恶性疟原虫AMA-1(Ⅲ)重组蛋白的免疫效应检测

目的探讨恶性疟原虫AMA-1(Ⅲ)重组蛋白的免疫活性。方法利用毕赤酵母高效表达系统分泌表达AMA-1(Ⅲ),表达产物用纯化后免疫新西兰兔,检测其血清中IgG滴度的变化,观察重组AMA-1(Ⅲ)免疫效应。结果重组AMA-1(Ⅲ)免疫后,ELISA检测新西兰兔血清中IgG滴度发现在3次免疫后OD490值明显高于佐剂免疫对照组(P<0.01)。结论AMA-1(Ⅲ)重组蛋白具有较好的免疫原性。     

疟原虫抗原的免疫抑制效应分析

本文报道伯瓦疟原虫分离、提纯的四种抗原具免疫抑制效应。应用单克隆抗体免疫荧光试验检测结果，四种不同方法处理的疟原虫抗原可造成小鼠脾ＤＣ４Ｔ细胞和Ｂ细胞阳性百分数下降，ＣＤ８Ｔ细胞百分数明显升高。结果表明，四种抗原中具有免疫抑制性抗原组分，通过诱导、激活ＣＤ８Ｔ细胞而对宿主的免疫应答起下调作用。四种抗原中，抗原提纯度高，免疫抑制效应随之增强。     

一种简便高效制备伯氏疟原虫蛋白的实验方法

目的：探讨建立简便有效的大量制备鼠伯氏疟原虫蛋白的方法.方法：采集伯氏疟原虫感染晚期的大鼠外周血经肝素抗凝,通过白细胞滤器过滤去除白细胞,再使用30%阿拉伯胶溶液经密度梯度离心法分离含虫红细胞,经皂素溶血,收集纯化的原虫,虫体经超声波破碎后离心,上清液经SDS-PAGE电泳分析.采用蛋白凝胶灰度扫描方法分析蛋白电泳条带的分布.结果：从大鼠含虫外周血可分离制备出大量的可溶性疟原虫蛋白,对大鼠分离的疟原虫可溶性蛋白与小鼠来源的原虫可溶性蛋白比较,两种蛋白的电泳图谱完全相同.结论：利用大鼠模型可简便高效地制备大鼠伯氏疟原虫,结合超声波破碎法可提取足量的可溶性疟原虫蛋白抗原.     

转基因伯氏疟原虫的建立及报告基因表达的初步研究

目的:通过转染含有绿色荧光蛋白(GFP)和PbfMSP1片段的重组质粒,建立伯氏疟原虫转染技术和表达恶性疟原虫MSP-1 19 000片段(PfMSP1-19)的转基因伯氏疟原虫.方法:构建重组转染质粒PyrFlu/PbfMSP1.伯氏疟原虫ANKA株经培养和分离后用电转化方法转入重组转染质粒,药物筛选转化原虫后进行PCR检测,并于荧光显微镜下检测报告基因GFP的表达.结果:构建了重组转染质粒PyrFlu/PbfMSP1.荧光显微镜下观察到呈绿色荧光的伯氏疟原虫.PCR检测显示转染伯氏疟原虫存在GFP和PbfMSP1基因.结论:重组质粒已成功转染伯氏疟原虫并表达了GFP报告基因,建立了伯氏疟原虫转染技术.     

低温保存伯氏疟原虫影响因素的观察

红内期伯氏疟原虫用甘油和二甲基亚砜作为保护剂液氮内保存。以复苏后出血感染小白鼠后虫血症最早出现的时间为指标,对其冷冻速度、不同的保存时间、复苏后感染动物的方式以及5%、10%甘油和10%二甲基亚砜三种保护剂的保存效果进行了观察。结果表明,一步法和二步法冷冻两者不显示明显的差异;疟原虫冷冻53周与冷冻一周的保存效果一致;复苏后虫血直接注射于小白鼠优于经洗涤后注射;50%、10%甘油和10%二甲基亚砜均可做为伯氏疟原虫的冷冻保护剂,而以5%甘油为优。     

恶性疟原虫海南株丝氨酸重复抗原部分基因序列分析

该文采用ＰＣＲ方法特异性扩增恶性原虫海南株（ＦＣＣ－１／ＨＮ）ＳＥＲＡ基因片段,并将该基因片克隆于Ｍ１３噬菌体,用双脱氧链末端终止法进行测序,ＰＣＧＥＮＥ软件对该基因序列进行了分析,结果显示该基因片段长度为４５３ｂｐ,Ａ＋Ｔ／Ｇ＋Ｃ为２．６：１,符合恶性瓶原虫结构基因的特点。同源性分析显示在不同虫株间高度保守,我国ＦＣＣ－１／ＨＮ虫株ＳＥＲＡ与Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３（巴西）株及Ｓ１６（塞内加尔）株仅一个     

恶性疟原虫Pf332基因片段的克隆及表达

[目的]构建含恶性疟原虫Pf332抗原基因片段的重组质粒，并检测在大肠杆菌BL21/DE3中的表达情况。[方法]应用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNAS中扩增Pf332基因（Pf332)片段，P332-R0、P332-R2，并分别插入pGEX4T-1原核表达载体，阳性克隆的重组质粒DNA经酶切及PCR扩增鉴定，用DNAstar软件对FCC1/HN株与3D7株Pf332和P332-R1、P332-R2片段进行同源性比较，由IPTG诱导在大肠杆菌BL21/DE3中表达重组蛋白。[结果]PCR扩增得到特异的FCC1/HN株Pf332片段，P332-R0、P332-R1、P332-R2，大小分别为489，429和393bp。酶切及PCR鉴定获得了正确的pGEX-P332-R0,pGEX-P332-R1,pGEX-P332-R2重组质粒，序列分析结果显示，与3D7株相比，FCC1/HN株P332-R1、P332-R2片段编码多肽分别缺少2、4个相应的重复单元，在大肠杆菌BL21/DE3中表达出3个重组蛋白，相对分子质量分别为46、44和42。[结论]扩增、克隆了恶性疟原虫Pf332片段，P332-R0、P332-R1、P332-R2，并在大肠杆菌BL21/DE3中成功表达，FCCl/HN株与3D7株的P332-R1、P332-R2片段编码多肽所包含的重复单元数目不同。     

抗氯喹伯氏疟原虫特异性标记蛋白的初步研究

按Rowell等的方法,将氯喹相似物[7-(2-氨基乙基)-4-(4-二乙氨基-1-甲基丁氨基)喹啉1联结于牛血清白蛋白上。参照Boose改良法将此牛血清白蛋白-氯喹结合物再联结于CF-11纤维素粉上。此纤维素即为以氯喹基本化学结构作为特异性吸附基团的吸附剂。将此吸附剂加入感染抗氯喹伯氏疟原虫(Plasmodium berghei ANKA株抗氯喹系)小鼠血清叶中,在4℃搅拌过夜,生理盐水洗涤4次后用甘氨酸-HCl缓冲液解脱。经磷酸缓冲液透析及聚乙二醇浓缩后备用。 粗提液经PAGE电泳、考马斯亮蓝染色后呈现4条蛋白染色带。免疫电泳显示,用这种粗提液免疫家兔所制备的抗血清能与正常小鼠(本实验用昆明株)血清(SM)、感染氯喹敏感伯氏疟原虫(P.b.ANKA株)     

吖啶橙与瑞氏染色法检测伯氏疟原虫的初步研究

目的 :比较吖啶橙 (AO)与瑞氏染色法检测伯氏疟原虫的实用性。方法 :10倍倍比稀释经血液腹腔接种传代感染 4～ 6天的伯氏疟小鼠尾血 ,同时制薄血片。以AO法和瑞氏法染色后高倍镜检 ,记录每片发现三次原虫的平均时间。结果 :AO法与瑞氏法检测发现疟原虫的时间有差别 ,前者较后者快。结论 :AO法是检测人体疟原虫的一种简便、快速、敏感、实用的方法。     

恶性疟原虫海南、云南、安徽株裂殖子表面抗原MSA1第二区基因的克隆和序列分析

应用ＰＣＲ技术扩增并克隆恶性疟原虫海南、云南、安徽３个地理株ＭＳＡ１第二区基因，测定并分析其基因序列。结果表明，海南、云南、安徽株扩增片段长度为４２３ｂｐ，基因序列完全相同，我国虫株ＭＳＡ１与ＷＥＬＬＣＯＭＥ株最为相似，存在ＭＡＤ和Ｋ１两种等位基因型的基因内重组现象。     

伯氏疟原虫红细胞膜相关蛋白1缺失突变体的构建和鉴定

目的:研究伯氏疟原虫输出蛋白——红细胞膜相关蛋白1(EMAP1)在疟原虫生长发育和侵染中的作用,构建EMAP1缺失的伯氏疟原虫突变体.方法:以pL0035质粒为载体,PCR扩增EMAP1编码区上游和下游序列作为同源臂,用酶切连接和无缝克隆的方法将两条同源臂分别插入pL0035,获得重组质粒pL0035-ΔPbEMAP1...     

伯氏疟内质网塑形蛋白SEY1敲除质粒的构建及转染

目的:为了研究重要内质网塑形蛋白SEY1在疟原虫致病性方面的作用,本研究构建敲除伯氏疟原虫PbSEY1的质粒,结合疟原虫转染技术筛选PbSEY1缺失疟原虫突变体。方法:选取PbSEY1编码区中相邻的两个片段作为同源臂进行PCR扩增,并引入特定酶切位点,借助T4 DNA连接酶和In-Fusion无缝克隆的方法将其插入载体pL0034中;利用疟原虫同步化培养及电转染技术将该质粒转入疟原虫,基于基因同源重组原理在疟原虫中敲除PbSEY1并进行药物筛选。结果:（1）获得可用于基因敲除及回复实验的重组质粒pL0034-△PbSey1;（2）在伯式疟原虫中敲除PbSEY1。结论:利用重组质粒pL0034-△PbSey1和疟原虫转染技术初步获得PbSEY1缺失疟原虫突变体,为进一步研究PbSEY1在疟原虫致病性中的作用提供了必要工具。     

疟原虫感染组织切片吉姆萨染色法的建立及优化

目的探讨使用吉姆萨(Giemsa)染色法对伯氏疟原虫(Plasmodium berghei,P.b.)ANKA株感染小鼠肝、脾组织标本进行染色的可行性及效果。方法小鼠肝、脾组织用10%福尔马林固定后石蜡包埋,4μm厚切片,60℃烤箱30min烘烤,二甲苯脱蜡,常规乙醇水化至水,用2、3、4倍稀释的吉姆萨工作液分别染色3min、5min、10min;同时做常规苏木精-伊红(Haematoxylin-eosin,HE)染色。结果 3倍稀释Giemsa工作液染色5min的染色效果最佳。镜下观察,疟原虫染色鲜明、虫体胞浆蓝色,胞核粉红、疟色素染为棕褐色,清晰易辨,明显优于HE染色法。结论使用Giemsa染色法对P.b.感染小鼠肝、脾组织标本的染色简单易行,需时短,效果良好,在临床及科研领域中具有应用价值。     

海南省恶性疟原虫氯喹抗性相关基因 Pfmdr1多态性分析

目的了解海南省恶性疟原虫：Pfmdrl基因中的关键性点突变是否与海南株恶性疟原虫产生氯喹抗性有关。方法采用套式PCR法分别扩增Pfmdrl基因中含有第86位和1246位氨基酸的多态性片段,并对扩增产物进行限制性内切酶酶切分析,观察是否存在突变位点。结果45个样本中,Pfmdrl基因第86位氨基酸均未发生点突变,即86位密码子是Asn而非突变型的Tyr;Pfmdrl基因发生D1246Y突变的样本有3个,其中1个是抗性株,2个为敏感株。结论我国海南株恶性疟原虫产生氯喹抗性与Pfmdrl基因的多态性无显著关系。     

恶性疟原虫海南、云南、安徽株裂殖子表面抗原MSA2基因的克隆和序列分析

应用ＰＣＲ技术扩增并克隆了恶性疟原虫海南、云南、安徽三个地理株的ＭＳＡ２基因，测定并分析了全基因序列。结果表明，海南、云南、安徽株ＭＳＡ２基因序列完全相同，全长为７９５ｂｐ，编码２６４个氨基酸，与ＦＣＱ－２７／ＰＮＧ株ＭＳＡ２高度同源。对抗原表位进行多参数综合分析表明，我国虫株除具有国外已确定的抗原表位ＳＴＮＳ、ＤＴＰＴＡＴＥ外，在第５３—７２位氢基酸间可能具有一个新的抗原表位。     

伯氏疟原虫氯喹敏感株和抗性株对宿主细胞色素P450ⅡB1基因 …

目的;比较伯氏疟原虫氯喹抗性株和敏感株对宿主肝脏细胞色素Ｐ４５０ⅡＢ１基因ｍＲＮＡ转录影响的差异。方法：以小鼠ＣＹＰ４５０ⅡＢ１基因的ｃＤＮＡ为探针,分别与感染伯氏疟原虫ＲＣ株和Ｎ株的小鼠肝脏总ＲＮＡ进行了Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ杂交。结果;感染伯氏疟原虫Ｎ株小鼠肝ＣＹＰ４５０ⅡＢ１基因的ｍＲＮＡ明显低于感染ＲＣ株鼠及正常对照鼠,而感染ＲＣ株鼠与正常对照鼠之间该基因的转录无明显差异。     

恶性疟原虫地理株体外培养及vat基因转录方法的建立

目的建立恶挫疟原虫地理株连续体外培养方法,并采用荧光定量PCR技术分析培养虫株var基因转录类型。方法采用常规RPM11640培养基和添加AlbumaxIl等成分,建立2株恶性疟原虫地理株的体外培养,并采用荧光定量PCR技术检测中晚期虫体var基因转录变化。结果成功体外连续培养2株恶性疟原虫野生株,并建立了荧光定量PCR检测var基因转录的方法,用该方法检测出该虫株var基因优势转录类别。结论建立的疟原虫体外培养方法和var基因转录检测技术可用于我国恶性疟原虫var基因致病作用的分析。