荧光定量聚合酶链反应检测HCV-RNA

丙型肝炎病毒 (HCV)是引起输血后肝炎的主要致病因子 ,在血中含量极微 ,免疫学标志仅有抗 HCV一项 ,而且抗 HCV出现较晚或不出现 ,所以单凭血清学诊断是不够的。为此 ,采用荧光定量聚合酶链反应 (FQ PCR)检测血清中HCV RNA ,是确诊HCV感染的有效方法之一 ,可为制订治疗方案及疗效观察提供确切依据。1　材料与方法1 1　材料1.1.1　标本 :88份血清标本来源于哈尔滨医科大学第一临床医学院临床确诊的丙型肝炎患者。1.1.2　试剂 :①丙型肝炎 (HCV)核酸扩增 (PCR)荧光检测试剂盒 ,包括 :引物序列、荧光探针序列、RNA提取液、逆转录…     

荧光定量PCR用于献血者筛查的意义

目的:探讨高灵敏度荧光定量PCR用于筛查献血者HBV的意义。方法:对400例HBsAgELISA法阴性的献血者标本用荧光定量PCR测定HBV-DNA进行对比。结果:400例标本中有5例HBV-DNA阳性,占1.25%。结论:荧光定量PCR用于献血者的HBV筛查,与ELISA法相比可有效地减少漏检,显著提高血液质量,降低经输血传播HBV的可能性。     

HCV-RNA实时荧光定量的临床价值

目的评价实时荧光定量聚合酶链反应(RFQ-RT-PCR)检测丙型肝炎病毒(HCV-RNA)在临床中的应用价值。方法用RFQ-RT-PCR检测325例肝炎病人标本,并同时采用ELISA检测抗-HCV,了解样本中HCV-RNA含量与抗-HCV的相关性。结果325份标本中有15例HCV-RNA含量高于1000拷贝/ml,18例抗-HCV阳性。经统计分析,两者有明显的相关性。结论RFQ-RT-PCR技术检测HCV-RNA特异性强,灵敏度高,具有良好的应用价值。     

血性标本对实时荧光定量PCR检测的影响

目的探讨血性标本在PCR-DNA-Tb检测中影响。方法用23例非血性标本和37例血性标本同时直接法和预处理法进行实时荧光定量PCR-DNA-Tb检测。结果23例非血性标本两法检测结果差异无显著性(P>0.05),37例血性标本预处理法与直接法检测结果差异显著(P<0.01)。结论血性标本预处理后进行PCR-DNA-Tb检测可提高检出阳性率,减少假阴性。     

利用荧光定量PCR技术对人肠道乳酸杆菌进行定量检测

目的应用荧光定量PCR技术对人粪便内乳酸杆菌进行定量检测,建立乳酸杆菌的荧光定量PCR检测体系。方法依据人肠道乳酸杆菌16S rDNA序列设计属特异性引物,应用荧光定量PCR技术检测乳酸杆菌的16S rDNA,对粪便中的乳酸杆菌进行定量检测和分析,并与用传统方法所获得的结果进行比较。结果荧光定量PCR检测乳酸杆菌和传统方法检测乳酸杆菌获得的结果接近,差异无统计学意义(P>0.05)。结论荧光定量PCR技术比传统方法省时、省力,且敏感性和特异性更高。     

实时荧光定量PCR在肝炎检测中的应用

目的:探讨实时荧光定量PCR在肝炎尤其是乙型肝炎(乙肝)检测中的应用。方法:对450例急、慢性乙肝患者,采用经酶联免疫吸附试验检测血清,并按血清学标志分为三组,并对所用患者血清实时荧光定量PCR检测。结果:不同血清学标志模式的实时荧光定量PCR检测阳性率分别为95.95%、31.47%、52.20%,三组之间差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:实时荧光栋梁PCR检测可以为乙肝病毒感染诊断、治疗及预后判断提供客观依据。但对于病毒非复制感染不能有效检测,不可在肝炎检测中完全替代血清标志物检测。     

荧光定量PCR技术在检测HCV—RNA中的应用

目的 评价荧光定量ＰＣＲ技术测定ＨＣＶ－ＲＮＡ水平的价值,探讨ＰＢＭＣ中检出ＨＣＶ－ＲＮＡ的意义。方法 采用荧光定量ＫＲ及ＲＴ－ＰＣＲ技术同时检测８７例血液透析患者的血清和淋巴细胞中ＨＣＶ－ＲＮＡ。结果血清、淋巴细胞中ＨＣＶ－ＲＮＡ的荧光定量ＰＣＲ检出率（４９．４％、６９．０％）,分别高于相应标本中ＨＣＶ－ＲＮＡ的ＲＴ－ＰＣＲ阳性率（３３．３％、３５．６％）（Ｐ ＜０．０５）。血清、淋巴细胞中同时检出ＨＣＶ－ＲＮＡ的一致率,荧光定量ＰＣＲ法（３１．０％）显著高于ＲＴ－ＰＣＲ定性法（６．９％）（Ｐ＜０．００１）． 荧光定量ＰＣＲ法,淋巴细胞中ＨＣＶ－ＲＮＡ检出率高于血清（Ｐ＜０．０１）。结论 与 ＲＴ－ＰＣＲ相比,荧光定量ＰＣＲ技术检测 ＨＣＶ－ＲＮＡ敏感性较高,对ＰＢＭＣ内ＨＣＶ－ＲＮＡ检测有利于提高ＨＣＶ检测的阳性率。     

定量PCR与EIA法检测血液透析患者HCV比较

目的 探讨血液透析患丙型肝炎病毒（HCV）的检测方法。方法 对79例尿毒症长期血液透析患,采用荧光定量PCR法测定血清HCV-RNA水平,及第二代酶免疫试验（EIA）检测丙型肝炎病毒抗体（抗-HCV）。结果 血液透析患抗-HCV阳性率22.8%(18/79),荧光定量PCR法HCV-RNA检出率39.2%(31/79）。在抗HCV阴性的患中,HCV-RNA的检出率为42.6%(26/61)。两种方法检测结果的符合率为50.6%(40/79)。结论 荧光定量PCR技术可弥补EIA检测的不足,在抗-HCV阴性的血液透析患中检测HCVRNA具有重要意义。     

两种HBV-DNA荧光定量PCR检测比较

目的优化HBV—DNA特异性定量检测方法。方法采用荧光定量PCR检测法，用10份正常血清、10份HBV高滴度（10^6 IU／mL）血清和梯度稀释的HBV克隆质粒标准品，验证两种检测方法的重复性、特异性和灵敏度；并将结果进行配对检验。结果10份正常血清标本均无假阳性HBV—DNA检测结果，特异性极好；10份HBV高滴度血清中检出1份YMDD变异，灵敏度均可达到10^3 IU／mL，重复性和灵敏度两者之间无显著性差异（t=0．702，P〉0．05）。结论该方法特异性和灵敏度高，可用于HBV的临床检测和科学研究。     

实时荧光定量PCR在检测人ANP基因表达的应用

目的 建立心房钠尿肽(ANP)基因mRNA表达水平的实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行初步评价.方法 以基因表达产物为模板,建立实时荧光定量PCR检测方法,对样本中的心房钠尿肽含量进行相对定量,比较不同样本组的基因表达水平.结果 所建立的实时荧光定量PCR方法熔解曲线中熔解峰单一.肺癌患者胸腔样本的ANP含量为对照样本的4.68倍,血清样本为对照样本的16.03倍.结论 所建立的ANP实时荧光定量PCR检测方法具有较高的特异性.肺癌患者胸腔液和血清中ANP的含量明显增高.     

荧光定量PCR检测1000例丙型肝炎RNA结果分析

目的：分析荧光定量PCR检测1 000例丙型肝炎RNA结果,了解不同年龄组HCV-RNA的病毒复制情况。方法：使用荧光定量PCR法检测不同年龄组、不同性别的HCV-RNA拷贝数。结果：根据临床用药不同将其分三个阶段,第一阶段为阴性,第二阶段为1.0E＋3-1.0E＋5,第三阶段为1.0E＋5-1.0E＋8。在（20~30）岁三阶段共54人。在（31~40）岁三阶段为共177人。在（41~50）岁三阶段共411人。在（51~60）岁三阶段共197人。在60岁以上三阶段共161人。合计：第一阶段为469人,第二阶段为93人,第三阶段为438人,共1 000人。2=37,P〈0.005,丙肝RNA的检测结果与发病年龄两者之间有关联性。阳性率为53.1%,男占52%,女占48%,比为10.92。结论：分析结果认为本组资料较准确的反映了不同年龄组HCVRNA的病毒复制情况,为临床诊断治疗提供了依据。     

胃癌组织Twist基因的荧光实时定量PCR检测

目的探讨Twist基因在人胃癌组织、癌旁组织、胃癌转移灶组织中表达及临床意义。方法应用Trizol法提取总RNA，以总RNA为模板经逆转录合成cDNA，用实时荧光定量PCR的方法检测8例正常胃粘膜，27例胃癌原发灶，19例胃癌转移灶组织中Twist mRNA的表达情况并分析其与临床病理指标的关系。结果荧光实时定量PCR扩增结果显示，Twist基因在正常胃粘膜组织中表达量很低，而在原发性胃癌组、转移性胃癌组中均有较高的表达，原发性胃癌组织及腹膜转移组织中的表达明显高于正常胃粘膜组织（P〈0．05）；Twist基因在淋巴转移组织中的表达与原发组中的表达差异显著（P〈0．05）。结论Twist基因在胃癌中过度表达可能促进胃癌的发生与发展，并与胃癌转移密切相关，又可能成为预测胃癌转移潜能的分子基础。     

应用于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法

目的建立特异灵敏的适应于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法.方法于细菌样本离心所得沉淀中加入提取液(25% Chelex-100,0.5%NP40,TE配制,pH=9.0);56℃孵育30 min;100℃水浴10 min;离心后所得上清即为DNA.电泳、PCR及Real-time PCR扩增评价该方法的特异性及灵敏度.结果本方法所提细菌DNA电泳条带清晰,未见假阳性,D(260)/D(280)=(1.79±0.03);PCR及Real-time PCR扩增未见假阳性及假阴性,灵敏度达101/ml细菌浓度.结论本研究细菌DNA提取方法特异灵敏,适应于PCR及Real-time PCR.     

实时荧光定量PCR检测限的统计推断

检测限是检测方法的重要性能指标,用Poisson分布的概率函数分式计算一次抽样检测出现的结果推论总体出现该结果的概率。以实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测乙型肝炎病毒DNA结果为例,计算可知,一次抽样反应管的检测结果≥4时,才可推论总体与0(空白)差异有显著性(P<0.05)。因而检测血清中病原体时扩增反应管中的检测限是4拷贝/ul计算也可知,1拷贝/ul表示一次抽样的结果为0的概率可达0.368,结果在0拷贝/ul～4拷贝/ul的概率为0.996,而1000拷贝/ml表示一次抽样结果为0的概率为0。结果在905拷贝/ml～1095拷贝/ml的概率为0.997;而100000拷贝/L表示一次抽样结果在997000拷贝/L～1003000拷贝/L的概率为0.997。抽样单位ul不能随意放大为ml甚至L。     

荧光定量PCR法检测血清中HCV-RNA

目的：分析125例患者以荧光定量PCR（FQ-PCR）法检测的HCV-RNA结果,评价其临床价值。方法：血清标本同时以酶联免疫吸附法检测抗HCVIgG,以荧光定量PCR法检测HCV-RNA。结果：在125例标本中,HCV-RNA阳性率为55.2%（69/125）,抗HCVIgG阳性率为77.6%（97/125）,两者差别有统计学意义（P〈0.05）。结论：荧光PCR检测HCV-RNA可以直接反映体内丙型肝炎病毒（HCV）的活动性和复制程度,优于抗HCVIgG对HCV感染的检测准确性,有利于抗病毒治疗的疗效观察。     

HBVDNA荧光定量PCR检测及临床意义

血清HBV-DNA浓度与乙型肝炎病毒感染的严重程度和传染性有关,可用于判断病情和预后,以及观察抗病毒药物的治疗效果.通常血清 HBV-DNA持续阳性超过6个月会转为慢性肝 炎.抗-HBc阳性患者血清HBV-DNA持续阳性常提示肝受损严重,50%以上抗-HBc阳性慢性活动性肝炎患者,经平均4.5年发展为肝硬化,常与HBV-DNA持续阳性有关.     

荧光定量PCR在乙肝检测中的应用

目的 :探讨 5‘ -核酸酶法荧光定量技术在乙肝检测中应用状况。方法 :采用荧光定量PCR方法 ,检测2 0份阳性对照考核批内及批间变异 ;采用 5 0份HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAg(+)的血清 ,结合肝功能及HBeAg滴度考核阳性率、病毒含量范围以反映病毒复制状况 ;对 5份本法检测阳性的标本 ,4℃保存 ,并隔日检测 ,确定最佳检测时间。结果 :批内CV为 4 1 % ,批间CV为 4 0 %。阳性标本为 4 6份 (92 % ) ,其中 4份肝功能正常 ;阴性标本为 4份 (8% ) ,其中 1份肝功能异常。病毒量有较大的变化范围 ,从 0 .1 1× 1 0 4～ 5 .1× 1 0 4CID/ml。阳性标本所测病毒量与HBeAg滴度相关系数为 0 .77。在 1 5d内隔日所测病毒量相近。结论 :本法应用于乙肝检测 ,有较好的特异性 ;定量结果能够反映病毒在体内的复制状况 ;病毒含量因患者而异 ;在严格操作条件下 ,本法有一定的重复性 ;正确保存标本时 ,在半月内均可以检测病毒     

实时荧光定量PCR的研究进展及其应用

随着PCR(聚合酶链反应)技术的飞速发展,实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术以其特异性强、灵敏度高、自动化和重复性好、定量准确、污染少等优点,成为分子生物学和其它领域的重要技术工具,并广泛应用于遗传病、病原体和肿瘤等方面的检测和诊断.本文就实时荧光定量PCR技术的主要原理、定量方法及目前在研究领域中主要的应用进行了概述.     

实时荧光定量PCR检测肾移植患者术后BK病毒感染

目的:建立肾移植术后患者尿液和外周血BK病毒(BKV)感染负荷的实时荧光定量PCR检测方法,并初步探讨其临床应用价值.方法:构建含有BKV VP1蛋白保守区核苷酸序列片段的质粒作为外参照品,采用TaqMan荧光探针检测技术,建立定量检测BKV DNA方法;并对112例肾移植术后患者,40例正常体检者的尿液和外周血标本BKV含量进行检测.结果:本研究建立的BKV实时荧光定量PCR检测方法灵敏度、特异度及重复性较好,定量PCR方法最低检测下限为8×102copy/ml,测量批内差异为0.54%～3.78%,批间差异为0.62%～4.58%.112例肾移植术后患者尿液和外周血BKV DNA的检测阳性率分别为27.7%和11.6%,BKV DNA阳性者尿液和外周血BKV中位数水平分别为8.2×104copy/ml和2.4×103copy/ml.40例正常人BKV尿液和外周血阳性率为2.5%和0%;与正常体检者相比,肾移植术后患者尿液及外周血BKVDNA阳性率及水平明显升高(P＜0.01).尿液BKV阳性率较外周血明显升高(P=0.02),但尿液和外周血中BKV含量无明显相关性.结论:实时荧光定量PCR检测肾移植患者术后BKV感染方法简便、可靠、准确,为进一步研究BKV感染与肾移植术后移植物丢失的关系奠定了基础.     

实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌femA表达水平

目的探讨实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌乒,以表达的方法。方法以BB270femA基因表达为标准,建立实时荧光定量PCR方法,对实验菌株femA表达进行相对定量。结果建立的实时荧光定量PCR方法所得结果标准曲线线性关系好,熔解峰单一。随MIC变化,金黄色葡萄球菌femA表达水平也随之变化。结论用实时荧光定量PCR方法研究金黄色葡萄球菌femA表达量结果可靠、敏感、重复性好。