用囊胚内细胞团建立小鼠胚胎干细胞系的尝试

目的建立小鼠129品系胚胎干细胞(ES)系。方法分离囊胚内细胞团接种至小鼠胚胎成纤维细胞,培养、传代以获得细胞系,通过形态观察、碱性磷酸酶检查、体内外分化实验予以鉴定。结果共获取12个囊胚,培养后有9个内细胞团增殖,消化传代,分离出2株克隆;形态观察具有明显的ES细胞形态,染色体核型检查为XY,碱性磷酸酶检查细胞呈阳性,体外分化实验表明可自发分化为外、中和内胚层细胞,体内分化实验获得典型的畸胎瘤,并具备小鼠特异性表面标志物Oct-4、SSEA-1。结论应用本方法建立了两株129品系胚胎干细胞系,并证实其符合小鼠胚胎干细胞的特征。     

人胚胎干细胞系NJGLLhES1的建立

目的:使用人类冷冻胚胎建立新的人胚胎干细胞系。方法:将人类冷冻胚胎解冻后培养至囊胚,用免疫外科法分离内细胞团,以ICR小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,机械法传代。将此细胞系命名为NJGLLhES1,检测其核型,对其碱性磷酸酶和特异性标记物(Oct-4,SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81)进行鉴定,并进行类胚体形成实验及畸胎瘤成瘤实验,对其体内外分化能力进行检测。结果:NJGLLhES1已在体外培养逾1年时间。细胞呈人胚胎干细胞克隆样,具正常人类核型,碱性磷酸酶和胚胎特异性标记物的表达为阳性,可形成类胚体和畸胎瘤。结论:成功建立人胚胎干细胞系NJGLLhES1,此细胞系具人胚胎干细胞形态特征,可长期稳定增殖且保持不分化状态,核型正常,在体内外具有多向分化潜能。     

人胚胎干细胞建系及体外诱导分化的研究进展

人胚胎干细胞源自囊胚内细胞团 (innercellmass,ICM ) ,能无限增殖并保持未分化状态 (保持完整的、正常的染色体核型 )的细胞。它可分化为来源于 3个胚层的多种细胞。这种特性在世界范围内掀起了对人胚胎干细胞的研究热潮 ,并取得了飞速发展。本文就人胚胎干细胞建系及体外培养分化的研究进展作一综述。     

小鼠孤雌胚胎干细胞系的建立

目的利用化学激活的技术,建立小鼠孤雌胚胎干细胞系。方法用钙离子载体A23187和6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）处理小鼠卵母细胞,待囊胚形成后,分离内细胞团,细胞传代、扩增。待传至37代时,核型检测查染色体,用微卫星技术进行纯合性鉴定,用免疫荧光技术检测胚胎干细胞表面标记Oct-4、SSEA-1及SSEA-4的表达情况,并用畸胎瘤试验检测其多向分化能力。结果该细胞株为孤雌来源,表现为正常二倍体核型,表达ALK,表面标志物Oct-4、SSEA-1阳性,SSEA-4阴性。体内注射后,在局部形成含三个胚层组织的畸胎瘤。结论通过钙离子载体A23187和6-DMAP化学激活小鼠卵母细胞,可以得到具有胚胎干细胞特性的细胞株。     

胚胎干细胞定向分化为肝脏细胞的研究进展

胚胎干细胞可由哺乳动物的囊胚内细胞群或着床后胚胎组织生殖嵴的原始生殖细胞中分离获得,也可以由核移植克隆技术获得;胚胎干细胞向肝脏细胞的定向分化使其可能成为肝脏细胞移植的一个重要细胞来源,为肝脏疾病的细胞移植治疗奠定基础,在治疗肝脏疾病的研究领域中有着广阔的应用前景.     

胚胎干细胞定向分化为肝脏细胞的研究进展

胚胎干细胞可由哺乳动物的囊胚内细胞群或着床后胚胎组织生殖嵴的原始生殖细胞中分离获得,也可以由核移植克隆技术获得;胚胎干细胞向肝脏细胞的定向分化使其可能成为肝脏细胞移植的一个重要细胞来源,为肝脏疾病的细胞移植治疗奠定基础,在治疗肝脏疾病的研究领域中有着广阔的应用前景。     

利用胚胎实时观测技术预测早期胚胎的发育潜能

目的探讨利用胚胎实时观测技术(Time-lapse)预测早期胚胎的发育结局的有效性。方法回顾性分析本中心2016年7月至2017年6月101例IVF Time-lapse周期,532枚行囊胚培养胚胎的早期发育时间点及胚胎发育的异常分裂行为。根据发育速度和发育质量分为三组:A组(D3细胞数≥6,且碎片≤20%的胚胎,共385枚)、B组(D3细胞数≥6,且碎片20%的胚胎,共57枚)、C组(D3细胞数6的胚胎,共90枚)。结果 (1)在A组,可用囊胚的2细胞至3细胞的持续时间(cc2)、3细胞至5细胞的持续时间(cc3)和发育至5细胞的时间(t5)显著高于废弃胚胎(P均0.05),而3细胞至4细胞的持续时间(s2)、5细胞至8细胞的持续时间(s3)、发育至2细胞的时间(t2)、异常分裂(AC)和逆分裂(RC)显著低于废弃胚胎(P均0.05),其余指标在可用囊胚与废弃胚胎间无显著性差异(P均0.05);进一步,在可用囊胚中,优质囊胚的cc2、cc3、t5显著高于非优质囊胚(P均0.05),s2、s3、AC和RC显著低于非优质囊胚(P均0.05),其余指标在优质囊胚与非优质囊胚间无显著性差异(P均0.05)。(2)在B组,除cc2外,其余指标在可用囊胚与废弃胚胎之间均无显著性差异(P均0.05)。(3)在C组,所有指标在可用囊胚与废弃胚胎之间均无显著性差异(P均0.05)。结论利用Time-lapse技术可以预测6细胞以上碎片少的形态学优质D3胚胎的发育潜能;而对于细胞数少或碎片多的形态学非优质D3胚胎,需扩大样本进一步研究。     

高效诱导人胚胎干细胞分化为表达生殖功能调控相关基因的下丘脑神经细胞

目的优化体外诱导人胚胎干细胞向类下丘脑弓状核神经细胞分化方案、提高分化效率;明确分化神经细胞中是否表达生殖功能调控相关基因。方法利用接受辅助生殖技术治疗患者捐赠的冷冻胚胎建立人胚胎干细胞系CCRM14;饲养层上培养CCRM14,经纯化后消化为单细胞、诱导其向下丘脑神经细胞分化。分化策略:神经分化早期抑制转化生长因子β和骨形态发生蛋白信号通路;接着激活sonic hedgehog信号通路,促使下丘脑神经前体细胞生成;随后抑制Notch信号通路,添加脑源性神经营养因子诱导类下丘脑弓状核神经细胞的分化与成熟。分化不同时期采样,利用RT-qPCR、细胞免疫荧光、流式细胞术方法鉴定分化细胞。结果依据本优化分化方案,CCRM14分化为下丘脑神经前体细胞的效率达95%以上,分化的细胞表达下丘脑弓状核神经细胞特异性标志物POMC和NPY/AGRP,同时表达参与生殖功能调控基因KISS1和AR。结论该类分化细胞有作为细胞模型用于研究下丘脑弓状核在生殖相关疾病发生过程中调控机制的潜力。     

人类低质量卵裂期胚胎体外发育至囊胚能力的研究

目的探讨体外受精（IVF）治疗中D3低质量胚胎培养至囊胚的发育潜能，为囊胚的培养和冷冻提供依据。方法2010年6～12月进行IVF治疗的患者398例，D3移植后剩余的总胚胎数2，180枚。其中形态学较低质量胚胎1，546枚，采用序贯法微滴培养，D3～D6连续观察囊胚形成情况，比较不同细胞数、碎片含量不同的胚胎囊胚形成的比例。结果1，546枚低质量胚胎，于D5～D6形成426枚囊胚，囊胚形成率为27．56％。其中6Ⅲ、Ⅳ级为40．9％（318／778）；5Ⅰ、Ⅱ级为28．8％（30／104）；4Ⅰ、Ⅱ级为8．9％（16／180），4Ⅲ、Ⅳ级为19．7％（56／284）；2～3I、Ⅱ级为3．0％（6／200）。经统计学分析，碎片较多的胚胎中，卵裂球数目较多的胚胎，囊胚形成率较高。结论D3形态学较低质量胚胎仍有部分具有发育至囊胚的潜能，因此在D3时对这些胚胎继续进行培养至D6，可能减少胚胎的浪费并得到更好临床结局。     

人胚胎干细胞定向分化为血管内皮细胞的初步研究

目的诱导人胚胎干细胞定向分化为血管内皮细胞。方法将来源于人囊胚内细胞团的ES细胞,以含维甲酸的培养液经悬浮培养,先形成拟胚体,再将EB贴壁,换含TGF-β1的培养液继续培养,进行相差显微镜、免疫荧光、电镜等检测。结果人胚胎干细胞经诱导后分化成为血管样结构,Ⅷ因子免疫荧光检测呈阳性,Dil-Ac-LDL摄取实验呈红色荧光,透射电镜显示其与正常的人毛细血管非常相似。结论该方法可诱导人胚胎干细胞分化为内皮细胞,为骨创伤修复提供新的思路和手段。     

BALB/c小鼠精原干细胞体外长期培养和鉴定

目的:建立小鼠精原干细胞长期培养体系,探讨精原干细胞体外增殖分化的关键因子。方法:收集出生4~6 d BALB/c绿色荧光小鼠睾丸,采用改良的两步消化法获得细胞悬液,种植到铺有明胶的培养皿中,分别于种植后1、5、24 h通过差速贴壁法去除体细胞,获得高度纯化的精原干细胞,种植到丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养。基础培养液为StemPro-34SFM干细胞培养液并补充15种添加成分;添加20 ng/ml大鼠胶质细胞源神经营养因子(GDNF)、10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和200 ng/ml DDNF受体α1(GFRα1)促进精原干细胞增殖。分别采用免疫荧光染色和RT-PCR检测精原干细胞已知抗原和标志性基因的表达。结果:饲养层上培养3~4 d后精原干细胞增殖形成典型的克隆,为边缘不清楚的团块状;小鼠精原干细胞能在该培养体系中稳定传代培养达3个月。免疫荧光共聚焦显微镜观察示Oct-4特异性表达在培养的精原干细胞核上;而GFRα1显著表达在培养的精原干细胞膜表面;RT-PCR也证实培养的精原干细胞表达Oct-4、GFRα1、Sox2和c-Ret等象征未分化精原细胞的标志基因。结论:BALB/c小鼠精原干细胞可在体外长期培养(3个月),该培养体系的建立将为研究精原干细胞增殖分化调控机制及精原干细胞移植治疗男性不育奠定基础。     

干扰素-γ对大鼠胚胎神经干细胞发育的影响

目的探讨感染后细胞因子干扰素（IFN）-γ对胎鼠神经系统发育的影响。方法利用不同浓度IFN-γ（0、20、200、2,000U／ml）对大鼠体外培养的胚胎16d的神经干细胞进行刺激,观察神经干细胞生长状态、主要组织相容性复合体（MHC）表达和分化格局的变化。结果高浓度的IFN-γ（2,000U／ml）对神经干细胞具有毒性作用。中等浓度的IFN-γ（200u／ml）能够显著上调神经干细胞MHc—Ⅰ类和Ⅱ类分子的表达。同时,中等浓度的IFN-γ能够促进神经干细胞的分化,使得神经干细胞向神经元和少突胶质细胞分化增加,而向星形胶质细胞的分化降低。结论大剂量IFN-γ可改变神经干细胞的生长和分化状态,IFN-γ除了对胎儿神经系统具有直接毒性外,还可能通过影响MHC的表达引起母体对胎儿的排斥,也许对新生儿智力发育造成不利影响。     

汗腺样细胞经冻存复苏后再生汗腺功能的研究

目的:研究由人脐带间充质干细胞(UCMSCs)分化而来的汗腺样细胞在冻存与复苏后的生物学活性与促汗腺再生能力.方法:分离培养人UCMSCs 和人汗腺细胞,通过两种细胞共培养方式促进UCMSCs向汗腺细胞分化.分化后的干细胞经冻存、复苏处理后,局部移植于裸鼠烫伤脚掌,通过组织学观察和发汗试验观察汗腺组织再生修复情况.结果...     

玻璃化冻融胚胎移植323个周期临床分析

目的探讨辅助生殖技术中影响玻璃化冻融胚胎移植结局的相关因素。方法对304例共323个周期的相关资料进行回顾性统计学分析,根据患者年龄、胚胎发育时期、移植日子宫内膜厚度、移植过程是否顺利和解冻后胚胎复苏程度进行分组,比较各类分组的胚胎种植率和临床妊娠率。结果受精第2天冷冻者与受精第3天冷冻者的胚胎种植率和临床妊娠率差异无统计学意义（P〉0．05）;子宫内膜厚度和移植过程是否顺利组间胚胎种植率及临床妊娠率均无显著性差异（P〉0．05）;不同年龄和冷冻胚胎复苏程度对胚胎种植率和临床妊娠率有显著影响（P〈0．05）。结论在冻融胚胎移植周期,患者年龄和解冻后胚胎质量对妊娠的成功率起主要作用,准备适宜的子宫内膜厚度能提高临床妊娠率。     

低评分胚胎体外继续培养的临床价值

目的探讨对形态学评分较低的胚胎进行体外继续培养的临床价值。方法对低评分胚胎体外继续培养的104个IVF-ET／ICSI周期患者的临床资料进行回顾性分析,观察继续培养后获得冷冻胚胎的个数及这些冷冻胚胎冻融后移植的临床妊娠率。结果104个IVF—ET／ICSI周期取卵后第三天（D3）低评分胚胎经体外继续培养有32个周期获得冷冻胚胎,冷冻胚胎拥有率30．76％,共培养了606枚低评分胚胎,获87枚冷冻胚胎,冷冻胚胎获得率14．36％（87／606）。23个冻融胚胎移植周期中有3例临床妊娠;103例累计妊娠24例,累计妊娠率23．3％。结论继续培养能有效筛选出具有继续发育潜能的低评分胚胎,提高了胚胎的利用率和累计妊娠率,具有一定的临床价值。     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染对鼠胎肝干细胞培养的优化作用

：目的 观察以重组腺相关病毒（rAAV）为载体介导碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）基因转染对体外培养的鼠胎肝干细胞增殖及细胞周期的影响.方法 体外培养鼠胎肝干细胞,经rAAV作为载体介导bFGF基因转染,分为对照组、空载病毒转染组和bFGF转染组.用逆转录PCR和蛋白质印迹法检测鼠胎肝干细胞转染前、后bFGF基因和蛋白的表达.应用细胞生长曲线和CCK-8法观察细胞生长速度;采用流式细胞术测定细胞周期分布的变化.结果 转染bFGF后,bFGF转染组与对照组、空载病毒转染组相比,bFGF基因和蛋白水平均有表达,细胞的生长速度增快（q=20.43,P=0.001;q=26.52,P=0.001）,G0/G1期细胞减少,S期细胞增多（q=72.56,P=0.000;q=32.28,P=0.001）.结论 通过rAAV作为载体介导bFGF基因转染能促进体外培养的鼠胎肝干细胞增殖,对其培养有优化作用.     

激光削薄透明带对小鼠囊胚形成和孵出的影响

目的探索激光削薄透明带对体外培养昆明小鼠囊胚形成和孵出的影响。方法激光孵化组为应用1．48μm二极管激光对186枚2细胞期昆明小白鼠胚胎实施透明带削薄处理;对照组不削薄透明带,在离胚胎一个直径处发射激光。比较两组囊胚形成率、孵出率、完全孵出率、透明带厚度和胚胎直径。结果激光组和对照组的囊胚形成率分别为73．7％（137／186）和71．6％（53／74）,两组比较差异无统计学意义。激光组的孵出率（86．9％,119／137）明显高于对照组（71．7％,38／53,P〈0．05）;囊胚嵌顿率（74．8％,89／119）明显高于对照组（23．1％,9／38,P〈0．001）。结论激光辅助孵化对体外培养昆明小鼠囊胚形成无不良影响且可以提高囊胚孵出率,但囊胚嵌顿率显著升高。