寡肽药物先导结构的发现与优化

本文综述了(1)以纤维蛋白β链降解产物ARPAK及γ链与GPⅡb/Ⅲa结合的关键序列RGD为基础发展新先导结构,例如对ARPAK优化导致的优秀溶栓寡肽GRPAK和QRPAK以及RGD序列对血栓的靶向性认识导致的杂交肽;(2)针对ARPAK、 GRPAK及QRPAK的药代动力学性质导致的酶稳定性高的环肽以及酶稳定性高且可紫外监测的含咔啉羧酸伪肽先导结构;(3)依据ARPAK在体内的代谢产物发现的超短肽先导结构RPAK和PAK;(4)计算机辅助的构象分析;(5)相关寡肽先导结构的前瞻性研究.     

含RGD序列肽及类似物的合成

二十世纪80年代初,人们已经从细胞外基质(ECM)中分离出大量的糖蛋白。大多数ECM糖蛋白在细胞粘附中起着重要作用,因此称为粘附蛋白。不少粘附蛋白有一个共同的特点,其分子中含有精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰(RGD)三肽序列。1984年,Pierschbacher和Ruolstahti首次确定了RGD序列为人纤维连接蛋白(FN)与其受体的结合位点,并且在另外5种蛋白质中也发现了RGDS序列。Hayman等将含RGD序列的4个寡肽与无RGD序列的5个寡肽进行细胞粘附活性研究,发现     

用Wang树脂固相法合成RGD

1984年,Pierschbacher和Ruolstahti首次确定了RGD序列为人纤维连接蛋白(fibronectin,FN)与其受体的结合位点.Hayman等[1]将含RGD序列的4个寡肽与无RGD序列的5个寡肽进行细胞粘附活性研究,发现含RGD序列的肽有抑制正常大鼠肾、变异的鼠肾、鼠BALB/C373、人骨肉瘤(MG-63)和人纤维素瘤(HT1080)细胞的粘附作用,而无RGD序列的后5个肽则没有抗粘附活性.1987年,Hynes[2]报道,细胞表面存在与细胞粘附有关的ECM糖蛋白受体,并将它们命名为整合蛋白(integrin).整合蛋白介导着许多种类的细胞与细胞及细胞与底物之间的相互作用,参与许多生物学过程,如体内平衡调节、吞噬作用、细胞迁移、细胞信号传递、淋巴细胞的识别、血小板的聚集等.由于许多病理学过程与正常的ECM作用相关,因此,含RGD多肽或化合物有望治疗一些疾病,因而该类肽的类似物成为药物设计的一个新靶点[3].本文以Fmoc保护氨基酸为原料,用Wang树脂固相法合成了RGD.     

以血栓和骨质疏松为靶的伪肽研究进展

细胞黏附可导致一系列重大疾病。在这些重大疾病中,血栓形成和骨质疏松症涉及了最广大的人群。血栓形成和骨质疏松发病中的细胞黏附步骤的共同受体是整合素,共同配基是RGD肽。发展寡肽类抗血栓形成和抗骨质疏松药物是目前的研究热点之一。本文综述了相关的伪肽研究进展。     

RGD序列合成肽抑制喉癌细胞增殖的实验研究

目的 研究含RGD序列合成肽对人喉癌Hep-2细胞株增殖能力的影响,并对其可能机制进行初步探讨.方法 化学合成RGD肽,免疫荧光技术检测RGD肽与Hep-2细胞结合能力;MTF法检测不同浓度RGD肽对喉癌细胞增殖能力的影响;免疫细胞荧光技术检测RGD肽处理前后喉癌细胞整合素αv蛋白表达.结果 RGD肽与喉癌Hep-2细胞有特异性结合作用,经RGD肽处理后的喉癌细胞增殖能力显著降低,整合素αV表达明显降低.结论 作为整合素αv受体拮抗剂,RGD肽对喉癌细胞的增殖能力有明显的抑制作用,为喉肿瘤基因治疗方面提供一个新靶点.     

血浆D-二聚体及3P试验的临床价值探讨

<正>血浆D-二聚体(D-Dimer)是纤溶酶水解交联纤维蛋白形成的特异性降解产物,血管内血栓形成可产生大量的交联纤维蛋白,纤溶酶活性继发性增高,血浆D-二聚体含量增高。因此,检测血浆D-二聚体含量对血栓栓塞形成、溶栓治疗监测、手术后弥漫性血管内凝血(DIC)等疾病诊治有重要意义。3P试验原理:纤维蛋白原在凝血酶的作用下释放出A肽和B肽后转变成纤维蛋白单体(FM),FM能自行聚合成肉眼可见的纤维絮状或胶冻状物质,在硫酸鱼精蛋白的作用下形成肉眼可见的纤维素样物     

自由基清除剂及静脉溶栓治疗急性缺血性脑血管病

目的探讨缺血性脑血管病溶栓治疗方法和时机。方法选取发病6小时内脑梗塞患者，在抗自由基治疗前提下，经静脉溶栓治疗。结果有效率为88.0％，与对照组比较有非常显著性差异(P＜0.001)。结论急性缺血性脑血管病患者，在发病6小时以内，首先应用自由基清除剂，然后行溶栓、抗凝治疗，可以明显改善预后。     

非RGD肽超微超顺磁氧化铁探针制备及对人脐静脉内皮细胞的靶向作用

目的：构建非RGD肽超微超顺磁氧化铁（USPIO）分子探针,探讨其对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的靶向作用。方法: 采用化学交联法将非RGD肽(命名为P1c)偶联于二巯基丁二酸(DMSA)修饰的USPIO,形成具有免疫活性的分子探针。采用细胞计数试剂盒（CCK-8）检测探针对 HUVEC 增殖的影响。USPIO 标记的 P1c 肽作为实验组,USPIO 为对照组,通过固相结合实验、普鲁士蓝染色分析其体外免疫学特性,采用 1.5 T 磁共振仪对探针与高表达整合素 α_vβ₃的 HUVEC进行体外细胞成像。结果: 成功构建 USPIO 标记的 P1c 肽分子探针,其对 HUVEC 增殖无明显影响。固相结合实验及普鲁士蓝染色证实该探针能特异性与整合素 α_vβ₃结合。体外 MRI 显示在同一铁质量浓度时,P1c-USPIO 与 HUVEC 孵育后较 USPIO 组 T2*值明显缩短。结论：化学交联法可成功制备 P1c肽USPIO分子探针,该分子探针具有良好免疫学活性,可特异性结合整合素 αvβ3分子。     

RGD肽通过VEGF介导的STAT3通路抑制喉癌干细胞

目的通过RGD肽与喉癌干细胞共培养,利用相关分子生物学方法观察其对喉癌干细胞的抑制作用。方法从喉癌细胞中分选喉癌干细胞;RGD肽与之共培养,观察RGD肽对喉癌肿瘤干细胞增殖及活性的影响;测定RGD肽作用后人喉癌干细胞中VEGF/VEGFR-2/STAT3的表达水平,并探讨RGD肽抑制喉癌干细胞的机制。结果细胞毒性-增殖实验表明:RGD肽作用后的喉癌干细胞,其增殖能力下降,活性减低;RT-qPCR和Western Blotting实验表明:RGD肽可在mRNA水平和蛋白水平上抑制血管生成信号通路相关蛋白,而且呈现剂量依赖关系(P均0.05)。结论 RGD肽对喉癌干细胞有抑制作用,其作用机制是VEGF及其下游通路的活化水平下降。     

靶向肿瘤血管磁共振对比剂的制备及体外显像研究

目的制备针对肿瘤新生血管的靶向纳米磁共振(MR)对比剂,并用高场强MR检测其体外显像能力。方法通过碳二亚胺法将超小型超顺磁性氧化铁(USPIO)与环精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽连接。普鲁士蓝染色检测环RGD肽-超小型超顺磁性氧化铁复合物(RGD-USPIO)针对整合素αvβ3的特异性及靶向性。原子吸收分光光度计检测人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对RGD-USPIO的摄取量变化。透射电镜检测RGD-USPIO的亚细胞定位。4.7 T MR检测不同时间梯度HUVEC摄取RGD-USPIO及单纯USPIO引起MR T2值的变化。结果 RGD-USPIO可特异性结合αvβ3,具有良好的靶向性,HUVEC摄取的RGD-USPIO主要位于细胞内,并可引起MR T2信号强度明显下降,与USPIO组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 RGD-USPIO可特异性地与高表达整合素αvβ3的HUVEC结合,明显降低高场强MR T2值,是一种具有前景的靶向MR对比剂。     

溶栓酶溶栓作用的实验研究

目的研究溶栓酶(TE)对血栓的溶解作用.方法家兔血栓模型采用动-静脉旁路法并测定血液纤溶和凝血系统相关参数指标.结果 TE(3.75、7.50 MIU/kg)对家兔动-静脉旁路所形成血栓有明显溶栓作用,可明显减轻血栓干、湿重量,并可明显降低血浆纤溶酶原含量,使血浆纤维蛋白降解产物转呈阳性反应.结论 TE有明显的血栓溶解作用.     

葡萄球菌激酶对家兔颈动脉血栓的溶栓作用

目的；研究葡萄球菌激酶的溶栓作用及其特点，方法：家兔颈动脉挂线方法形成颈动脉血栓模型，并于给药前后取血测定优球蛋白溶解时间，纤维蛋白（原）降解产物值，纤维蛋白原含量。结果：葡萄球菌激酶能明显降低家兔颈动脉血栓的湿重。溶栓过程中，优球蛋白溶解时间缩短，纤维蛋白（原）降解产物值增加，而血液中纤维蛋白原含量无明显变化。结论；葡萄球菌激酶具有显著的溶栓作用。     

放射性标记RGD肽行肿瘤αvβ3受体显像研究的进展

恶性肿瘤的持续生长、侵袭转移与肿瘤血管生成密切相关,在这个过程中整合素αvβ3起着重要的作用。αvβ3主要通过和细胞外基质(ECM)中的一些含RGD的三肽序列配体结合发挥作用,文献报道其在新生血管内皮细胞有强烈表达,而在正常细胞表达极少或缺乏,因此,放射性标记RGD肽作为高特异性的标记物对恶性肿瘤进行核医学显像,能够达到早期诊断和治疗目的。本文就近年来国内外RGD肽的标记方法和αvβ3受体显像研究进行了综述。     

瓜氨酸化修饰对纤维蛋白原多肽抗原性的影响

目的 研究瓜氨酸化修饰对人纤维蛋白原(Fg)多肽抗原性的影响,探讨针对瓜氨酸化Fg的自身免疫应答在类风湿关节炎(RA)发病中的分子机制.方法 体外对人Fg进行瓜氨酸化修饰,用修饰后Fg刺激RA患者及对照组外周血单个核细胞,通过~3H掺人法观察细胞增殖情况;通过计算机软件对人Fg α链进行瓜氨酸化修饰前后的抗原性分析,从中筛选出1条多肽,并体外合成原型肽和瓜氨酸替换肽,通过在表达HLA-DRB1细胞系中的直接肽结合试验和抗体竞争肽结合试验,评价瓜氨酸化修饰对Fg多肽与HLA-DRB1亲合力的影响;另外,在体外采用抗原提呈及活化系统,通过检测细胞增殖情况观察瓜氨酸化修饰对Fg多肽激活T细胞作用的影响.结果 瓜氨酸化修饰的Fg和野生型Fg对RA患者外周血单个核细胞的激活作用略高于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05).多肽结合试验和细胞活化试验证实,瓜氨酸替换肽与HLA-DRB1的结合力明显高于原型肽,而且瓜氨酸替换肽对T细胞的活化作用强于原型肽,二者差异有统计学意义(SI为2.26±0.14比1.65±0.53,P<0.01).结论 瓜氨酸化修饰能够增加Fg多肽与HLA-DRB1的结合力,诱导T细胞活化,从而增强Fg多肽的抗原性.     

2-甲氧基雌二醇-RGD肽缀合物的合成及其抗血管生成作用

以2-甲氧基雌二醇为先导物,将其3位和17位通过连接基团与RGD肽偶联,合成了一系列2-甲氧基雌二醇-RGD肽缀合物,其中13个化合物未见文献报道,结构经IR,MS及¹H NMR确证,并采用细胞迁移划痕试验初步测定了6个目标缀合物的抗血管生成活性。结果显示,化合物26c表现出较强的活性,强于先导物2-甲氧基雌二醇,从而证明了其潜在的抗血管生成作用。     

急性大面积肺血栓栓塞患者应用延迟溶栓治疗临床疗效和安全性分析

目的探索延迟溶栓治疗在急性大面积肺血栓栓塞(pulmonary thromboembolism,AMPTE)患者中的疗效和安全性。方法以本院2013年3月至2015年11月收治的进行溶栓治疗的AMPTE患者为研究对象,其中病程超过14 d的患者(A组)32例,病程在14 d以内的患者(B组)38例,回顾性分析其临床资料,记录两组患者的一般情况、病程、病因、D二聚体(D-D)、纤维蛋白降解产物(FDP)、超声心动图肺动脉收缩压(SPAP)等资料,比较两组患者治疗7 d后的B型钠尿肽(BNP)、SPAP、动脉血氧分压(Pa O_2)、动脉血二氧化碳分压(Pa CO_2)、CT肺动脉阻塞指数(CTI)、肌钙蛋白I(TNI)等指标,并比较两组患者的临床疗效和出血率等并发症。结果 A组有效率为75%,B组有效率为76%,组间无显著差异;两组患者治疗后与治疗前相比,BNP、SPAP、Pa O_2、Pa CO_2、CTI、TNI等指标均改善,P0.05,A组患者治疗后与B组患者治疗后的实验室指标无显著差异,P0.05;A组患者不同时间段治愈率和有效率无显著统计学差异;A组患者发生出血者9例,无死亡病例,B组患者8例发生出血,死亡1例,组间比较无显著统计学差异,P0.05。结论AMPTE患者中,延迟溶栓治疗在病程超过14 d、有症状加重和D-D增高的患者中仍有疗效,安全可靠,对符合条件的患者应积极溶栓治疗。     

急性缺血性脑卒中血小板参数及止凝血标志物的水平及临床意义

目的:分析检测急性缺血性脑卒中患者在急性发作期和溶栓治疗有效后的血小板相关参数(PLT和MPV)及止凝血标志物(FIB、FDP、D-D dimmer)的变化及临床意义,并评估吸烟、糖尿病、高血压、高血脂等风险因素与急性缺血性脑卒中发病的相关性。方法:收集309例急性缺血性脑卒中患者(观察组)发病24 h内的血液样本和303例健康体检者(对照组)的血液样本,检测两组血小板参数(PLT和MPV)及止凝血标志物纤维蛋白原(FIB)、纤维蛋白降解产物(FDP)、D-D二聚体在急性发作期及溶栓治疗有效后的水平,对两组间及观察组治疗前后的数据结果进行对比,分析观察组内吸烟、糖尿病、高血压、高血脂等风险因素与急性缺血性脑卒中发病的相关性。结果:与对照组相比急性缺血性脑卒中患者血液中PLT降低,MPV增大,D-D二聚体、FIB、FDP水平较高,两组间的差异有统计学意义(P<0.05),观察组急性发作期和溶栓治疗有效后其水平也有显著性差异,糖尿病、高血压、高血脂、吸烟等风险因素与急性缺血性脑卒中的发病有相关性。结论:血小板参数PLT、MPV和止凝血标志物D-D二聚体、FIB、FDP联合检测可为院前...     

The role of osteoactivin-derived peptides in osteoblast differentiation.

BACKGROUND: In our previous studies, we found that osteoactivin (OA) plays an important role in the regulation of osteoblast differentiation in vitro. Our studies also suggested that the region of OA protein that contains an RGD motif might play a vital role in the function of OA in osteoblast differentiation. In this study, we examined the functional role of OA-derived peptide containing the RGD motif (OA-D) in osteoblast differentiation. MATERIAL/METHODS: For this purpose, we designed another peptide, termed OA-E, that has sequence similar to OA-D but with glutamic acid (E) instead of aspartic acid (D). The effect of OA-E peptide on osteoblast differentiation was examined. Interestingly, OA-E peptide induced osteoblast differentiation in a manner similar to OA-D peptide. These data suggested that the effect of OA-derived peptides is RGD independent and it could be dependent on other features in the amino acid sequence of these peptides. RESULTS: OA-D peptide treatment markedly induced osteoblast differentiation markers in vitro compared to cultures treated with negative control peptide (NCP). Interestingly, OA-E peptide induced osteoblast differentiation in a manner similar to OA-D peptide. These data suggested that the effect of OA-derived peptides is RGD independent and it could be dependent on other features in the amino acid sequence of these peptides. Since phosphorylation of amino acid residues in proteins and peptides plays a major role in biological systems, the phosphorylation pattern of amino acid sequences of OA-derived peptides and OA protein family members were examined using bioinformatic analysis tools. We found that OA-derived peptides and OA protein family members have serine residue, close to c-terminus and might be phosphorylated with casein kinase II. Casein kinase II is known to phosphorylate many osteoblast-related proteins that regulate osteoblast development and differentiation such as osteopontin and vitronectin. CONCLUSIONS: Collectively, these data showed that both OA-D and OA-E peptides significantly induced osteoblast differentiation in vitro and that effect is RGD independent.     

抗人交联纤维蛋白碎片D—二聚体McAb的制备及其鉴定

以纯化的纤维蛋白碎片D-二聚体为抗原,得到4株分泌抗D-二聚体McAb的杂交瘤细胞,分别命名为HID1、HID2、HID3和HID4,其中HID1、HID2及HID3能识别同一或相邻抗原决定簇,与纤维蛋白原及其碎片X、Y、D、E和血浆等无交叉反应;HID4则识别另一抗原决定簇,且与纤维蛋白原碎片X、Y、D等有交叉反应。本组McAb的成功制备,将为临床血栓性疾病的诊断和治疗监测提供新手段。