硫代磷酸反义寡脱氧核苷酸对乙型肝炎病毒细胞的影响

目的探讨硫代磷酸反义寡脱氧核苷酸对乙型肝炎病毒细胞的影响。方法设计合成HBV5个硫代反义寡聚核苷酸(S-as ODN)靶序列。应用ELISA方法、MTT比色法、观察S-as ODN对HBsAg、HBeAg抗原表达及Hep G22215细胞毒性的影响。结果不同靶位点的S-as ODN对HBsAg、HBeAg表达都有显著的抑制作用,在浓度为20μmol／L时,对细胞无明显杀伤作用。结论S-as ODN对Hep G22215的HBsAg、HBeAg的抑制作用为抗HBV治疗提供了新的途径。     

大剂量Bcl-2反义硫代磷酸寡核苷酸对细胞系的毒性作用

目的 探讨大剂量Ｂｃｌ－２反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸（ＡＳ－ＰＳ－ＯＤＮ,ＡＳＰＯ）对ＨＬ６０细胞系的毒性作用,同时了解毒性与剂量的关系。方法 应用四氮唑蓝比色法、台盼蓝拒染试验,ＣＦＵ－ＨＬ６０克隆培养法观察大剂量Ｂｃｌ－２ ＡＳＰＯ对ＨＬ６０细胞的毒性作用,同时应用免疫细胞化学染色及流式细胞仪检测Ｐ２６ Ｂｃｌ－２蛋白表达,吖啶橙染色及ＤＮＡ片段电泳对细胞凋亡的观察。并以其正义ＰＳＯＤＮ（ＳＰＯ     

ODC反义寡核苷酸对HL60细胞的生长抑制作用

目的：确定鸟氨酸脱羧酶（ＯＤＣ）反义寡核苷酸对ＨＬ６０细胞的抗增殖作用；探索该核苷酸是否有可能作为一种治疗癌症的潜化制剂。方法：采用自行设计人工合成的ＯＤＣ反义寡核苷酸，用ＭＴＴ法观察了其对ＨＬ６０细胞生长的影响，并以３Ｈ参入试验检测其ＲＮＡ及蛋白生物合成。结果：ＯＤＣ反义寡核苷酸可抑制ＨＬ６０细胞的增殖及ＲＮＡ、蛋白质的生物合成，并增强该细胞对抗肿瘤药物阿糖胞苷的敏感性。结论：应用反义技术控制ＯＤＣ表达将是抑制恶性细胞生长及增强肿瘤对化疗敏感性的１种可能途径。     

ino1反义寡核苷酸对结核分枝杆菌的抑制作用

目的选取合适的靶点，探讨利用反义技术抑制结核杆菌的新方法。方法选取分枝杆菌ino1基因为靶基因，设计并合成3段反义寡核苷酸，将不同浓度的反义寡核苷酸加入细菌的培养液中，观察ino1的mRNA表达情况，结核杆菌分枝硫醇的水平以及结核杆菌的生长情况。结果当反义寡核苷酸的浓度达到20μmol/L时，可以特异性地抑制ino1的表达，此浓度水平时ino1 mRNA的量和对照组的比值为0.67，40μmol/L时的比值则为0.45。分枝硫醇的合成以及分枝杆菌的生长也相应地受到抑制。反义寡核苷酸的浓度为20μmol/L时，分枝杆菌浓度的对数值下降1.3，40μmol/L时下降1.7。结论利用反义技术抑制分枝杆菌是完全可行的，并且ino1可以作为反义寡核苷酸的靶基因。     

反义寡核苷酸对脑胶质瘤细胞生长抑制作用的动态研究

OBJECTIVE: To examine the therapeutic effect of oncogene c-myb antisense oligodeoxynucleotide (AON) on rat C6 glioma in vivo. METHODS: C6 glioma cells were implanted into the subcutis of nude mice, the animals were randomly divided into three groups (12 mice respectively) when the tumor grew about 10 mm in size, and the mice with subcutaneous tumor foci were treated with sense oligodeoxynucleotide (SON), AON and normal saline. Three animals of each group were killed after treatment at 4, 8, 12 and 16 days respectively. The dynamic growth manifestations, features, histopathological changes and apoptosis of the glioma in each group were observed. RESULTS: AON suppressed the growth of C6 glioma cells, the suppression rates being 66.7%, 71.4%, 72% and 73% at 4, 8, 12, 16 days respectively (P < 0.05). The changes in weight were concurrent with the variations of tumor volume, the tumor weight of AON groups was significantly decreased (P < 0.05). The immunohistochemical assay showed the expression of c-myb proto-oncogenes was significantly decreased in AON groups (P < 0.05). The flow cytometry analysis found the apoptosis cell percentage of AON groups to be 13.4%, 27.1%, 46.1% and 48.4% at 4, 8, 12 and 16 days respectively, and this percentage of AON groups was about 3.5 times the apoptosis cell percentage of SON and control groups at the corresponding time. In addition, noticeable inflammatory infiltration and calcification were observed after the treatment with AON. CONCLUSION: The above findings indicate that c-myb gene might be associated with the suppression of carcinogenesis in brain glioma, and oncogene c-myb might be chosen as a target for antisense gene therapy of gliomas.     

反义寡核苷酸对肝癌细胞生长抑制作用的研究

目的：探讨互补于HBV X基因的翻译起始区（as-Xp)、ENⅡ（as-ENⅡ）区的反义寡核苷酸抑制HepG2.2.15细胞生长及抗病毒作用。方法：合成as-Xp、as-ENⅡ，体外作用于HBV DNA转染的HepG2.2.15利用，利用ELISA法检测反义核酸作用前后细胞上清中HBsAg和HBeAg的含量，以HepG2.2.15细胞接种裸鼠制备人肝癌模型，瘤内给予反义寡核苷酸100μg，连续给药5d，取瘤组织采用流式细胞仪（FCM）分析反义核酸诱导瘤细胞凋亡作用，并检测反义核酸作用裸鼠血清中病毒抗原表达情况。结果：as-Xp、as-ENⅡ作用72h的细胞凋亡峰值分别为24％和27．7％，对照为10．89％、7．92％；对荷瘤鼠体内HBsAg和HBeAg的抑制率分别为35％、34％和43％、49％，在体外分别为57％、52％和56％、56％。无关对照序列体内，外无明显的抑制瘤细胞生长和抗病毒作用。结论：as-Xp、as-ENⅡ体内应用可诱导瘤细胞凋亡，并可有效抑制体内，外HBV抗原表达。     

MAPK反义寡核苷酸对K562细胞系的增殖抑制作用

目的 :探讨MAPK在慢性髓细胞白血病 (CML)信号转导中的作用及其作用机制 .方法 :用脂质体转染法将MAPKASO导入K5 6 2细胞中 ,通过集落形成、DNA合成、蛋白质含量和MAPK活性的变化检测MAPKASO对K5 6 2细胞的作用 .结果 :MAPKASO可明显抑制细胞集落形成、DNA合成、蛋白质含量和MAPK活性 ,其抑制率分别为 4 6 .1% ,5 7.1% ,4 3.2 %和 6 2 .0 % ,与对照组比较有显著差异 (P <0 .0 5 ) .结论 :MAPK在CML信号转导中起重要作用 ,极有可能成为CML治疗的新靶点     

5‘—荧光素标记的ReLA反义脱氧寡核苷酸在人白血病细胞HL—60中的分布及稳定性

目的 比较修饰型及未修饰型ReLA反义脱氧寡核苷酸（AS-ODN）在人白血病细胞HL-60中的分布及稳定性。方法 将荧光素（FAM）标记的硫代磷酸酯修饰及未修饰型AS-ODN经脂质体介异工直接转染入HL-60细胞，应用荧光显微镜及流式细胞仪观察细胞内荧光的时相分布。结果 发现1μmol/L修饰型AS-ODN进入细胞后，细胞内荧光强度6h达到高峰。在有脂质体存在时，细胞内荧光明显增强，12h后荧光减弱并逐渐消失。而AS-ODN直接转染细胞，细胞内特别是核内荧光强度明显比脂质体组弱。未修饰型AS-ODN直接或经脂质体介导转染，细胞内荧光强度均很弱，滞留时间不超过4h。结论 脂质体可以提高细胞对AS-ODN的摄取及核聚积，而硫代磷酸酯修饰型AS-ODN具有更好的稳定性。     

硫代反义寡脱氧核苷酸在树体内对HDV复制与表达的抑制作用

目的：在树（Ｔｕｐａｉａ）体内观察硫代反义寡脱氧核苷酸（Ｓ－ＡＳＯＤＮ）对ＨＤＶ复制、表达的抑制作用。方法：树同时接种ＨＢＶ阳性血清０．１ｍｌ、ＨＤＶ阳性血清０．３ｍｌ后，将１６只ＨＤＶ／ＨＢＶ感染成功的树随机分为两组，给药组８只树按每只每次经尾静脉注射Ｓ－ＡＳＯＤＮ３ｍｇ，隔日１次，共７次。对照组中２只注射等量生理盐水，另６只不作处理。注射后５、１０、１５、２５ｄ取血及肝组织采用免疫组化、斑点杂交及原位杂交法检测ＨＤＶＡｇ及ＨＤＶＲＮＡ。结果：于注射结束时（１５ｄ）给药组有７只树肝内ＨＤＶＡｇ及ＨＤＶＲ－ＮＡ转为阴性，对照组８只树中仅１只转为阴性。停止使用Ｓ－ＡＳＯＤＮ１０ｄ后，给药组２只阴转树肝内又可检出ＨＤＶＡｇ和ＨＤＶＲＮＡ，对照组仍有７只可检出。结论：Ｓ－ＡＳＯＤＮ在树体内能有效抑制ＨＤＶ复制及表达，但作用并不完全，可能与用药剂量不足，时间不够长及仅用硫代修饰尚不能直接导向靶基因有关     

全硫代反义寡核苷酸抑制人膀胱癌Ej细胞活性的实验研究

目的研究全硫代反义寡核苷酸(PS-ASODN)对人膀胱癌细胞Ej端粒酶活性及细胞生长的影响,探讨PS-ASODN在膀胱癌治疗中的价值,为临床治疗膀胱癌提供理论依据。方法将PS-ASODN转染作用于人膀胱癌细胞Ej中,分别采用MTT法、流式细胞术、酶联免疫吸附(ELISA)法检测不同浓度PS-ASODN对人膀胱癌细胞Ej的细胞增殖、细胞凋亡和端粒酶活性的作用。结果PS-ASODN作用于人膀胱癌细胞Ej后能显著抑制人膀胱癌细胞Ej的端粒酶活性,抑制癌细胞生长增殖,促进细胞凋亡,而且呈现时间特异性和剂量依赖性,与SODN转染组及空白对照组进行比较,差异显著(P<0.05或0.01)。结论PS-ASODN能抑制人膀胱癌细胞Ej的生长,降低其端粒酶活性并诱导细胞凋亡;抑制端粒酶活性可能成为膀胱癌基因治疗的新靶点。     

反义硫代寡聚核苷酸对抗日本脑炎病毒的活性

目的：针对日本脑炎病毒ＳＡ－１４株病毒基因组５’端第一个ＡＵＧ起始码前后和非结构蛋白ＮＳ５的５’端基因区设计并合成了两个硫代的反义寡聚核苷酸（二十聚），观察了它们对病毒在ＢＨＫ－２１细胞中复制的影响。方法：以定量病毒攻击ＢＨＫ－２１细胞，分别测定ＣＰＥ，病毒蛋白质表达及病毒空斑形成抑制率，观察不同浓度的反义核酸在不同时间对病毒复制的作用。结果：细胞培养液中含有１．０μｍｏｌ／Ｌ即可明显推迟ＣＰＥ的     

高致病性禽流感通用和H5亚型荧光定量PCR方法的建立

目的:建立高致病性禽流感H5亚型荧光定量PCR方法.方法:根据禽流感病毒(AIV)M基因和H5-HA基因分别设计AIV通用和H5亚型特异荧光定量PCR引物和探针,优化反应体系和反应条件,分析该试剂的敏感性、特异性、重复性等.结果:经优化反应体系和反应条件后,AIV通用试剂和AIV-H5试剂的敏感性达到1×101.25EID50水平;与细胞培养比较,AIV-H5试剂Kappa吻合系数κ为0.991(P<0.01),统计学显示两种检测结果的吻合度很强;批内和批间精密度CT值的CV值均远小于10%,可重复性良好.结论:本项目研制的AIV通用试剂和AIV-H5试剂的敏感性、特异性、重复性均好,适合在禽流感疫情和疑似H5禽流感病例中检测使用.     

金刚烷胺修饰物抗禽流感病毒的作用机制

目的：初步探讨金刚烷胺修饰物（NAM）抗禽流感病毒的作用机制,为抗禽流感病毒新药NAM的开发提供实验依据。方法：对狗肾细胞（MDCK）进行体外培养,分为正常对照组,病毒对照组和受试物组。①采用细胞病变法结合MTT法检测NAM对禽流感病毒（H5N1）的抑制作用,受试物组分为先加入NAM后感染病毒、先感染病毒后加入NAM和感染病毒的同时加入NAM,观察3种方式NAM对禽流感病毒的半数抑制浓度(IC50)和治疗指数(TI);②采用神经氨酸酶抑制实验检测NAM对神经氨酸酶的活性影响。结果：① 3种不同的实验方式NAM剂量对数与细胞保护率均呈正相关关系（r 分别为0.95、0.95和0.99,P均<0.05）,且NAM与保护率存在量效依赖关系。先加入NAM后感染病毒,NAM的IC50为15.32 mg·L-1,TI为103.31;先感染病毒后加入NAM,NAM的IC50为30.78 mg·L-1,TI为28.10;感染病毒的同时加入NAM,NAM的IC50为203.92 mg·L^-1,TI为4.24。②NAM具有一定的流感病毒神经氨酸酶抑制活性,其IC50为87.36 mg·L^-1。结论：NAM对穿入细胞后的禽流感病毒有较好的抑制作用,同时干扰病毒吸附和侵入细胞的脱壳过程也有一定的作用,能够在一定程度上抑制病毒的神经氨酸酶活性。     

反义IGF-IR基因片段诱导胶质瘤细胞凋亡的流式细胞术分析

目的　利用流式细胞仪 (flowcytometry ,FCM)探讨反义IGF IR基因片段诱导胶质瘤细胞凋亡的作用。方法　根据IGF IRcDNA序列设计其正义、反义基因片段 ,并对部分碱基进行硫代磷酸修饰。实验分为空白对照组、正义核酸组和反义核酸组 ,应用流式细胞技术检测DNA含量 ,根据DNA直方图分析凋亡细胞情况。应用透射电镜观察了凋亡细胞的形态学变化。结果　经反义寡核苷酸 5、10、15、2 0μmol·L-1处理的胶质瘤细胞其凋亡率分别为 16 0 6 %±3 86 %、2 4 5 2 %± 4 84%、36 6 9%± 5 5 3%和 43 85 %±5 72 % ,而用正义寡核苷酸 5、10、15、2 0 μmol·L-1处理的胶质瘤细胞其凋亡率分别为 3 76 %± 1 2 2 %、3 14%±1 15 %、2 5 1%± 0 93%和 3 2 6 %± 1 15 % ,空白对照组(野生型 )自然凋亡率为 1 0 1%± 0 89%。反义核酸组与对照组相比有显著性差异 (P <0 0 5 ) ,而正义核酸组与空白对照组无明显差异 (P >0 0 5 )。凋亡细胞形态上表现为细胞体积缩小 ,染色质凝聚 ,并聚集于核膜下成新月状或块状 ,胞膜内馅形成膜包裹的核碎片或细胞器 ,最后出泡形成凋亡小体。结论　反义IGF IR基因片段诱导胶质瘤细胞凋亡是其抑制细胞增殖机制之一。通过FCM分析可较准确地判定肿瘤细胞凋亡情况     

金刚烷胺修饰物对禽流感（H5N1）病毒的抑制作用

目的：寻找高效低毒的抗禽流感病毒药物。方法：体外实验选用狗肾细胞（MDCK）,实验分为正常对照组、病毒对照组和受试化合物组,采用细胞病变法结合MTT法检测金刚烷胺修饰物（NAM）对MDCK细胞的半数中毒浓度、对禽流感病毒的半数抑制浓度和治疗指数;体内实验采用NAM对禽流感病毒H₅N₁亚型小鼠感染模型的治疗实验,检测小鼠的死亡率、存活率、死亡保护率和延长生命率。结果：体外实验,NAM对MDCK细胞的最大无毒浓度为235.09 mg•L^-1,半数致死浓度为1582.78 mg•L^-1,NAM对禽流感病毒半数抑制浓度（IC₅₀）为15.32 mg•L^-1,治疗指数（TI,103.31)高于金刚烷胺对照组(TI,48.48);体内实验,NAM 100 mg•kg^-1剂量组对H₅N₁感染小鼠的死亡率（12.5%）明显低于病毒对照组小鼠死亡率(87.5%)（P<0.05）,平均生存日数（13.38 d）明显高于病毒对照组平均生存日数（9.63 d）（P<0.05）,肺炎抑制率（99.15%）和生命延长率（26.79%）均高于金刚烷胺对照组肺炎抑制率（69.18%）和生命延长率（13.39%）(P<0.05)。结论：NAM体外毒性和抗病毒活性均优于阳性对照金刚烷胺;体内抗病毒活性较好,可显著降低禽流感病毒感染小鼠的死亡率、提高平均生存日数和延长生命率。     

禽流感H5N1型病毒对NIH小鼠的致病敏感性研究

目的观察禽流感H5N1型病毒对NIH小鼠的致病性。方法将NIH小鼠随机分为接毒组(20只)和对照组(10只),在负压感染实验室,接毒组于乙醚麻醉后给予AIVH5N1型病毒滴鼻,对照组予正常阴性尿囊液滴鼻,观察14d,记录小鼠的体温、体重、临床症状、死亡情况、病理变化、肺指数及抗体变化。结果 NIH小鼠感染禽流感H5N1型病毒后第1天就出现精神不振,病程主要集中在第3～7天,临床症状主要表现为弓背、蜷缩、竖毛、颤抖、反应迟钝、活动减少、爱扎堆,体重(下降)出现减轻,体温降低,死亡率为40%;接毒组死亡小鼠肺指数为(2.21±0.40),较对照组的(0.44±0.23)明显增高,差异有统计学意义(P<0.01);肺组织病理严重改变,第8天才能检出抗体(OD值等于0.231)。结论禽流感H5N1型病毒对NIH小鼠有一定的致病性。     

不同职业暴露人群感染H5N1禽流感病毒风险性分析

目的了解长沙地区不同类型禽类职业暴露人群高致病性禽流感H5N1亚型病毒的抗体分布状况,分析不同职业暴露人群H5N1感染的风险性。方法采集菜市场家禽屠宰零售人员、大型家禽饲养企业工人和农村个体家禽散养人员的血清标本,用单放射免疫扩散溶血技术（SRH）检测H5N1抗体。结果市场零售人员、农村个体家禽散养人员、企业饲养人员H5N1感染率分别为25%、1%和1.92%,男性从业人员H5N1抗体阳性率为10%,女性为23.88%。结论市场零售人员感染H5N1风险性远高于农村散养人员和企业饲养人员,不同职业人员中女性H5N1抗体阳性率高于男性从业人员。