pTn5GFP转座质粒用于耐药鲍曼不动杆菌生物被膜相关基因的研究

【立论依据】 鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,AB)是一种革兰氏阴性球杆菌,是引起院内感染的主要菌种之一,多重耐药和泛耐药AB菌株感染更是给临床治疗带来极大的困难。生物被膜形成能力与AB耐药以及致病性密切相关。寻找AB生物被膜形成的关键基因对于AB相关疾病的预防和控制具有重要意义。转座子是一段特殊的DNA片段,在转座酶的作用下,可随机插入细菌基因组,使插入基因失活,改变相关表型。应用转座子随机突变策略可以找出特定表型对应的基因,但是以传统的抗生素抗性基因作为报告基因显然不能满足对多重耐药菌株的研究。 【设计思路】 绿色荧光蛋白(GFP)因为不需要单独加入底物并且易于观察而被广泛用来标记生物分子或细胞。已有研究表明,GFP基因插入细菌的染色体上后,可以有效地对细菌进行标记。基于转座质粒以及GFP的特点,本研究拟构建具有Tn5转座子和GFP基因的pTn5GFP转座质粒,利用GFP作为报告基因,构建临床分离的多重耐药AB突变文库,进而筛选出AB生物被膜形成的关键基因,并对其功能进行研究。 【实验内容】 以pGFPmut3.1质粒为模板,扩增GFP基因,将其连接入含有Tn5转座子的pRL27质粒,构建pTn5GFP转座质粒。利用该质粒对多重耐药AB菌株进行转座子突变,构造突变文库。对突变株的生物被膜情况进行分析,确定转座子插入位点,找出生物被膜形成的关键基因,并对其功能进行研究。 【材料】 临床多重耐药AB两株,R005和R036,自北京大学人民医院获得。常用工具菌E.coli CC118λπ和E.coli DH5α。pRL27和pGFPmut3.1质粒由原实验室毕业研究生提供。 【可行性】 已成功构建了pTn5GFP转座质粒,该质粒在容纳菌株E.coli CC118λπ具有绿色荧光表型,并已通过预实验初步确定了两株多重耐药AB生物被膜形成能力和最适实验条件。 【创新性】 本研究将GFP报告基因的便捷性以及转座质粒的转座性结合起来,有效解决了因耐药性而无法对泛耐药菌株构建突变文库的问题,结果直观,易于筛选,可行性高。     

外排泵抑制剂对泛耐药鲍曼不动杆菌生物被膜的影响

目的 了解泛耐药鲍曼不动杆菌(XDR AB)生物被膜形成与外排泵基因表达的关系,比较4种外排泵抑制剂对泛耐药鲍曼不动杆菌生物被膜的作用.方法 1)微量肉汤稀释法测定4种外排泵抑制剂(EPIs)PAβN、奥美拉唑、维拉帕米、CCCP对9株泛耐药鲍曼不动杆菌的最低抑菌浓度(MIC);并分别测定9株XDR AB生物被膜形成前...     

鲍曼不动杆菌Ⅰ类整合酶基因在生物被膜内的表达及耐药分析

目的：研究携带Ⅰ类整合子的鲍曼不动杆菌在生物被膜状态和普通液相培养状态下Ⅰ类整合酶基因（Class Ⅰ integrase gene,intI 1）mRNA的表达,并分析Ⅰ类整合子阳性菌耐药情况。方法：收集鲍曼不动杆菌临床株,并经过基因扩增筛选出携带Ⅰ类整合子的阳性菌株。提取携带Ⅰ类整合子的鲍曼不动杆菌在生物被膜和液相培养2种生长状态下的总RNA,采用半定量RT-PCR方法分析2种生长状态下细菌的Ⅰ类整合酶表达情况。并用纸片扩散法对携带Ⅰ类整合子的临床分离鲍曼不动杆菌进行药敏试验。结果：携带Ⅰ类整合子的鲍曼不动杆菌在生物被膜状态和液相培养状态下均有intI 1基因mRNA表达。但生物被膜生长状态下的intI 1mRNA表达量高于液相培养状态下表达量约4倍。在收集的64株鲍曼不动杆菌中有46株携带intI 1基因,而且Ⅰ类整合子基因盒阳性菌株的部分耐药率高于整合子基因阴性的菌株。结论：鲍曼不动杆菌在生物被膜状态intI 1mRNA的表达上调,Ⅰ类整合子在细菌耐药中发挥作用。提示整合子在生物被膜状态下可进行更活跃的基因捕获。     

ICU环境鲍曼不动杆菌存在情况及耐药基因型调查

目的了解监护室环境中鲍曼不动杆菌的存在状况及其耐药表型和基因型。方法于2010年10月-2011年10月,每隔2周对外科监护室、神经内科监护室和呼吸科监护室病人周边环境进行采样并分离鲍曼不动杆菌;对所分离的菌株进行抗生素敏感试验和耐药基因IMP、SIM、VIM、OXA-23、24、51、58检测。结果3个监护室病人周边环境共采集标本7878份,共分离鲍曼不动杆菌229株,其中呼吸科监护室分离率（5．41％）高于外科监护室（2．39％）和神内监护室（2．56％）（P〈0．001）。抗生素敏感性除对多黏菌素（67％）相对较高以外,其余普遍较低;金属酶IMP和VIM基因检出率为20．52％和11．36％,未检出SIM基因;苯唑西林酶（OXA群）基因OXA-51分离率为32．75％（75／229）、OXA-23分离率为31．44％（72／229）、OXA-58分离率为3．49％（8／229）,未检出OXA-24、AmpC和CTX—M。结论监护室环境菌株的污染和耐药现状较为严重,应加强日常环境清洁消毒工作,防止鲍曼不动杆菌暴发和感染率的升高。     

鲍曼不动杆菌Ⅰ类整合酶基因在生物被膜内的表达及耐药分析

目的:研究携带I类整合子的鲍曼不动杆茵在生物被膜状态和普通液相培养状态下I类整合酶基因(Class 1 integrase gene,intl 1)mRNA的表达,并分析I类整合子阳性茵耐药情况.方法:收集鲍曼不动杆茵临床株,并经过基因扩增筛选出携带I类整合子的阳性茵株.提取携带I类整合子的鲍曼不动杆菌在生物被膜和液相培养2种生长状态下的总RNA,采用半定量RT-PCR方法分析2种生长状态下细茵的I类整合酶表达情况.并用纸片扩散法对携带I类整合子的临床分离鲍曼不动杆菌进行药敏试验.结果:携带I类整合子的鲍曼不动杆菌在生物被膜状态和液相培养状态下均有intl 1基因mRNA表达.但生物被膜生长状态下的intl 1mRNA表达量高于液相培养状态下表达量约4倍.在收集的64株鲍曼不动杆菌中有46株携带intl 1基因,而且I类整合子基因盒阳性菌株的部分耐药率高于整合子基因阴性的菌株.结论:鲍曼不动杆菌在生物被膜状态intl 1 mRNA的表达上调,I类整合子在细菌耐药中发挥作用.提示整合子在生物被膜状态下可进行更活跃的基因捕获.     

多重耐药鲍曼不动杆菌β-内酰胺酶基因型研究

目的:了解我院临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌β-内酰胺酶基因分布情况。方法:用三维试验检测15株多重耐药鲍曼不动杆菌ESBLs、AmpC、MBL(金属β-内酰胺酶)产酶情况;用PCR方法检测各种β-内酰胺酶基因。结果:三维试验检出2株菌产ESBLs;9株菌产AmpC;3株菌合产ESBLs和AmpC酶;3株菌产MBL(均同时产AmpC)。PCR检出15株菌均携带blaTEM基因;2株菌携带blaPER-1基因;14株菌携带AmpC基因;未检出产金属β-内酰胺酶基因。结论:我院多重耐药的鲍曼不动杆菌多含有blaTEM基因和AmpC基因,也首次发现部分产PER型ES-BLs鲍曼不动杆菌。     

南京地区鲍曼不动杆菌耐药性及β-内酰胺酶基因型分析

目的:调查和分析南京地区75株鲍曼不动杆菌耐药性及β-内酰胺酶基因型.方法:用KB法测定临床分离的75株鲍曼不动杆菌对5种抗菌药物的耐药性,采用PCR法检测β-内酰胺酶耐药基因型.结果:75株鲍曼不动杆菌中对头孢哌酮/舒巴坦耐药率为8.0%,头孢吡肟和头孢他啶的耐药率分别为61.3%和64.0%,头孢唑啉和头孢呋辛钠的耐药率均在80%以上;PCR扩增后有43株菌检测到TEM型β-内酰胺酶基因,且均对头孢吡肟等抗生素耐药,3株为GES型,2株为VEB型,未检出CARB、DHA和PER基因.结论:南京地区鲍曼不动杆菌以TEM型为主,其对β-内酰胺类的高耐药率与TEM型基因有直接的关系.     

多重耐药鲍曼不动杆菌的耐药机制研究

目的 分析70株多重耐药鲍曼不动杆菌的耐药情况,检测其超广谱p内酰胺酶(ESBLs)与头孢菌素酶(Ampc)的耐药表型与基因型.方法 采用微量稀释法测定重庆医科大学附属第二医院临床分离的70株鲍曼不动杆菌对16种抗菌药物的敏感性;三维试验法检测ESBLs与Ampc酶的表型;采用聚合酶链反应(PCR)检测A类BLA基因TEM型、SHV型、CTX型以及C类BLA基因ADC型、DHA型.结果 70株多重耐药鲍曼不动杆菌中,32株(45.7％)单产Ampc酶,8株(11.4％)单产ES-BLs,20株(28.6％)同时产Ampc酶和ESBL,合计共28株(40％)产ESBLs,共52株(74.2％)产Ampc酶.PCR实验共检测出blaTEM、blaSHV、blaADC 3种基因,分别为69株(98.6％)、25株(35.7％)、56株(80.0％),bla CTX、bla DHA两种基因均为阴性.70株菌除对左氧氟沙星耐药率为67.2％以外,其余耐药率均大于80％.结论 该院临床分离的鲍曼不动杆产ESBLs与Ampc比例较高,多重耐药状况严重.     

OmpA基因表达与鲍曼不动杆菌耐药的相关性

目的 分析鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,AB)OmpA基因缺失株(△OmpA)和OmpA基因补救株(+OmpA)药物敏感性的差异,探讨临床株鲍曼不动杆菌OmpA mRNA表达水平与耐药的相关性,明确OmpA在鲍曼不动杆菌耐药中的作用.方法 采用定点诱变技术构建ATCC17978 OmpA...     

耐亚胺培南鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶基因分析

目的研究我院耐亚胺培南鲍曼不动杆菌（IRAB）的耐药性与碳青霉烯酶基因型。方法收集我院耐亚胺培南鲍曼不动杆菌35株,K—B法和E—test法测定对常用抗茵药物的敏感性,采用改良Hodge试验和乙二胺四乙酸（EDTA）协同试验检测耐亚胺培南不动杆菌产碳青霉烯酶和金属β-内酰胺酶情况,聚合酶链反应（PcR）检测其碳青霉烯酶基因OXA-23、OXA-24、OXA-58、IMP、VIM。结果35株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌对β-内酰胺类、部分氨基糖苷类、喹诺酮类及磺胺类抗菌药物均有很高耐药率（〉70％）,仅对阿米卡星、头孢哌酮／舒巴坦和多粘菌素B有较高的敏感性（〉70％）,35株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌均产碳青霉烯酶,未检测到金属β-内酰胺酶,全部检测到OXA-23型基因,未检测到OXA-24、OXA-58、IMP、VIM型基因。结论耐亚胺培南鲍曼不动杆菌耐药相当严重;产OXA-23型碳青霉烯酶是我院鲍曼不动杆菌对亚胺培南耐药的主要原因。     

鲍曼不动杆菌耐药相关基因国内近5年来研究进展

本文介绍鲍曼不动杆菌耐药相关基因国内5a研究进展。     

多重耐药鲍曼不动杆菌的耐药分子机制及质粒谱分析

目的了解我院临床分离的66株多重耐药鲍曼不动杆菌(MDRAB)的耐药性和整合子(qacE△1-sull)、转座子(tnpU)存在状况,并对菌株质粒谱进行分析。方法采用VITEK-2全自动细菌鉴定仪检测鲍曼不动杆菌对18种抗生素的药敏结果,并对该细菌进行总DNA的提取。用聚合酶链反应(PCR)检测qacE△1-sull及tnpU,提取质粒进行同源性分析。结果 66株鲍曼不动杆菌中整合子qacE△1-sull基因阳性率为31.8%,转座子tnpU基因阳性率为30.3%。携带遗传标记的菌株耐药率高,特别是对头孢曲松、氨苄西林、头孢替坦、头孢唑啉、呋喃妥因的耐药率已接近或达到100%,而对丁胺卡那霉素和头孢哌酮/舒巴坦的耐药率最低,分别为5%和20%;有19株对亚胺培南耐药,其中整合子阳性率63.2%,转座子阳性率36.8%。检出质粒的46株(70%)临床分离菌出现1～3条大质粒带,大小在1～20kb间,其中出现1条带的有33株、2条带8株、3条带5株,有12株菌提取到大小相同的质粒。结论多重耐药鲍曼不动杆菌耐亚胺培南的耐药现象严重;整合子、转座子遗传标记的携带率高,可能是鲍曼不动杆菌多重耐药的主要原因。     

鲍曼不动杆菌的临床分布及耐药性变迁

目的了解鲍曼不动杆菌在临床标本的分离率和病区分布及耐药性变化趋势。方法菌株鉴定采用法国梅里埃VITEK32细菌鉴定系统进行鉴定,药敏试验采用K-B法,药敏试验结果判定以CLSI/NCCLS标准进行。结果 2004-2010年共收到26670份标本,分离出阳性细菌7065株,其中鲍曼不动杆菌471株(6.67%),分离率为1.77%(471/7065)。在471株鲍曼不动杆菌中,从痰液标本分离出最多有409株(86.83%),分离率最高的是ICU,占49.3%。鲍曼不动杆菌对抗菌药物的耐药性普遍较高,且呈逐年升高趋势,部分表现出多重耐药特征。结论鲍曼不动杆菌的耐药状况日益严重,应重视临床鲍曼不动杆菌的感染与分离,谨防多重耐药鲍曼不动杆菌的院内感染及暴发流行。     

烧伤患者气管套管内鲍曼不动杆菌生物膜形成及特征研究

目的观察鲍曼不动杆菌在烧伤患者气管套管（ETT）内细菌生物膜（BF）的形成过程及其特征。方法烧伤患者ETT内壁取样（临床菌株）,Vitek2快速细菌自动鉴定仪分离鉴定9株鲍曼不动杆菌且均为泛耐药菌株。临床菌株分别于体外培养12、24、48、72h,改良微孔法进行BF半定量黏附试验;FITC-ConA/PI荧光双染色后激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）观察并测定成熟BF厚度;以标准菌株鲍曼不动杆菌（ATCC19606）作为对照。于ETT拔除时收集并制备套管内壁标本,扫描电子显微镜观察。结果 BF半定量黏附试验结果显示,临床菌株黏附力在体外培养24～48h时达到高峰,且各时相点均显著大于标准菌株（P〈0.05）;CLSM动态观察发现,临床菌株在体外培养48h左右形成成熟BF,其厚度均显著大于标准菌株（P〈0.05）;ETT内壁扫描电镜观察可见成熟BF呈团状簇集,细菌被大量胞外多糖复合物包埋并融合呈片状。结论鲍曼不动杆菌能在烧伤患者ETT内壁形成BF,且具有成熟早、数量多、黏附能力强的特点,是烧伤后ETT相关感染的重要原因。     

泛耐药鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类抗生素机制研究

目的研究鲍曼不动杆菌对碳青霉烯耐药的表型和分子机制。方法采用KB法及琼脂稀释法从临床分离的84株泛耐药鲍曼不动杆菌中随机选取8株,采用外排泵抑制试验筛查外排泵表型阳性菌株,EDTA协同实验筛选金属β-内酰胺酶表型,改良三维试验检测ESBLs和AmpC酶,改良Hodge试验检测碳青霉烯酶,PCR扩增耐药菌株的KPC酶、碳青霉烯酶和ESBLs基因,并测序分析。提取外膜蛋白行SDS-PAGE。结果 PAβN抑制试验显示亚胺培南MIC值下降均≤4倍,而美罗培南MIC值下降≥4倍者占50%(4/8)。EDTA协同试验结果显示阴性。改良Hodge试验检测8株耐药菌结果阳性。耐药基因PCR扩增和测序证实8株耐药菌中7株有blaOXA-23基因,5株含blaTEM-1基因,8株耐药菌均含有KPC-2酶基因;耐药菌株的外膜蛋白电泳条带在25 ku处出现明显缺失。结论鲍曼不动杆菌对碳青霉烯耐药机制主要是产生KPC-2酶、blaOXA-23酶,外膜蛋白25 ku表达的缺失所致,外排泵过度表达可能参与美罗培南的耐药。     

鲍曼不动杆菌4年耐药谱变化分析

目的：了解本院鲍曼不动杆菌检出率及其对常用抗生素的耐药率的变化.方法：回顾调查方法对本院从2002年1月至2005年12月,4年鲍曼不动杆菌分离率和试验结果进行分析.结果：所分离出的144株鲍曼不动杆菌,占革兰阴性杆菌的6.79%;鲍曼不动杆菌对对常用抗菌药物的耐药率总体呈上升趋势,对头孢唑啉、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢曲松、氨苄西林、哌拉西林等耐药率超过50%.耐药率低于20%的有阿米卡星、氨苄西林-舒巴坦、头孢哌酮-舒巴坦、头孢他啶,对亚胺培南仍呈高度敏感.结论：本地区鲍曼不动杆菌检出率有逐年增加的趋势,但仍维持在较低的水平.为防止鲍曼不动杆菌的感染率继续上升,加强监测鲍曼不动杆菌的检出率和耐药率变化,对提高临床抗不动杆菌感染的成功率有帮助.     

烧伤患者气管套管内鲍曼不动杆菌生物膜形成及特征研究

目的 观察鲍曼不动杆菌在烧伤患者气管套管(ETT)内细菌生物膜(BF)的形成过程及其特征.方法 烧伤患者ETT内壁取样(临床菌株),Vitek2快速细菌自动鉴定仪分离鉴定9株鲍曼不动杆菌且均为泛耐药菌株.临床菌株分别于体外培养12、24、48、72 h,改良微孔法进行BF半定量黏附试验;FITC-ConA/PI荧光双染色后激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)观察并测定成熟BF厚度;以标准菌株鲍曼不动杆菌(ATCC19606)作为对照.于ETT拔除时收集并制备套管内壁标本,扫描电子显微镜观察.结果 BF半定量黏附试验结果显示,临床菌株黏附力在体外培养24～48 h时达到高峰,且各时相点均显著大于标准菌株(P<0.05);CLSM动态观察发现,临床菌株在体外培养48 h左右形成成熟BF,其厚度均显著大于标准菌株(P<0.05);ETT内壁扫描电镜观察可见成熟BF呈团状簇集,细菌被大量胞外多糖复合物包埋并融合呈片状.结论 鲍曼不动杆菌能在烧伤患者ETT内壁形成BF,且具有成熟早、数量多、黏附能力强的特点,是烧伤后ETT相关感染的重要原因.     

鲍曼不动杆菌的耐药与多粘菌素临床应用探讨

目的 了解西安市某三甲医院2年来鲍曼不动杆菌的药敏变迁情况,探讨多粘菌素治疗鲍曼不动杆菌的临床应用效果.方法 回顾分析2010年1月～2011年12月西安市某三甲医院细菌室的分离菌株,统计鲍曼不动杆菌的检出率和体外药敏效果.结果 2010年共分离细菌4552株,2011年7269株;鲍曼不动杆菌检出率分别为583株（12.8％）和934株（12.8％）,为分离菌株第二位.多粘菌素B对鲍曼不动杆菌保持高体外活性,2010和2011年敏感率分别为92％和91％.结论 鲍曼不动杆菌临床检出率很高,药敏试验证实对多粘菌素B保持很高体外活性,多粘菌素是临床治疗鲍曼不动杆菌的选择之一.