nNOS-siRNA组撕脱伤后运动神经元存活率有下降趋势,nNOS的siRNA但并未对撕脱伤导致的运功神经元的死亡造成显著影响。结论鞘内应用siRNA技术能下调撕脱伤后大鼠脊髓运动神经元内nNOS蛋白的表达,nNOS基因有可能发挥维持撕脱伤后运动神经元存活的作用。     

臂丛损伤脊髓运动神经元与神经根GAP-43 mRNA表达

目的：探讨臂丛根性撕脱伤后脊髓腹角运动神经元胞体及其神经根GAP-43 mRNA的表达变化及其影响因素,为臂丛损伤的修复治疗提供理论依据.方法：本实验创立三种臂丛根性撕脱伤模型：C7前根撕脱（Ⅰ组）;C7前根撕脱＋切断同侧C5～T1后根（Ⅱ组）;C7前根撕脱＋C5和C6之间作同侧脊髓半横断（Ⅲ组）.术后2周按CBS评分标准检查动物神经缺失症状,用SYBR Green荧光定量RT-PCR方法检测脊髓腹角运动神经元胞体及其神经根GAP-43 mRNA的表达改变.结果：根据CBS评分标准,对照组计为0分,Ⅰ组计分较低、Ⅲ组计分最高.对照组C7神经元胞体和C7神经根中GAP-43 mRNA表达量相近,但三种损伤组术后2周神经元胞体内GAP-43 mRNA表达均上调,而神经根内表达却下调.结论：（1）臂丛根性撕脱伤后脊髓腹角运动神经元胞体GAP-43 mRNA表达受突触前机制的调控;（2）臂丛损伤2周时神经元胞体内GAP-43 mRNA表达呈现高峰期,此时进行神经移位术将显著提高神经修复的效果.     

电针疗法对臂丛根性撕脱伤脊髓后角及中央管nNOS蛋白表达的影响

目的采用电针疗法干预大鼠臂丛神经撕脱伤模型,探索电针疗法对臂丛根性撕脱伤脊髓后角及中央管n NOS蛋白表达的影响。方法健康、雌性成年Sprague-Dawley(SD)大鼠共40只,行臂丛神经根性撕脱手术,随机分为撕脱伤组(AV组)和撕脱伤加电针治疗组(AV+EA组),AV+EA组动物隔日接受大椎(DU4)和手三里(LI10)电针治疗直至处死,每次治疗的输出脉冲波形为非对称双向疏密波,以20 Hz频率不间断治疗15 min。动物存活1周、2周、3周、6周处死,选取C7节段脊髓,行NADPH-d酶组织化学染色和中性红复染。结果脊髓后角,在AV组n NOS的微量表达;在AV+EA组2~3周n NOS在健侧的表达比伤侧增多,至6周脊髓后角n NOS阳性神经元表达AV组损伤侧;AV+EA组n NOS阳性神经元的表达与同时期的AV组。结论电针疗法导致脊髓后角及中央管n NOS阳性神经元的时空表达特异性。     

幼年大鼠臂丛根性损伤模型的构建及其评价

目的：构建幼年大鼠臂丛损伤动物模型并对该模型进行评价。方法：选取20只幼年（P18）SPF级SD大鼠，手术撕脱实验组大鼠左侧臂丛根（C5～C7），造成大鼠臂丛根性撕伤，观察大鼠行为学和脊髓前角运动神经元的组织病理学变化。结果：实验组SD大鼠行为学出现明显异常，并且脊髓前角运动神经元在数量上较对照组显著减少；透射电镜显示实验组脊髓前角运动神经元超微结构也出现明显变化。结论：该方法可成功构建幼年SD大鼠臂丛根性撕脱伤动物模型，为分娩性臂丛损伤研究提供了一个科学可行的实验平台。     

葛根素对臂丛根性撕脱后脊髓MMP-9蛋白表达的影响

目的　探讨大鼠臂丛根性撕脱后脊髓基质金属蛋白酶-9（MMP-9）蛋白的表达变化以及葛根素对其表达的影响。 方法　成年雄性SD大鼠174只，随机分为正常组、模型组、葛根素低、中、高处理组。模型组和葛根素处理组行右侧C5~C7脊神经前根撕脱术，术后腹腔注射给药。Western Blot法检测C5~C7节段脊髓MMP-9蛋白的表达。 结果　与正常组比较，臂丛神经根性撕脱后1 d时MMP-9蛋白表达达高峰，3 d降至接近正常，1周后下降至较低水平。葛根素处理组脊髓组织MMP-9蛋白表达在1 d时比模型组显著降低。 结论　MMP-9可能参与臂丛根性撕脱后早期损伤反应，且葛根素可能有助于减轻该种损伤。     

神经根撕脱后脊髓运动神经元的病理表现

目的:观察神经根撕脱后脊髓前角运动神经元的病理表现,探讨在该条件下运动神经元死亡的神经生物学机制。方法:选择成年SD雌性大鼠20只,体重200-300g,撕脱右侧臂丛C₅-T₈神经根,术后动物存活3d、5d、1周后取C₅-C₈节段脊髓,对冰冻切片行NADPH-d组化、c-jun免疫组化、中性红和HE染色。观察神经元的形态,计数脊髓前角NOS阳性运动神经元及存活运动神经元数目,以非损伤侧的前角运动神经元数目为100%,计算百分比。结果:神经根撕脱3d、5d、1周后,损伤侧脊髓前角NOS运动神经元平均阳性率分别为:0.74%±0.59%、24.83%±6.73%、51.16%±8.67%。神经元平均存活率分别为93.00%±4.32%、93.67%±5.27%、89.83%±2.65%;c-Jun从撕脱术后3d就有表达,5d后表达开始减少。运动神经元形态变化不明显。1周时偶见前角运动神经元的胞核偏位,但核膜清晰,核仁尚存,染色体固缩。结论:脊神经根撕脱1周内,脊髓前角运动神经元NOS表达递增,c-Jun表达递减,运动神经元开始死亡。NO/NOS可能通过抑制神经元损伤后的再生反应,促进脊髓前角运动神经元的死亡。     

外源性一氧化氮对臂丛根性撕脱伤后脊髓的影响

目的探究在根性撕脱伤早、中期应用外源性一氧化氧(NO)供体硝普钠补充NO能否改变撕脱伤诱导运动神经元的凋亡进程及其相关机制。方法成年SD大鼠,右侧全臂丛神经根撕脱后于4 d和13 d分别在蛛网膜下腔受损脊髓节段局部给予NS或5 mmol/L SNP各4μL,存活2d后处死。取C7节段脊髓应用免疫组织化学以及酶组织化学、中性红染色、Western blot等方法,定量存活运动神经元数以及nNOS蛋白在运动神经元的表达情况;同时检测i NOS、GFAP、0X-42在胶质细胞的表达情况。结果 SNP 40 mmol/L以上剂量局部应用会导致动物立刻死亡,我们选择了5 mmol/L做为最终SNP浓度;SNP会降低撕脱伤脊髓运动神经元的存活率(%)6 d时间点SNP组与NS组无显著差异;15 d时间点,SNP组(57.41±3.96)显著低NS组(81.48±2.53);撕脱伤引起的小胶质细胞和星形胶质细胞反应与NS组相比加剧。结论在早期补充NO使前角运动神经元nNOS表达时间提前;加剧损伤脊髓的胶质反应;使运动神经元死亡时间提前,死亡程度增加。     

条件性损伤的时间与频次对神经根撕脱伤后脊髓前角运动神经元死亡及NOS表达的影响

目的　探索条件性损伤 (CL)的时间和频次对神经根撕脱 (TL)后脊髓前角运动神经元一氧化氮合酶 (NOS)表达及细胞死亡的影响。方法　成年SD雌性大鼠 116只 ,体重 2 0 0～ 30 0g ,以钳夹神经干为CL ,分为两个系列。时间系列 :在CL后 1d、3d、1w、2w后进行TL ,频次系列分别在 1w和 2w内行 1次、2次、6次钳夹 ,术后不同时间点处死动物 ,以单纯撕脱臂丛为对照 ,取C5～C8节段脊髓 ,行NADPH d组化染色 ,中性红复染。定量观察前角运动神经元NOS表达及神经元数目。结果　单纯撕脱组术后第 5d脊髓前角运动神经元开始表达NOS ,术后 3wNOS阳性神经元数达到高峰 ,随后逐渐下降并伴有神经元丢失。时间系列 :撕脱后 3d和 2w ,CL与TL间隔 1d组的NOS表达和神经元数目与对照组无显著性差异 ,但 3d、1w、2w组的NOS细胞数及神经元的丢失均较对照组明显 (P <0 0 5P <0 0 1) ,但在撕脱后 4w各CL时间的NOS表达和神经元存活均较对照组减少 (P <0 0 5 )。频次系列 :在 1w和 2w内增加CL次数可使NOS的表达水平和神经细胞的死亡数目有显著增加 ,在撕脱后 2w和 4w等较后的时间点更为明显 ;但在一定时间内 2次与 6次钳夹之间则无显著性差异。结论　条件性损伤与二次损伤之间的间隔影响撕脱后神经元NOS表达和神经元的死亡 ,以间隔时间     

热休克蛋白27对臂丛神经根撕脱后脊髓运动神经元NOS的影响

目的:观察热休克蛋白27(Hsp27)对大鼠臂丛神经根撕脱后脊髓运动神经元一氧化氮合酶(NOS)表达的影响.方法:Wistar大鼠60只,随机分为实验组和对照组.实验组动物分别以45℃预处理热处理15 min,再置于42℃维持20min,置室温恢复24 h后,手术显微镜下进行脊髓C5～C8节段神经根撕脱术;对照组仅施行臂丛神经根撕脱术,两组分别于术后12 h、1 d、3 d、5 d、7 d处死动物.各组取C5～C8节段脊髓,行Hsp27免疫组化、NADPH-d组化染色,结合自动图象分析系统对结果进行半定量分析.结果:①实验组在12 h即有NOS大量表达,之后迅速同落;对照组伤后第5天开始大量出现NOS阳性.②两组Hsp27表达高峰均在热休克后1 d,且实验组强于对照组.结论:臂丛神经根撕脱伤后Hsp27可能通过抑制NOS神经元来发挥其细胞保护作用.     

小动物PET-CT在大鼠臂丛根性撕脱脊髓损伤的应用研究

目的探究使用小动物正电子放射断层扫描(PET)/计算机断层成像(CT)技术诊断大鼠神经根撕脱导致的脊髓损伤的程度。方法对正常SD大鼠,通过尾静脉或腹腔注射不同剂量18F-FDG,筛选最优注射方式及剂量;随后,建立SD大鼠右侧全臂丛根性撕脱模型(BPRA组)并以假手术大鼠为对照组,对术后2周大鼠进行18F-FDG-micro-PET-CT成像检测,计算脊髓节段每克组织放射性占注入量的百分比(%ID/g),比较BPRA和假手术组大鼠C5~T1脊髓组织18F-FDG摄取差异。结果尾静脉注射1μCi/g的示踪剂18F-FDG,40 min后进行micro-PET-CT扫描其效果最佳;假手术组大鼠下颈段脊髓节段18F-FDG摄取均匀,而右全臂丛根性撕脱伤术后2周,BPRA模型组颈段脊髓18F-FDG摄取高亮范围增大,脊髓C5~C8、T1节段18F-FDG摄取率(%ID/g)为0.69±0.04与假手术组(0.60±0.02)比显著增加(P0.05)。结论尾静脉注射18F-FDG 1μCi/g联合micro-PET-CT成像技术能够监测臂丛撕脱伤后在体的脊髓组织的病理反应所引起的局部神经元和胶质细胞的代谢变化,为该病的基础研究提供工具及临床病程诊断提供了新思路。     

臂丛损伤后脊髓前后角降钙素基因相关肽的表达及其意义

目的：观察大鼠臂丛损伤后脊髓降钙素基因相关肽(CGRP)的表达变化规律。方法：用大鼠建立3种臂丛损伤模型：右C_7前根撕脱(A组);右C_7前根撕脱 同侧C_5～T_1后根离断(B组);有C_7前根撕脱 右C_5与C_6之间脊髓半横断(C组)。术后1、3、7和14d取C_7节段脊髓,采用免疫组织化学方法和图像分析技术,对脊髓前角和后角CGRP的表达进行检测与分析。结果：各损伤组脊髓前角CGRP表达在术后1～7d呈上升趋势,7d达高峰,然后缓慢下降;脊髓后角CGRP表达在术后1～14d呈显著下降趋势。A组CGRP表达量最高,B组最低,C组居中。结论：臂丛损伤后脊髓前角和后角表达及作用呈不一致性。前角CGRP可能参与神经损伤再生的修复机制;后角CGRP可能与伤害性刺激传导有关。     

大鼠臂丛前根撕脱延期再植回对运动神经元存活的作用

目的：建立大鼠臂丛前根撕脱延期再植回模型，研究脊髓前角运动神经元的存活与再生。方法：采用FB逆行示踪法结合NADPH—d组化法与中性红复染，计数阳性神经元．结果：前根撕脱延期3、7、14d再植回组，动物存活3周及6周，脊髓前角运动神经元的存活率分别为79％和75％、58％和51％、57％和50％；NOS阳性神经元的表达率分别为18％和13％、30％和8％、20％和7％。仅做前根撕脱组动物，脊髓前角运动神经元存活率为41％和29％，NOS阳性神经元的表达率为55％和58％。结论：前根撕脱延期再植回能促进脊髓前角运动神经元的存活与再生。     

臂丛损伤后脊髓前角运动神经元超微结构改变

目的探讨大鼠臂丛损伤导致脊髓前角运动神经元死亡的机制。方法成年雄性SD大鼠24只,其中对照组6只,损伤组18只。建立3种臂丛损伤模型:右C7前根撕脱(A组);右C7前根撕脱+同侧C5～T1后根离断(B组);右C7前根撕脱+右C5与C6之间脊髓半横断(C组)。术后14d取C7节段脊髓,采用尼氏染色方法和透射电镜技术,观察脊髓前角运动神经元的存活率及其超微结构改变。结果术后2周A组脊髓前角运动神经元的存活率最高,B组居中,C组最低。3个臂丛损伤组C7前角均可见凋亡特征性改变:运动神经元内核染色质聚集靠边,核固缩、碎裂、核膜皱褶并内陷,并有染色质团块形成的凋亡小体。细胞体积缩小,胞浆内细胞器密集,线粒体轻度肿胀,核周粗面内质网减少,游离核糖体增多,胞浆内可见较多的空泡。神经元胞体周围的有髓神经纤维和无髓神经纤维呈轻度肿胀,髓鞘的板层结构消失。结论臂丛损伤诱导脊髓运动神经元死亡途径中存在凋亡和坏死两种机制,运动神经元可形成凋亡小体。     

银杏叶提取物减轻臂丛根性撕脱后脊髓运动神经元超微结构的损伤

目的：研究银杏叶提取物(EGb761)对臂丛撕脱后运动神经元超微结构的保护作用。方法：显微镜下撕脱大鼠臂丛 C_5～T_(?)神经根,术后实验大鼠腹腔注射100 mg·kg~(-1)·d~(-1)EGb761,透射电镜观察损伤 C_7节段运动神经元的超微结构。结果：神经根撕脱6～8周,运动神经元胞体体积缩小、胞核染色质裂解、浓缩异染色质增多;粗面内质网和游离核糖体减少、线粒体减少、嵴肿胀;神经髓鞘不完整、呈空泡状变性。EGb761治疗后,胞体体积基本正常,偶见浓缩异染色质;粗面内质网减少不显著;游离核糖体数量明显增多;线粒体形态正常;髓鞘完整呈同心圆包绕在轴索周围。结论：EGb761能减轻运动神经元超微结构的损伤,减少臂丛根性撕脱诱导的运动神经元凋亡。     

坐骨神经损伤后相应脊髓节段Nogo-A的表达变化

目的通过切断坐骨神经,观察相应脊髓节段中Nogo-A表达的变化及了解脊髓中Nogo-A在周围神经损伤过程中的作用规律。方法选用健康成年SD大鼠120只,随机分为切断坐骨神经组、切除坐骨神经组和假手术对照组。各组大鼠术后每一组随机分为5组,分别于术后24h、48h、1周、2周、32d处死。经左心室-升主动脉插管灌注固定,然后迅速取出相应节段脊髓进行处理后,光镜观察并对脊髓前角运动神经元行光密度测定。结果光镜下可见,Nogo-A在脊髓前角运动神经元胞浆内有明显表达,而细胞核内未见表达。平均光密度(MOD)测定显示,脊髓灰质前角坐骨神经损伤侧Nogo-A表达阳性的运动神经元MOD较未损伤侧明显增高,于伤后1、2 d即出现增高,1周时达高峰,之后逐渐降低,32d时趋向正常。结论坐骨神经损伤后,脊髓相应节段损伤侧前角运动神经元胞浆内Nogo-A的表达较未损伤侧明显增强,且随时间不同,其增强的幅度有一定的变化规律。     

成年臂丛神经根性撕脱伤后脊髓前角运动神经元的死亡表型及其机制

正人类臂丛神经根性撕脱伤是临床上常见的一种周围神经损伤,但目前这类损伤尚缺乏有效的治疗手段。臂丛神经根性撕脱伤不仅导致损伤远侧段周围神经变性和相应靶器官的失神经支配,更为重要的是还造成了脊神经腹根和背根与脊髓的脱离~[1]。目前的外科手术修复虽然可以将撕脱的脊神经腹根和背根重新植入脊髓,但伤者的运动和感觉功能     

臂丛损伤再生中GAP-43 mRNA及其蛋白的表达

目的：分析臂丛损伤后脊髓前角运动神经元表达GAP-43 mRNA及其蛋白的变化规律，探讨神经损伤再生的机制。方法：建立3种臂丛损伤模型：右C₇前根撕脱（A组）；右C₇前根撕脱＋同侧C5-T₁后根断离（B组）；右C₇前根撕脱+右C₅C₆间脊髓半横断（C组）。用荧光定量RT-PCR方法检测术后14 d时 C₇前角GAP-43 mRNA的表达量。用免疫组化方法检测术后1、 3、 7、14 d脊髓前角GAP-43免疫阳性运动神经元的表达。结果：对照组C₇前角GAP-43 mRNA呈低表达，损伤组GAP-43 mRNA表达显著上调。损伤组术后1 d、3 d时均未见C₇前角 GAP-43免疫阳性神经元，术后7 d各损伤组GAP-43免疫阳性神经元开始出现，14 d时免疫阳性神经元数目达到高峰。3组间比较，C组表达量最高，B组最低，A组居中。结论：臂丛损伤诱导运动神经元GAP-43 mRNA及其蛋白表达上调，GAP-43合成增加是神经元蛋白重组所致，与轴索再生和神经功能重建有关。     

天然抗氧化剂减少神经根撕脱诱导的一氧化氮合酶表达和运动神经元死亡

为了研究抗老年性痴呆 990 1号和 TA990 1+银杏叶标准提取物合剂对臂丛神经根撕脱后前角运动神经元的神经元型一氧化氮合酶 ( n NOS)表达和存活的影响 ,用成年 SD雌性大鼠进行右侧臂丛 C5～ T1 神经根撕脱术后 ,随机分为撕脱组、撕脱 +TA990 1组以及撕脱 +TA990 1和 EGb761合剂组。对此三组每天分别进行腹腔注射 1ml生理盐水、0 .5 % TA990 1、0 .5 %TA990 1和 EGb761合剂。治疗 5 d、1、2、4和 6周后处死动物并进行 NADPH-d染色及中性红复染。定量比较各组 n NOS阳性和存活的运动神经元数量。结果证明 ,神经根撕脱后 5 d受损运动神经元开始表达 n NOS,2周时达高峰 ,随后下降至 6周。受损运动神经元的死亡从 2周开始 ,4～ 6周最明显。抗氧化剂治疗组 n NOS表达规律与对照组相似 ,但是阳性程度和阳性细胞数量均少于对照组 ,存活的运动神经元数量则明显多于对照组。撕脱后 4～ 6周 ,TA990 1治疗组抑制 n NOS表达和提高运动神经元存活的效果均明显优于 TA990 1和 EGb761合剂组。结论 :天然抗氧化剂可有效地减少臂丛神经根撕脱后 n NOS表达 ,提高受损运动神经元的存活。 TA990 1抑制 n NOS表达的作用强于 EGb761。     

臂丛节前损伤晚期脊髓前角的病理变化

目的：探讨臂丛节前损伤晚期，脊髓前角运动神经元及其周围结构的病理变化。方法：行右侧C7神经根撕脱术，分别于损伤后6、8、10周取大鼠脊髓C7节段切片，行nNOS、GFAP免疫组化；NADPH—d酶组化加中性红复染和Nissl染色。结果：损伤侧前角运动神经元nNOS表达持续下降直至消失（6、8、10周分别为：24．35％、20．44％、1．83％）；存活率下降以10周最显著（6、8、10周分别为：43．63％、25．14％、20．43％）；损伤侧胶质反应比正常侧强，损伤侧白质胶质反应比灰质强；损伤后10周前角运动神经元周围GFAP阳性反应面积明显大于正常侧前角（126．17vs67.88）。存活率与nNOS阳性率呈正相关关系γ=0．704，P=0．000。与GFAP反应强度不相关γ=-0．006，P=0．987。结论：臂丛节前损伤所致快速大量的运动神经元死亡开始于损伤后8周，此时nNOS减少甚至消失；并有大量胶质细胞的增生。提示临床治疗臂丛节前损伤须早于损伤后6周。