无细胞接触条件下成人骨髓间充质干细胞培养上清对异体淋巴细胞增殖的负调控作用

背景:成人骨髓间充质干细胞对异体淋巴细胞增殖具有负调控作用的理论已公认,但证实其具体机制的资料有限。目的:在无细胞接触的条件下,观察成人骨髓间充质干细胞培养上清对异体淋巴细胞增殖的负调控效果。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-10/2007-12在解放军兰州军区兰州总医院完成。材料:骨髓标本来源于行异基因造血干细胞移植的健康供者,外周血来源于健康志愿者。方法:无菌条件下采集成人骨髓,Percoll 贴壁法体外分离培养骨髓间充质干细胞。取新鲜肝素抗凝的外周血,Ficoll法分离出淋巴单个核细胞,调整浓度为2×109L-1,分别取100μL淋巴细胞悬液,置入96孔板中,设立4组:培养上清组加入培养3d的骨髓间充质干细胞培养上清,100μL/孔;培养上清 植物血凝素组在前组基础上加入1g/L植物血凝素5μL;空白对照组加入含体积分数0.1胎牛血清的LG-DMEM培养液100μL;植物血凝素组在空白对照组基础上加入1g/L植物血凝素5μL。置37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度孵箱中培养3d。主要观察指标:骨髓间充质干细胞培养上清对异体淋巴细胞增殖转化的影响。结果:与空白对照组和植物血凝素组比较,加入骨髓间充质干细胞培养上清后淋巴细胞增殖活性明显下降(P<0.05),其增殖转化抑制率为9.00%。与培养上清组比较,在有植物血凝素刺激的情况下,淋巴细胞增殖活性进一步下降(P<0.01),其增殖转化抑制率达20.91%。结论:成人骨髓间充质干细胞培养上清能够抑制异体淋巴细胞增殖转化,且在外源性刺激源植物血凝素存在的情况下,其抑制效果明显增强,提示其负调控作用至少是部分通过分泌可溶性细胞因子而间接对淋巴细胞产生抑制的。     

人脐带沃顿胶间充质干细胞对人外周血T淋巴细胞的免疫调节作用

背景:骨髓源性间充质干细胞具有低免疫原性和免疫调节作用,但有关人脐带沃顿胶间充质干细胞的免疫调节作用及其机制研究较少.目的:观察脐带沃顿胶间充质干细胞对异体外周血T淋巴细胞的免疫调节作用及机制.方法:从人脐带沃顿胶组织块培养中分离出间充质干细胞.将脐带沃顿胶间充质干细胞及脐带沃顿胶间充质干细胞培养上清分别与植物凝集素刺激下的人外周血T淋巴细胞共培养,多功能酶标仪测量脐带沃顿胶间充质干细胞及脐带沃顿胶间充质干细胞培养上清与植物凝集素刺激下的人外周血T淋巴细胞共培养72 h后A值:ELISA试剂盒检测培养上清中转化生长因子β1、γ-干扰素的表达.结果与结论:沃顿胶间充质干细胞对植物凝集素刺激下的T淋巴细胞增殖有抑制作用,增殖抑制率为56%(P＜0.01),沃顿胶间充质干细胞培养上清对植物凝集素刺激下的T淋巴细胞增殖也具有抑制作用,且这种抑制呈剂量依赖性.含50%沃顿胶间充质干细胞培养上清组和100%培养上清组的增殖抑制率分别为8.3%、27%(P＜0.05);沃顿胶间充质干细胞能显著降低T淋巴细胞分泌的γ-干扰素(P＜0.05):可分泌转化生长因子β1,沃顿胶间充质干细胞与T淋巴细胞共培养组的转化生长因子β1分泌量低于沃顿胶间充质干细胞单独培养组(P＜0.05).提示沃顿胶间充质干细胞及沃顿胶间充质干细胞培养上清对植物凝集素刺激下的丁淋巴细胞增殖均有抑制作用,其作用机制可能与细胞间的接触及抑制T淋巴细胞分泌的γ-干扰素有关.     

不同刺激剂对人外周血淋巴细胞亚群增殖的影响

目的:采用流式细胞术分析PHA、PMA、IL-2对PBMC和全血不同培养体系中人外周血淋巴细胞亚群增殖的影响,为不同的实验目的选取合适的培养体系提供实验基础。方法:收集健康受试者(n=6)静脉血肝素钠抗凝样本(10 ml/样本),每个样本取300μl全血并直接裂解红细胞经荧光染色后流式细胞术检测淋巴细胞亚群。在400μl全血接种淋巴细胞自体血浆培养液中,分别加入3种不同刺激剂,37℃、5%CO2培养箱中培养60 h;2 ml全血分离PBMC,淋巴细胞培养液中分别加入3种不同刺激剂,于37℃、5%CO2培养箱中培养60 h。培养物经荧光染色后流式细胞术分析淋巴细胞亚群变化。结果:分离的PBMC经PHA刺激后淋巴细胞主要表达CD4-CD8-CD3+淋巴母细胞;PMA刺激后CD3+CD4+T淋巴细胞和CD3-CD19+B淋巴细胞比例下降(P 0.01, P0.05);IL-2刺激后淋巴细胞亚群比例增殖前后无明显变化。全血自体血浆经PHA刺激后转化为CD4+CD3+T淋巴母细胞和CD8+CD3+T淋巴母细胞,B淋巴细胞和NK细胞未见表达;PMA刺激后转化为CD8+CD3+T淋巴母细胞和CD4-CD8-T淋巴细胞,B/NK细胞用表面标志物无法区分;IL-2刺激后NK细胞比例明显增加(P0.05)。结论:PMA刺激增殖作用最快,IL-2对淋巴细胞亚群增殖前后比例影响最小,PHA刺激淋巴细胞分裂代数更多。     

骨髓间充质干细胞对慢性特发性血小板减少性紫癜患者T细胞T-bet和GATA-3表达的影响

目的探讨正常人骨髓间充质干细胞体外对慢性免疫性血小板减少症患者T细胞T-bet、GATA-3以及下游细胞因子IFN-Y和IL-4表达的影响。方法采用Ficoll分离和直接贴壁、传代培养扩增骨髓间充质干细胞,用Ficoll法和尼龙棉柱法获取慢性免疫性血小板减少症患者外周血的T淋巴细胞;以5×104个/孔的MSCs作为基底层细胞,经植物血凝素(PHA)刺激后,与正常人骨髓间充质细胞共培养4天,收集T淋巴细胞和培养上清,采用RTPCR法检测T细胞中T-bet和GATA mRNA的表达水平,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养上清干扰素-Y(IFN-Y)和白细胞介素-4(IL-4)的浓度;对照组采用地塞米松治疗(5×10-5 mol/L)。结果实验中未检测到骨髓间充质干细胞本身分泌IFN-Y和IL-4;与T细胞+PHA组相比,骨髓间充质干细胞与T淋巴细胞共培养组在接受PHA刺激后,IFN-Y的表达明显降低(P0.05),IL-4表达升高(P0.05);同时显著降低T-bet(P0.05)和升高GATA-3(P0.05)的表达,这与地塞米松治疗组结果相似(P0.05)。结论间充质干细胞可能通过调节T细胞Tbet和GATA-3的表达对ITP患者发挥治疗作用。     

亚甲蓝光化学作用抑制淋巴细胞增殖及其细胞因子分泌活性的研究

目的探讨亚甲蓝光化学法对淋巴细胞的增殖活性及细胞因子分泌活性的抑制作用,分析该方法对淋巴细胞的灭活作用。方法实验分为实验组(n=3):从全血中分离淋巴细胞,将其悬浮于亚甲蓝终浓度为3μmol/L的PBS缓冲液中,注入PVC小袋内(660 nm处透光率为64%),于35 000 lux光照度的荧光下照射50 min;光照组(n=3):相同来源的淋巴细胞重悬于不含亚甲蓝的PBS缓冲液中,将其注入PVC小袋内并于35 000 lux光照度的荧光下照射50 min;对照组(n=3):为相同来源、重悬于不含亚甲蓝的PBS缓冲液中且不接受光照处理的淋巴细胞。以植物血凝素(PHA)同时刺激3组细胞,用CCK-8细胞增殖检测试剂盒检测淋巴细胞增殖活性,计算亚甲蓝光化学处理对淋巴细胞的增殖抑制率;细胞因子分泌活性采用酶联免疫试剂盒检测;显微镜观察细胞形态及增殖集落。结果与对照组比较,实验组(亚甲蓝光化学处理)培养3、4、5 d后对PHA刺激的增殖抑制率分别为89.31%,100%及94.39%,其TNF-α、IFN-γ、IL-10的分泌量均较对照及光照组有极明显的降低(P<0.05);IL-4的分泌量较光照组显著降低(P<0.01);镜下照片显示,实验组经PHA刺激后仅有少量细胞集丛,与对照组及光照组增殖集落相比增殖抑制效应明显。结论亚甲蓝光化学法可有效抑制淋巴细胞的增殖活性及细胞因子分泌活性,提示该方法预防输血相关的移植物抗宿主病(TA-GvHD)的有效性与可行性。     

地塞米松对小鼠骨髓源树突状细胞表型及功能的影响

目的:研究地塞米松(dexamethasone)对小鼠骨髓源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDC)表型及功能的影响。方法:用GM-CSF及IL-4定向诱导C57BL/6小鼠骨髓细胞分化DC,分化过程中随机分为4组,A组,对照组;B、C、D组分别为100μg/L地塞米松组,100μg/LLPS组,100μg/L地塞米松+100μg/LLPS组。每组细胞培养8d。用流式细胞术测定BMDC表面CD80,CD86,Galectin-9及PD-L1的表达,ELISA方法检测其培养上清IL-12的浓度,用混合淋巴细胞培养法检测其对同种异体T细胞的刺激能力。结果:与对照组比较,LPS刺激后,DC表面CD80,CD86,Galectin-9及PD-L1表达明显增加,培养上清中IL-12浓度升高,其刺激同种异体T细胞的能力增强。与对照组和LPS组比较,地塞米松可使DC表面CD80,CD86,Galectin-9及PD-L1表达明显降低,IL-12分泌减少,刺激同种异体T细胞的能力减弱。结论:地塞米松降低了BMDC细胞表型表达,抑制其细胞因子IL-12的分泌,降低其刺激同种异体反应T细胞增殖的能力。     

人脐血间充质干细胞培养及对异体外周血T淋巴细胞增殖的影响

目的:研究发现间充质干细胞具有独特的免疫调节特性,体外能够抑制混合淋巴细胞培养或有丝分裂原刺激中的T淋巴细胞增殖.实验观察体外分离培养的脐血间充质干细胞对异体外周血T淋巴细胞增殖的抑制效果.方法:实验于2004-10/2006-06在解放军兰州军区兰州总医院完成.①对象:足月正常分娩产妇脐血及健康志愿者外周血分别由解放军兰州军区兰州总医院妇产科、血液科提供,产妇与志愿者对实验均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:Percoll法分离脐血单个核细胞,贴壁纯化,达80%～90%融合时胰蛋白酶消化,按2.0×108L-1密度传代,取第4-5代细胞用于实验.密度梯度法分离外周血单个核细胞,以含体积分数为0.2胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞浓度至1×109 L-1时加入尼龙棉柱内,用培养基冲出非黏附细胞即为T淋巴细胞.脐血间充质干细胞分为2×108,1×108,0.5×108 L-1组,各100 μL接种于96孔培养板,加入2×108 L-1 T淋巴细胞悬液100 μL,再给予植物血凝素刺激T淋巴细胞转化.以T淋巴细胞 植物血凝素为阳性对照.③实验评估:观察体外培养的脐血间充质干细胞形态,应用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达.MTT法测定脐血间充质干细胞对异体外周血T淋巴细胞增殖的影响.结果:①形态特征与表面抗原表达:原代培养10～18 d形成平行排列、辐射状或旋涡状的成纤维样细胞,即为脐血源性的间充质干细胞,传代7 d左右细胞达90%融合.流式细胞仪检测90%细胞稳定表达间充质干细胞相关抗原CD13,CD29,CD44,CD166,不表达造血细胞系的表面抗原CD34,CD45.②脐血间充质干细胞对异体T淋巴细胞增殖的抑制:与阳性对照比较,经脐血间充质干细胞共培养后植物血凝素刺激T淋巴细胞的增殖作用受到抑制,增殖指数明显降低(P＜0.01).间充质干细胞与T淋巴细胞比值为1:1,1:2和1:4时的增殖抑制率分别为(48.16±2.31)%,(34.47±3.09)%,(22.15±2.63)%.结论:脐血间充质干细胞可显著抑制异体外周血T淋巴细胞的增殖,该抑制作用呈剂量依赖性.     

胰岛素样生长因子-I对人骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的:建立人胚骨髓间充质干细胞(MSCs)分离及培养的方法,探讨胰岛素样生长因子-I(IGF-I)对MSCs增殖的影响。方法:通过密度梯度离心,贴壁法分离培养人胚MSCs,取第4代MSCs,应用流式细胞术测定细胞周期和CD44、CD34、CD45表达。采用MTT法观察不同含量和不同作用时间的IGF-I对MSCs增殖的影响。结果:体外培养的MSCs呈现成纤维细胞形态,流式细胞仪检测结果显示,MSCs阳性表达CD44,阴性表达CD34,CD45。细胞周期分析显示IGF-I使S+G2+M期细胞数增加,占细胞总数(29.9±2.3)%(t=10.4,P<0.01)。1μg/LIGF-I促MSCs增殖作用不明显,10μg/LIGF-I即可促MSCs增殖,IGF-I含量为100μg/L时,其促增殖作用达最大值,吸光度为2.95。而当IGF-I含量大于100μg/L时,促细胞增殖作用反而下降;时效关系显示,IGF-I第1天发挥促增殖作用,第5天促增殖作用达高峰,维持时间可达7d。结论:外源性IGF-I能促进MSCs增殖,为实现MSCs体外快速扩增提供适宜的条件。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养纯化及冻存

目的:建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离培养及冻存的方法。方法:用密度梯度离心法及贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSCs,并对其形态学特征进行观察,比较两种分离培养法的细胞生长增殖情况。大鼠MSCs在12.5%二甲亚砜(DMSO)保护下放入液氮冻存,6个月后复苏,测其成活率及观察生长增殖情况。结果:用密度梯度离心法及贴壁培养法均能有效地分离大鼠骨髓MSCs,细胞活力好,增殖能力强。大鼠MSCs可用液氮保存,且复苏后细胞生长增殖旺盛,形态无明显的变化。结论:采用密度梯度离心法及贴壁培养法成功地建立了大鼠骨髓MSCs体外分离和培养体系;采用液氮冻存大鼠MSCs的方法十分有效可行。     

骨髓间充质干细胞抑制再生障碍性贫血患者外周血T细胞增殖的实验研究

背景:既往研究发现骨髓间充质干细胞具有免疫抑制作用,而再生障碍性贫血患者存在T淋巴细胞异常活化及增殖。目的:体外分析骨髓间充质干细胞对再生障碍性贫血患者外周血T淋巴细胞增殖的抑制作用。方法:分离再生障碍性贫血患者外周血T淋巴细胞,行羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFDASE)荧光染色,与体外培养扩增的骨髓间充质干细胞按3︰1比例直接接触法及Transwell法共培养,加入植物血凝素(PHA)刺激T淋巴细胞增殖,并设阴性及阳性对照。流式细胞术检测各组T细胞增殖情况,评价骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞增殖的影响。结果与结论:CFDASE染色分析显示,直接接触组T细胞增殖较阳性对照组明显减低(P<0.01);Transwell组T细胞增殖亦较阳性对照组减低(P<0.05);直接接触组T细胞增殖较Transwell组明显减低(P<0.01)。骨髓间充质干细胞可能通过直接接触及分泌某些细胞因子方式抑制再生障碍性贫血患者异常增殖的T细胞,以直接接触方式发挥主要作用。     

移植途径对骨髓间质干细胞梗死心肌移植疗效的影响

目的 探讨自体骨髓间质干细胞(MSCs)不同移植途径对梗死心肌心肌收缩力、血管新生及胶原更新的影响.方法 贵州香猪32只,随机分为对照组(C组)、冠状动脉移植组(A组)、局部注射组(T组)、局部注射+动脉移植组(A+T组).抽取骨髓3 ml,按照Wakitani方法 培养出MSCs,经5-氮胞苷诱导后,5-溴脱氧尿苷(BrdU)标记备用.开胸结扎左冠状动脉前降支后,自体MSCs分别经结扎前降支远端灌注、局部注射、局部注射+动脉灌注移植入自体急性心肌梗死区域,对照组以同样方法 注射不合细胞的等量培养液(DMEM).术后3、6周取标本,免疫组化检测组织血管新生、体外药物刺激离体肌条检测心肌收缩情况和血浆Ⅲ型胶原N端肽(PⅢNP)活性.结果 MSCs移植后3周A、T、A+T组心肌收缩恢复[(48.6±5.9)%,(42.1±6.2)%,(56.9±5.1)%]、血管新生(19.6±4.3,17.1±4.0,23.2±5.5)、血浆PⅢ NP活性[(4.6±0.5)μg/L,(5.9±0.7)μg/L,(3.9±0.3)μg/L]较C组[(37.9±5.4)%,13.2±3.8,(8.7±0.8)μg/L]明显改善(P均<0.01),且随时间推移恢复程度增加,以A+T组为最显著(P均<0.05).结论 局部注射+冠状动脉灌注是较为理想的MSCs移植方式.     

红细胞生成素对骨髓源间充质干细胞迁移的影响

目的 利用Transwell体外迁移体系初步探索EPO在骨髓源间充质干细胞(MSC)迁移中的作用及其信号传递机制.方法 采用经典的全骨髓细胞贴壁法培养MSC,通过成骨、成脂肪等多向诱导分化以及流式细胞术分析其表面标志(CD133、CD34、CD90、CD105)等鉴定MSC特征;以第3代MSC为实验材料,利用Transwell体外迁移体系,先观察不同浓度的rhEPO对MSC迁移的影响,随后在50 nmol/L Wortmannin、50μmol/L PD98059、10μmoL/L U73122、4μg/ml抗EPO-R IsG、30 μmol/LSB203580、10 mmol/L Straurosporine、6 nmol/L G0697、50 μmol/L Pseudo Z等不同的信号转导途径阻断剂的干预下观察EPO对迁移的影响.结果 培养的MSC呈现出CD90、CD105强阳性,具有成骨、成脂肪等多向分化能力;MSC体外迁移能力随着rhEPO浓度(1、10、100、1000 IU/ml)的递增而逐渐增强,并且rhEPO浓度在100 U/ml时,MSC迁移到滤膜上的细胞数接近于峰值;Wortmannin、PD98059、抗EPO-R IgG、Straurosporine、G06976、Pseudo Z对MSC迁移均有影响,其中U73122、抗EPO-R IgG、Straurosporine、Pseudo Z对MSC迁移阻断的效应最显著.结论 EPO-EPO-R所介导的MSC迁移与丝裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C和蛋白激酶C-ζ(PKC-ζ)等信号传递途径有关,且PKC-ζ途径可能处于中心环节.     

骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的研究5-氮胞苷（5-Aza）对培养人骨髓间充质干细胞（MSCs）的作用,并对分化后的心肌样细胞进行鉴定。方法采用密度梯度离心法分离到骨髓单个核细胞（MB-MNC）,用含200ml／L胎牛血清的低糖型DMEM培养液进行培养。采用差速贴壁法纯化MSCs,用流式细胞仪检测细胞表面抗原。以5-Aza诱导第3代MSCs 24h后,继续培养。于培养的第4周,采用免疫细胞化学方法检测肌系特异性标记抗原结合蛋白（nesmin）,RT-PCR检测心肌早期转录因子GATA-4和心肌特异性蛋白肌钙蛋白T（cTnT）。结果MSCs经5-Aza诱导分化后表达Desmin、GATA-4和cTnT,未经诱导的同培养天数的MSCs中均呈未见表达。结论MSCs经5-Aza诱导后可以表现心肌样细胞特征。     

人血小板裂解液对骨髓间质干细胞成骨成脂分化的影响

目的探讨人血小板裂解液(HPL)体外培养人骨髓间质干细胞(MSCs)及其对MSCs成骨和成脂分化能力的影响。方法采用贴壁法分离培养3株人骨髓来源MSCs,每株细胞在培养时平行分为2个实验组,分别用含10%胎牛血清的低糖培养基和含7.5%HPL的低糖培养基培养,均培养MSCs至第5代,分别用成骨及成脂诱导液对每组MSCs做成骨、成脂分化诱导,诱导成功后分别用茜素红、油红O对成骨和成脂分化结果染色鉴定,并进一步对成骨、成脂诱导结果做定量分析:成骨分化染色后洗脱茜素红在562nm波长下测定OD值并对每个培养孔细胞做蛋白定量,以茜素红OD值与蛋白定量值的比值作为成骨分化的定量值;成脂分化染色后用异丙醇洗脱油红O,在510nm波长下测定OD值,以之作为成脂分化的定量值。对所得的结果做统计学分析。结果对第5代的MSCs做成骨诱导12d后,光镜下可见致密结节形成,茜素红染色及定量鉴定结果显示2种培养液培养的MSCs均能成功向成骨细胞分化,而7.5%HPL培养的MSCs成骨能力比10%FBS培养的MSCs强,定量鉴定结果分别为16.548±4.397、4.151±5.631(P<0.05)。成脂诱导12d后,细胞内有明显脂滴形成,油红O染色及定量分析结果显示MSCs成功向脂肪细胞分化,但7.5%HPL培养的MSCs成脂能力与10%FBS培养的MSCs相比较弱,定量鉴定结果分别为0.239±0.030、0.497±0.105(P<0.05)。结论 HPL可以促进MSCs成骨分化,抑制其成脂分化。     

The posibility study of human mesenchymal stem cells harvested and cultivated in vitro as seeds cells for reconstruction of throat and trachea cartilage tissue engineering

Recentlysomedatashowedthathumanmarrowtissuenotonlycontainshematopoieticstemcells,butalsocontainsabundantmes－enchymalstemcells（MSCs）．MSCshavetheabilitytodifferintoothercells．Theycanbecultured,proliferated,inducedandtransformedintoboneorcartilagetissue,sothiscanbeusedtorepairdamageofboneorcartilagetissue犤１－３犦．Butcomparedwithhematopaieticstemcellstherearen＇tabundantMSCsinbonemarrow．InthisexperimentMSCswereseparatedfrombonemarrowandpurified,andtheirproliferationandgrowthchar…     

Use of bone marrow derived stem cells in a fracture non-union

This is an attempt of using in vitro cultured mesenchymal stem cells (MSCs) from bone marrow in joining of a fracture non-union. Bone marrow cells were obtained and differentially centrifuged for MSCs that were grown in vitro in mesenchymal stem cell basal medium aseptically, for 10 d. The cell mass was injected around the fracture non-union. Healthy conditions of development of tissue regeneration at the trauma site and due bone joining were recorded. It is concluded that in vitro cultured MSCs had a blithesome effect on the fracture non-union.     

大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞定向诱导分化及免疫组化鉴定

目的建立体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法,体外诱导其向神经元样细胞方向分化。方法应用细胞培养技术从大鼠股骨、胫骨中分离、纯化骨髓间充质干细胞并在体外进行培养,以形态学方法鉴定间充质干细胞,在倒置显微镜下观察细胞的形态特征,利用含10 ng/ml bFGF的LG-DMEM及含200μmol/L BHA、2%DMSO的无血清DMEM诱导其向神经元样细胞分化,并通过免疫组化方法鉴定。结果经原代及传代培养的骨髓间充质干细胞呈梭形,类似于成纤维细胞;成神经元诱导24 h后,多数MSCs变为典型的神经元样细胞,胞体向胞核收缩并有较多的长突起,免疫组化显示神经元特异性标志NSE、神经巢蛋白Nestin染色阳性。结论体外成功的进行了MSCs原代及传代培养,细胞生长稳定、增殖迅速并可多次传代,经诱导后具有向神经元样细胞分化潜能。     

SD大鼠间充质干细胞的分离培养及生物学特性研究

目的对SD大鼠不同组织的间充质干细胞（MSCs）进行分离培养并检测其生物学特性。方法分离SD大鼠骨髓、骨密质来源的MSCs，进行细胞表面抗原和细胞生长周期的鉴定。结果两种组织来源的细胞都呈成纤维细胞样，单个核，增殖能力强。细胞免疫组织化学结果显示，培养的细胞表达波形蛋白（vimention）、纤维连接蛋白（fibronectin）但不表达角蛋白（keratin）。细胞可传代10代以上并保持细胞表型。细胞周期显示90％以上细胞处于细胞静止期。结论分离、培养的两种组织的细胞均为MSCs，在体外培养条件下增殖能力强、表型稳定，可作为组织工程的种子细胞。     

骨髓间充质干细胞移植治疗肺动脉高压大鼠肺血管病变的研究

目的探讨骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植对野百合碱诱导的实验性肺动脉高压大鼠肺血管病变的干预作用。方法体外分离、培养并纯化SD大鼠骨髓MSCs。健康雄性SD大鼠随机分为3组,肺动脉高压组(n=20)、MSCs移植组(n=20):2组大鼠均一次性向背部皮下注射野百合碱50 mg/kg,诱导肺动脉高压动物模型;正常对照组(n=15):注射同体积的生理盐水。同等条件饲养3周后,MSCs移植组大鼠经舌下静脉注射5×106/ml的经Hoechst33342荧光染料标记的MSCs细胞悬液1 ml,肺动脉高压组和正常对照组大鼠注射等量L-DMEM液。移植后观察4周,测定3组大鼠生存率、肺动脉平均压、肺小动脉的微观结构的改变。结果肺动脉高压大鼠移植MSCs 4周后,生存率由30%上升到90%,肺动脉平均压由(42.7±2.3)mmHg下降到(24.7±2.3)mmHg,下降了50%;右心指数由(45.30±3.13)%下降到(37.90±3.18)%(q=29.86,P<0.01),肺小动脉病变得到有效改善。荧光显微镜观察到Hoechst 33342标记的MSCs在肺内定植且分化成大量新生血管并形成侧枝循环,肺动脉重构得到有效逆转。结论MSCs移植可有效减轻并逆转肺动脉重构的进程,其作用机制是MSCs分化形成新生血管,建立了侧枝循环,从而修复野百合碱诱导的肺血管损伤。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞定向分化的研究

目的 探讨心肌细胞对骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌细胞定向诱导分化的作用及其生物学特性.方法 取大鼠四肢骨髓,用细胞分离液通过密度梯度离心分离MSCs,并将MSCs进行原代培养和传代培养,将传2代MSCs用5-溴脱氧尿核苷(BrdU)进行标记.采用胰蛋白酶消化法取乳鼠心尖部心肌细胞进行培养,并与标记的MSCs混合培养,光镜下观察其动态变化,并于第3日行免疫组化染色,第5日行电镜观察.结果 原代和传代的MSCs增殖迅速,其阳性率达(90.34±2.31)%,与平行对照组[(4.07±1.35)%]比较差异有统计学意义(P<0.01).与心肌细胞混合后,光镜下观察MSCs形态出现明显的变化,第3日BrdU标记阳性的MSCs胞质中肌动蛋白(actin)表达阳性.电镜下观察原始细胞内出现了不规则的肌小节样结构.结论 心肌细胞与MSCs的接触可有效诱导MSCs向心肌细胞定向分化.