StAR基因探针的制备及应激状态下小鼠睾丸间质细胞StAR基因的表达分析

目的 制备类固醇快速调节蛋白基因(StAR)探针,观察应激状态下StAR基因在小鼠睾丸间质细胞的表达变化.方法 提取C57BL/6小鼠睾丸总RNA, 并以此为模板,通过逆转录PCR获得StAR基因片断,运用T/A克隆策略, 将扩增的StAR基因片断重组于pCR2.1-POPO 载体,经过双酶切和DNA序列鉴定后,体外转录制备地高辛标记的StAR cRNA探针.采用限制活动制备应激状态小鼠模型(实验组),运用原位杂交的方法 分析实验组和正常对照组睾丸间质细胞的StAR mRNA表达水平. 结果 成功制备StAR基因探针,实验组睾丸间质细胞的StAR mRNA 的水平较对照组明显下降(P<0.05).结论 应激状态可下调睾丸间质细胞中StAR基因的表达,从而最终使雄激素水平降低.     

邻苯二甲酸二丁酯暴露对青春期雌性大鼠卵巢P450scc基因表达的影响

目的:探讨邻苯二甲酸二丁酯(DBP)对青春期雌性大鼠的生殖毒性作用及作用机制.方法:21d龄SPF级雌性SD大鼠,随机分为DBP250 mg/kg、500 mg/kg、1 000 mg/kg3个染毒组和溶剂对照组(玉米油),连续8周灌胃染毒.染毒结束后,在动情前期对大鼠实施处死,取动脉血,利用放射免疫荧光法检测血清中孕酮(P)水平;取卵巢组织提取mRNA,实时荧光定量RT-PCR检测大鼠卵巢组织细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶(P450scc)mRNA表达水平.结果:各处理组间大鼠血清P水平有统计学差异(F=4.306,P=0.014),与对照组比较,DBP 1 000 mg/kg剂量组大鼠血清P水平降低(P＜0.05),与对照组比较,250mg/kg及500mg/kg剂量大鼠血清P水平无统计学差异.各处理组间大鼠卵巢P450scc mRNA表达水平有统计学差异(H=15.591,P＜0.01),与对照组比较,DBP 250 mg/kg、500 mg/kg、1 000 mg/kg剂量组大鼠卵巢P450scc mRNA表达水平降低(P＜0.01),各剂量组间卵巢P450scc mRNA表达水平比较无统计学差异(P＞0.05).结论:DBP可使青春期雌性大鼠卵巢P450scc表达降低,提示DBP对雌性大鼠产生生殖毒性.     

膜联蛋白5对雄性SD大鼠睾酮合成相关蛋白和酶表达的影响

目的 研究注射膜联蛋白5后雄性SD大鼠睾丸类固醇急性调节蛋白(Steroidogenic acute regulatory protein,StAR)、胆固醇侧链裂解酶(P450 cholesterol side-chain cleavage enzyme,P450scc)和3β-羟类固醇脱氢酶(3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)表达的改变,初步探讨膜联蛋白5影响睾酮分泌的机制.方法 将20只SD大鼠随机分为对照组和实验组,实验组又分为7.5μg/kg组、15μg/kg组和30μg/kg组,每组5只.对照组大鼠腹腔注射等量的pH 8.0Tris-HCl,实验组腹腔注射不同剂量的膜联蛋白5,1次/d,连续20d.用RT-PCR方法分别检测对照组和各实验组SD大鼠睾丸组织中睾酮合成相关的StAR、P450scc和3β-HSD mRNA的表达变化,并用Western blot方法检测以上3种物质蛋白质水平的变化.结果 与对照组相比,在mRNA水平上,7.5μg/kg组和15μg/kg组大鼠睾丸组织P450scc mRNA表达分别增加了25.9%[(0.68±0.04) vs (0.54±0.03),P<0.01]和27.8%[(0.69±0.04) vs (0.54±0.03),P<0.01];3β-HSD mRNA表达分别升高了32.9%[(1.05±0.07) vs (0.79±0.10),P<0.01]和53.2%[(1.21±0.07) vs (0.79±0.10),P<0.01];而30μg/kg组表达差异无统计学意义;在蛋白水平上,15μg/kg组大鼠睾丸组织P450scc蛋白表达提高了34.2%[(0.37±0.04) vs (0.28±0.02),P<0.01],7.5μg/kg组和15μg/kg组的3β-HSD表达也分别增加了14.7%[(1.53±0.10) vs (1.34±0.05),P<0.01]和24.4%[(1.67±0.14) vs (1.34±0.05),P<0.01];而StAR的表达无论在转录水平还是在蛋白水平上,较对照组差异均无统计学意义.结论 膜联蛋白5可通过调节P450scc与3β-HSD的表达来调节睾酮合成.     

膜联蛋白5对大鼠睾丸间质细胞中类固醇急性调节蛋白和睾酮合成相关酶表达的影响

目的：研究膜联蛋白5（annexin 5）对大鼠睾丸间质细胞（Leydig细胞）睾酮合成相关蛋白和酶表达的影响。 方法：原代培养大鼠睾丸间质细胞24 h后,用10^-9 mol/L的annexin 5处理间质细胞12 h和24 h,分别提取细胞总RNA和总蛋白;反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测类固醇急性调节蛋白（steroidogenic acute regulatory,StAR）、胆固醇侧链裂解酶（P450scc）、3β-羟基类固醇脱氢酶（3β-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD）、17α-羟化酶（17α-hydroxylase,CYP17A）、17β-羟基类固醇脱氢酶Ⅹ型（17β-HSD₁₀）mRNA表达的改变,并用蛋白免疫印迹方法（Western blotting）检测蛋白表达水平的变化。 结果：与对照组相比,在mRNA水平上, annexin 5处理细胞12 h后,只有17β-HSD₁₀的表达升高了26%（P<0.05）,其他差异均无统计学意义,而处理24 h后,StAR、P450scc和3β-HSD的表达分别升高55%、69%和59%（P<0.05）,17β- HSD₁₀升高了104%（P<0.01）,17α-hydroxylase表达则无显著差异;在蛋白水平上, annexin 5处理细胞12 h后,17β-HSD的表达升高了39%（P<0.05）,而处理24 h后发现,除StAR表达无显著变化外, P450scc、3β-HSD和17β-HSD的表达分别升高了35%、88%（P<0.05）和47%（P<0.01）。 结论：Annexin 5对睾酮合成具有调节作用,这种作用是通过在基因水平和蛋白水平上影响P450scc、3β-HSD和17β-HSD的表达而实现的。     

睾丸性不育症间质细胞增殖变化与Livin、Bim蛋白表达的关系

目的 研究睾丸性不育症中睾丸间质细胞增殖变化与相关基因Livin、Bim的关系,为睾丸间质细胞增殖失衡的基因调控机制提供依据.方法 应用免疫组化S-P法检测睾丸间质细胞Ki-67和Livin、Bim蛋白的表达,以Ki-67计数作为增殖指数（PI）.结果 在58例睾丸性不育症间质细胞中,PI和Livin、Bim蛋白阳性表达率分别为（0.57±0.08）、36.2%、69.0%;在11例正常睾丸组织间质细胞中,分别为（0.78±0.15）、54.5%、36.4%,组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）.Livin阳性组PI高于阴性组（P＜0.05）,呈正相关;Bim阳性组PI低于阴性组（P＜0.05）,呈负相关.结论 睾丸性不育症中睾丸间质细胞增殖失衡与Livin、Bim基因异常表达有关,从而间接影响精子形成.     

Ras分子信号蛋白调控睾丸间质细胞Cox7a2蛋白表达及共定位影响研究

目的：研究Cox7a2与Ras分子蛋白的共定位特点,探讨迟发性性腺功能障碍（late onset hypogonadism,LOH）的分子信号调控机制。 方法：构建Cox7a2及Ras正义及点突变体荧光表达载体,鉴定后转染细胞,荧光显微镜观察Cox7a2及Ras蛋白的共定位特点。结果：Cox7a2的线粒体定位能被Wt-Ras所干扰,N17-Ras突变体转染细胞,Cox7a2恢复线粒体定位,提示Cox7a2和N17-Ras之间可能存在相互作用。结论：Cox7a2对睾酮合成的调控可能与Ras相关信号通路有关,Ras可能是调控靶点之一。     

单次热应激诱导小鼠睾丸间质细胞乙醛脱氢酶蛋白表达的变化

目的 探讨ALDH2在单次热应激致小鼠睾丸功能可逆性变化中的作用。方法 C57雄性小鼠18只,随机分成对照组和热处理组,热处理组按处理后1、7、14 d分成3个亚组(n=3),每组设立对照组(n=3),热应激组和对照组小鼠下腹部分别置于43 ℃和25 ℃水浴中干预15 min,于处理后1、7、14 d 取睾丸组织。免疫组化染色检测ALDH2蛋白定位及表达,Western 印迹检测ALDH2蛋白表达水平。结果 免疫组化显示,ALDH2蛋白在睾丸间质细胞中表达。Western 印迹检测显示,与对照组相比,热应激后第1天,ALDH2蛋白表达无明显改变;热应激后第7天、14天较对照组及热应激第1天比较,ALDH2蛋白表达明显增多(P＜0.01);热应激第7天与热应激第14天,ALDH2蛋白表达无明显改变。结论 小鼠在热应激处理后的第7、14天,ALDH2蛋白表达量在睾丸组织中显著增加。     

先天性类脂质性肾上腺增生症的研究进展

先天性类脂质性肾上腺增生症(CLAH)是先天性肾上腺增生症(CAH)中最为严重的一种类型,主要是由类固醇生成急性调控蛋白(StAR)基因和编码胆固醇侧链裂解酶(P450scc)基因突变引起,是一种常染色体隐形遗传疾病。典型的CLAH多在患儿出生不久后即出现失盐及肾上腺功能不全的症状,如脱水、低钠血症、高钾血症等,同时合并有性发育障碍、皮肤色素沉着,治疗上多以对症治疗及皮质激素治疗为主,若不及时治疗,有可能出现肾上腺危象,危及患者生命。目前CLAH具体发病机制不详,本文主要就CLAH、StAR、P450scc及三者之间的联系予以综述,以期为CLAH的研究进展提供参考依据。     

促性腺激素释放激素类似物对大鼠睾丸间质细胞膜联蛋白5和3β-羟类固醇脱氢酶mRNA表达的影响

目的:观察促性腺激素释放激素(GnRH)类似物对大鼠睾丸间质细胞annexin 5和3β-HSD mRNA表达的影响. 方法:原代培养大鼠睾丸间质细胞48h后,分别用不同终浓度的GnRH激动剂(GnRH-agonist, GnRHa)(10-5mol/L、10-6 mol/L、10-7 mol/L)和GnRH 拮抗剂(GnRH-antagonists, GnRHant)(10-6 mol/L、10-7 mol/L、10-8 mol/L)处理细胞,提取细胞总RNA,反转录,设计特异性引物和Tagman探针,荧光定量PCR检测膜联蛋白5(annexin 5)和3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD) mRNA表达的改变. 结果:荧光定量PCR结果显示,与未加GnRH类似物的对照组相比,当GnRHa的终浓度为10-5mol/L、10-6mol/L时,实验组大鼠睾丸间质细胞annexin 5 mRNA 分别升高了38.89%和35.29%,均具有统计学意义(P<0.05);当GnRHa的浓度为10-5mol/L时,3β-HSD mRNA也显著升高了46.43%(P<0.01).同样,与对照组相比,当GnRHant的浓度为10-6mol/L时,实验组大鼠睾丸间质细胞annexin 5 mRNA下降了45.45% (p<0.05),当GnRHant的浓度为10-6mol/L,10-7mol/L时,实验组大鼠睾丸间质细胞3β-HSD mRNA也分别显著地降低了63.64%(P<0.01)和50%(P<0.05),其余各组与对照组相比,差异无统计学意义. 结论:GnRH类似物能够调控大鼠睾丸间质细胞annexin5和3β-HSD mRNA表达,GnRH类似物可能与睾丸间质细胞上GnRH受体结合后,通过特定的生理机制,进而影响annexin5和3β-HSD mRNA表达,为揭示GnRH类似物调控间质细胞分泌睾酮的作用机制提供了一定的依据,其内在的机制还有待进一步研究.     

实验性糖尿病大鼠睾丸间质细胞功能和形态变化

目的：了解糖尿病对睾丸间质细胞（Ｌｅｙｄｉｇ细胞）功能和形态的影响．方法：用链脲佐菌诱导制成糖尿病大鼠模型，２个月后处死大鼠，测定血清睾酮及睾丸组织ｈＣＧ结合位点，并用光镜和电镜作了睾丸形态学观察。结果：糖尿病大鼠的血清睾酮水平及血睾丸组织的ｈＣＧ结合位点水平明显低于对照组（Ｐ〈０．０１）；糖尿病大鼠Ｌｅｙｄｉｇ细菌萎缩，内质网、线粒体等细胞器空泡样变。结论：糖尿病可使Ｌｅｙｄｉｇ细胞功能降低，结     

人肾上腺微血管内皮细胞的形态、表型和功能特性

目的 研究人肾上腺微血管内皮细胞的表型和功能特性。方法 用亚细胞克隆法分离和纯化人肾上腺微血管内皮细胞;流式细胞术检测内皮细胞标志血管性血友病因子（vWF）和CD31的表达、低密度脂蛋白的摄取和细胞的表型;扫描电子显微镜检查细胞表面的微绒毛和窗孔样结构;RT—PCR和免疫细胞化学法检测细胞内源性血管内皮细胞生长因子（VEGF）的表达,并比较各种不同器官微血管内皮细胞对肾上腺糖皮质激素诱导细胞毒的敏感性。结果 人肾上腺微血管内皮细胞表达经典内皮细胞标志vWF和CD31,并摄取低密度脂蛋白;同时表达α-1抗胰蛋白酶、肿瘤坏死因子受体（TNFR）p55和细胞间黏附分子-1。扫描电子显微镜显示细胞表面存在大量微绒毛和窗孔样结构。RT-PCR显示人肾上腺微血管内皮细胞高表达VEGF mRNA,免疫细胞化学法显示其细胞内高表达VEGF。对肾上腺皮质激素诱导的细胞毒性反应中,人脑微血管内皮细胞最敏感,人肺和肝窦内皮细胞次之,而人肾上腺微血管内皮细胞表现高度抵抗。结论 人肾上腺微血管内皮细胞是特殊分化的,具有不同于其他器官组织内皮细胞的表型和功能特性。     

脑死亡状态下巴马小型猪肝脏功能和形态的变化

目的:观察脑死亡状态下肝脏功能和形态的变化.方法:巴马小型猪10只,随机等分为脑死亡组和对照组.脑死亡组应用改进的缓慢间断颅内加压法建立脑死亡模型,通过呼吸、循环支持维持脑死亡状态24 h;对照组维持麻醉24 h,不建立脑死亡模型.分别测定脑死亡后3 h、6 h、12 h、18 h和24 h各组动物血清中ALT、AST水平,并与对照组相应时点比较.观察各时点肝脏组织学变化及超微结构变化.结果:脑死亡组12 h、18 h、24 h血清ALT、AST水平均高于对照组相应时点和脑死亡组前一时点(P均＜0.05).脑死亡组12 h可见肝细胞轻度浊肿,胞浆疏松化,12 h电镜发现肝细胞内出现轻微线粒体肿胀,24 h可见线粒体肿胀,嵴消失,甚至线粒体部分膜溶解、内质网扩张呈池状等改变.对照组光镜及电镜下未见明显的损伤性变化.结论:脑死亡状态导致肝脏出现功能和形态的损伤性变化,随着脑死亡维持时间的延长而加重.     

正常人脾脏树突状细胞的分布及形态学观察

目的 认识不同表面分子标记物所标记的脾脏树突状细胞(dendritic cell,DC)分布、成熟程度与超微结构特点.方法 运用光镜、电镜观察与免疫组化标记(CD11c、CD205、CD209、S-100、CD1a、HLA-DR、CDS0及CD86)方法观察35例正常人脾脏组织中的树突状细胞的形态分布及超微结构特点.结果 正常人脾脏树突状细胞主要分布在白髓边缘区和T细胞区,CD11c、CD205和CD209是目前较特异的树突状细胞标志物,标记阳性率分别为4.19%、3.96%和3.02%,其中CD209+DC分布更靠近红髓.树突状细胞表达共刺激分子CD80与CD86的阳性率分别为2.68%和2.02%,主要分布在T细胞区.树突状细胞超微结构特点为细胞体积较大,呈细长状或不规则形,表面可见数个突起向周围细胞间隙延伸;胞核形状不规则,表面有凹陷,可见核仁;胞浆致密或呈低电子密度,细胞器欠发达.结论 正常人脾脏中不同表面分子阳性树突状细胞的比率和分布有所不同,其中大部分为不成熟的树突状细胞,具有活性的成熟树突状细胞数目较少.     

高龄老年人外周血树突状细胞亚群及表面标志的分析

目的树突状细胞(dendritic cells,DC)在机体免疫应答的启动中起着至关重要的作用。文中主要探讨高龄老年人外周血DC亚群和表面标志的改变。方法应用流式细胞仪直接检测30例高龄老年人(≥80岁)外周血及30例普通老年人(60～70岁)外周血中DC的亚群(DC1和DC2)占白细胞总数的比值,进一步从高龄老年人外周血分离获得单核细胞,用人粒-巨噬细胞集落刺激因子(human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,hGM-CSF)和人白细胞介素-4(humaninterleukin-4,hIL-4)培养1周获得DC,并将普通老年人外周血培养得到的DC设为对照组,观察2组DC表面标志CD1a、HLA-DR、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD40、CCR-7和CD209的改变。结果高龄老年人组外周血DC1占白细胞总数的比值及DC1/DC2的比值均低于普通老年人组,前组培养获得的DC的CD1a的细胞阳性率明显较后组低,同样前组DC表达CD40、CD80、CD86、CD209分子的水平均低于后组。结论随着增龄,DC细胞亚群和其表面标志发生了一定的改变,提示这些改变可能参与了老年人免疫衰老的发病机制。     

衰老对雄性大鼠睾丸类固醇合成功能的影响

目的:研究老年SD大鼠睾丸类固醇急性调节蛋白(StAR)、17β-羟类固醇脱氢酶(17β-HSD)和芳香化酶(P450arom)的变化,探讨衰老对睾丸类固醇合成的影响.方法:用人绒毛膜促性腺激素(hCG)连续刺激青年和老年雄性SD大鼠,测定基础状态和hCG刺激后血清睾酮(T)和雌二醇(E2)水平,睾丸StAR mRNA、17β-HSDⅢ和P450arom mRNA的表达.结果:(1)基础状态和hCG刺激后,老年SD大鼠血清T水平、17β-HSDⅢmRNA的表达显著低于青年大鼠(P＜0.05,P＜0.01).老年SD大鼠StAR mRNA表达降低不明显.(2)老年大鼠血清E2/T水平升高(P＜0.01),但睾丸P450acrom mRNA表达没有明显变化.结论:衰老雄性大鼠睾丸17β-HSDⅢ的降低可能是睾酮合成减少的主要影响因素.     

老年全身炎症反应综合征患者肱动脉血管舒张功能的变化

目的 探讨血管内皮舒张功能在全身炎症反应综合征(SIRS) 老年患者中的变化.方法 选择82 例SIRS 老年患者,分为生存组(n=58) 和死亡组(n=24),同时选择22 例非SIRS 老年患者作为对照,分别检测肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)、血浆内皮素-1(ET-1) 和C 反应蛋白(CRP),并采用高分辨血管外超声法检测肱动脉介导的内皮依赖性血管舒张功能(FMD) 和硝酸甘油介导的内皮非依赖性血管舒张功能(NMD).结果 SIRS 组中TNF-α、IL-1、ET-1、CRP 明显升高,差异有统计学意义,在死亡组中,上述指标较生存组高(P<0.01),差异有统计学意义(P<0.05).SIRS 组FMD 较对照组显著降低(2.21±0.18 vs 2.80±0.21,P<0.01),且死亡组中FMD 较生存组降低.SIRS 组NMD 较对照组明显增加(P<0.01),但死亡组中NMD 较生存组下降(P<0.01).TNF-α、IL-1、ET-1、CRP 与内皮依赖性血管舒张功能呈负相关(P<0.01).结论 SIRS 患者血管内皮依赖性舒张功能(FMD) 明显受损,受损程度与病情严重程度相关.     

急性结肠炎大鼠肠运动功能和肌间神经丛形态学变化

目的：观察大鼠急性结肠炎症时,胃肠传输速率及其肌间神经丛形态学改变,探讨急性结肠炎大鼠肠动力障碍的机制。方法：20只大鼠分成对照组和急性结肠炎组,急性结肠炎组用乙酸灌肠制备急性结肠炎模型,第3天测定两组大鼠胃肠传输速率,并用酶组织化学方法观察结肠肌间神经丛内胆碱能和氮能神经的组织学改变。结果：急性结肠炎组大鼠胃肠传输速度明显减慢,肌间神经丛内胆碱能和氮能神经元的密度均明显降低（P〈0.05）。结论：急性结肠炎大鼠肌间神经丛内胆碱能和氮能神经元减少,可能是导致肠动力障碍的重要原因。