铜绿假单胞菌LasI基因反义核酸载体的构建及生物学作用研究

目的构建LasI基因反义核酸原核表达载体pUCP18／lasI^antisenae转化入铜绿假单胞菌并分析其生物学作用。方法PCR扩增LasI基因序列，反向克隆法构建LasI基因的反义核酸原核表达载体pUCP18／lasI^antisenae，并转化铜绿假单胞菌。通过检测转化菌的LasB和LasR基因表达，测定外毒素的活性和绿脓菌素的表达等指标，分析pucP18／lasI^antisenae的生物学作用。结果成功构建pUCP18／lasI^antisenae并转化铜绿假单胞菌，且有效表达，转化菌的毒力因子弹性蛋白酶、外毒素和绿脓菌素表达水平均降低。结论pUCP18／las I^antisenae可以降低铜绿假单胞菌毒力因子表达，提示LasI基因可作为医院内铜绿假单胞菌感染治疗的一个新的靶点。     

铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF原核表达载体的构建及表达

目的 克隆铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF基因,构建原核表达载体并鉴定表达。方法 从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA,PCR扩增OprF羧基端,克隆至原核表达载体pET28b中,构建重组表达载体pET28b-F。重组质粒经酶切和序列测定后,转化E.coli BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,进行SDS-PAGE检测。经Ni-NTA亲和层析柱纯化后OprF蛋白免疫BALB/C小鼠,通过杂交瘤方法制备相应单克隆抗体并用ELISA方法进行鉴定。结果 pET28b-F原核表达载体构建成功。重组表达质粒经IPTG诱导后表达外膜蛋白OprF。获得4株高分泌型特异性单克隆细胞株,其中2株单克隆抗体可用于制备双抗体夹心法ELISA试剂盒,检测铜绿假单胞菌。结论 成功克隆铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF羧基端基因片段并在大肠杆菌中进行表达,筛选出特异性抗OprF单克隆抗体。     

穿心莲内酯对铜绿假单胞菌毒力因子的影响

目的观察穿心莲内酯对铜绿假单胞菌密度域值感应系统(QS系统)调控的毒力因子的影响。方法分别测定穿心莲内酯对铜绿假单胞菌生长曲线、绿脓菌素、胞外蛋白水解酶活性的影响,同时检测穿心莲内酯对QS系统双突变株PAOJP2蛋白水解酶活性的作用。结果穿心莲内酯组与对照组铜绿假单胞菌生长未表现出明显差异。12.5mg/ml穿心莲内酯能明显抑制绿脓菌素的分泌和胞外蛋白水解酶活性。穿心莲内酯对PAOJP2胞外蛋白水解酶无明显影响。结论穿心莲内酯可能通过抑制铜绿假单胞菌毒力因子产生而实现抗感染作用。     

乳铁蛋白多肽嵌合体对泛耐药铜绿假单胞菌毒力因子表达的影响

目的：研究乳铁蛋白多肽嵌合体对泛耐药铜绿假单胞菌绿脓菌素、弹性蛋白酶表达的影响.方法：在泛耐药铜绿假单胞菌培养基（D600 =0.05）中分别加入乳铁蛋白多肽（LFampin、LFcin）以及乳铁蛋白多肽嵌合体（LFchimera）溶液干预,通过氯仿萃取法定量检测绿脓菌素水平,用刚果红弹性蛋白检测法检测弹性蛋白酶活性.结果：LFampin、LFcin以及LFchimer均对泛耐药铜绿假单胞菌有杀菌活性,且能显著抑制绿脓菌素、弹性蛋白酶的表达,其作用与浓度呈正相关,其中,LFchimera的作用强于LFampin及LFcin,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论：乳铁蛋白多肽,尤其是乳铁蛋白多肽嵌合体对泛耐药铜绿假单胞菌具有良好的抗菌活性,能显著抑制其绿脓菌素、弹性蛋白酶的表达.     

铜绿假单胞菌含Pilz结构域蛋白基因的克隆及原核表达

目的 克隆铜绿假单胞菌含Pilz结构域蛋白基因并构建其原核表达载体,为进一步研究这七种含Pilz结构域蛋白是否为第二信使c-di-GMP潜在的受体分子奠定实验基础.方法 提取铜绿假单胞菌PAO1基因组DNA,用PCR方法从中扩增出七种功能未知的含Pilz结构域蛋白基因,将其克隆到原核表达载体pET32a中,在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定.结果 成功扩增出七种含Pilz结构域蛋白基因并构建其原核表达载体,测序结果与NCBI数据库收录序列相一致.SDS-PAGE检验证明目的 基因在大肠杆菌BL21中获得高效表达.结论 从铜绿假单胞菌基因组中成功地克隆了七种含Pilz结构域蛋白基因,其构建的原核表达载体在大肠杆菌BL21中获得了高效表达.     

原白头翁素对铜绿假单胞菌群体感应系统调控的毒力因子表达量的影响

目的 研究原白头翁素对铜绿假单胞菌（PA）的生长及群体感应系统（QS系统）调控的毒力因子表达的影响。方法 测定原白头翁素对PA的最低抑菌浓度和生长曲线,以40 μmol/L的呋喃酮C-30作为阳性对照,测定原白头翁素（40、80 μmol/L）对铜绿假单胞菌标准株PAO1生长曲线的影响以及QS系统调控的毒力因子中胞外3种毒力因子（绿脓菌素、蛋白水解酶和弹性蛋白酶）表达量的影响。结果 在实验所采用的浓度下,原白头翁素对铜绿假单胞菌的生长未表现出明显的抑制作用,但对PAO1的3种毒力因子均有抑制作用,并呈现出剂量相关性。结论 原白头翁素抗感染的机制可能是作用于铜绿假单胞菌的QS系统,抑制毒力因子表达,从而降低该菌的毒力。     

铜绿假单胞菌噬菌体PaP1内溶素基因克隆、表达及活性分析

目的 构建铜绿假单胞菌噬菌体内溶素重组原核表达载体,检测重组蛋白的酶学活性及抑菌活性.方法 利用重组技术将铜绿假单胞菌裂解性噬菌体PaP1内溶素基因构建到表达载体pQE31中,并在大肠杆菌M15(pREP4)中诱导表达,通过非变性方法纯化重组融合蛋白,利用酶潜电泳、抑菌实验等技术检测酶学活性及抑菌活性.结果 酶谱电泳方法结果显示重组融合蛋白对铜绿假单胞菌细胞壁肽聚糖有降解作用,抑菌活性检测结果显示重组融合蛋白对金黄色葡萄球菌有一定的抑菌效果.结论 该研究从实验方面证实了噬菌体PaP1内溶素基因的生物学功能.     

黏液型铜绿假单胞菌PA2815基因的敲除与功能鉴定

目的构建黏液型铜绿假单胞菌64(PA-64)株2815基因敲除株PA-64/ΔPA2815,建立有效的PA2815基因敲除平台。方法利用自杀质粒p CVD442及基因同源重组技术敲除PA-64株PA2815基因,并采用PCR及测序检测方法筛选获得PA2815基因被Gm抗性基因取代的克隆,命名为PA-64/ΔPA2815。比较敲除株与野生株之间的生长特性、抗生素的敏感性、藻酸盐以及绿脓菌素分泌的差异。结果 PA-64/ΔPA2815菌株与野生株的PA2815基因两侧同源臂片段PCR产物相比缺少1 480 bp,成功构建了黏液型铜绿假单胞菌PA2815基因敲除株。体外实验证实敲除株相比野生株生长速度略慢,藻酸盐分泌显著降低,差异有统计学意义(P0.05),而绿脓菌素分泌显著升高(P0.05),但在抗生素的敏感性方面差异无统计学意义(P0.05)。结论利用同源重组原理成功构建黏液型铜绿假单胞菌PA2815基因敲除平台;PA2815基因不影响黏液型铜绿假单胞菌对抗生素的敏感性,但可以正向调控其藻酸盐的分泌和菌落生长状态,负向调控绿脓菌素的分泌。     

黄芪对铜绿假单胞菌毒力因子调控表达及菌体运动的影响

[目的] 观察黄芪对铜绿假单胞菌相关毒力因子表达及菌体运动的影响,探讨黄芪对铜绿假单胞菌的作用机制。[方法] 不同浓度黄芪与对数生长期铜绿假单胞菌共培养,弹性蛋白-刚果红降解实验检测细菌分泌的弹性蛋白酶活性,紫外分光光度法测定绿脓菌素分泌量,结晶紫染色法观察生物被膜形成量,在含黄芪琼脂平板中检测菌体集群运动与泳动能力。[结果] 黄芪在终浓度25、12.5、6.25 g/L条件下对弹性蛋白酶、绿脓菌素表达有显着抑制,并能抑制生物被膜形成。在低于12.5 g/L时对细菌增殖无显着影响。细菌在12.5 g/L条件下泳动能力与集群运动均受到显着影响。[结论] 黄芪对铜绿假单胞菌增殖和毒力因子表达的抑制程度不一致,提示黄芪抑菌可能通过多种途径发挥抑菌功能,并可能在低浓度下便对密度感应系统造成显着抑制。     

铜绿假单胞菌耐药基因及毒力因子分布特征分析

目的:了解我院铜绿假单胞菌毒力因子及耐药基因分布情况,为临床合理选用抗菌药物提供依据。方法:采用ROCHE COBAS E601电化学发光分析仪检测疑似细菌性感染病人降钙素原(PCT)水平,PCT显著升高病人且微生物送检标本单纯检出的12株铜绿假单胞菌为研究对象;采用PCR方法对毒力因子(tox A、exo U、exo S、exo T、Pvoein protein、nor A、las B)及耐药基因(TEM、SHV、PER、VEB1、OXA-10、Amp C、0pr D、KPC)表达情况进行分析;结果:12株铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药率为91.7%(11/12),毒力因子阳性率最高者为Tox A和exo T(91.7%),耐药基因阳性率最高者为Amp C和Opr D(91.7%)。结论:铜绿假单胞菌毒力因子Tox A、exo T及耐药基因Amp C和Opr D携带率较高,不同菌株间耐药特征差异明显,在疑似铜绿假单胞菌感染病人时应依据抗菌药物敏感试验结果针对性选择抗生素,特别对于无菌部分分离的铜绿假单胞菌。     

铜绿假单胞菌噬菌体PaP3多糖解聚酶基因的克隆表达及生物学活性

目的克隆表达铜绿假单胞菌噬菌体PaP3多糖解聚酶基因并检测其活性. 方法应用PCR技术从铜绿假单胞菌噬菌体PaP3基因组中扩增多糖解聚酶基因,将其克隆于原核表达载体pQE-31中,所构建的重组质粒经测序鉴定后转化大肠埃希菌JM109,IPTG诱导表达;采用Ni-NTA柱亲和层析分离纯化目的蛋白;提取铜绿假单胞菌生物膜胞外多糖,观察目的蛋白对胞外多糖的降解活性. 结果采用PCR技术成功扩增了铜绿假单胞菌噬菌体PaP3多糖解聚酶基因,所构建的重组质粒经酶切及测序鉴定与设计序列一致;转化E.coli JM109后,IPTG诱导目的蛋白表达率约为25%;SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约为20.4×103,与理论预期值一致;破菌后电泳证实目的蛋白主要在上清中以可溶形式表达. 经Ni-NTA柱亲和层析后蛋白纯度大于95%. 初步活性检测结果表明重组PaP3多糖解聚酶蛋白对生物膜胞外多糖具有一定的降解作用. 结论重组噬菌体PaP3多糖解聚酶在体外可以特异性的降解铜绿假单胞菌的胞外多糖,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础.     

铜绿假单胞菌外毒素A原核表达载体的构建及表达

目的 对铜绿假单胞茵外毒素A(PEA)全基因进行基因克隆,构建原核表达质粒并进行表达.方法 从铜绿假单胞茵中提取基因组DNA,设计PCR引物扩增出带信号肽的PEA目的 基因,经HindⅢ和EcoR Ⅰ消化后,与PET-32a裁体进行连接重组.用限制性内切酶消化、PCR及DNA测序等方法鉴定构建成功后.IPTG诱导目的 基因表达.结果 SDS-PAGE电泳结果显示,在分子量78 KD处有一条明显的新生蛋白带.表达的融合蛋白量约占细茵总蛋白的35%.结论 PET-32a-PEA原核表达质粒的成功构建及表达.为进一步研究有效的基因工程疫苗和免疫导向治疗的基因重组毒素奠定了基础.     

铜绿假单胞菌lasR基因反义肽核酸序列筛选及其抑制生物被膜形成的研究

目的 筛选靶向铜绿假单胞菌lasR基因的反义肽核酸序列,探讨其对铜绿假单胞菌的生物被膜形成能力的影响.方法 针对铜绿假单胞菌lasR基因设计4条反义寡核苷酸序列,利用斑点杂交筛选出与lasR基因结合最佳的反义寡核苷酸序列,以此合成与穿膜肽连接的肽-肽核酸序列.分别用不同浓度的肽-肽核酸导入铜绿假单胞菌生物被膜模式菌PAO1中,测定不同时相点细菌生长光密度[D(600)]值并进行菌落计数,观察肽-肽核酸对其生长的抑制作用.利用光学显微镜和扫描电镜观察生物被膜形成情况.qPCR方法检测lasR mRNA表达.结果 斑点杂交实验结果显示:4条反义寡核苷酸序列中3条有杂交信号产生,其中第1条序列信号最强,以此为基础合成反义肽核酸.不同浓度的肽-肽核酸对铜绿假单胞菌表现出不同程度的体外抗菌活性,且随着浓度增加,抗菌活性增强.结论 有效筛选出高效反义核苷酸序列,经筛选出的靶向铜绿假单胞菌lasR基因的反义肽核酸对铜绿假单胞菌的生长及生物被膜形成能力有明显抑制作用,同时抑制lasR mRNA的表达.     

重组人β防御素4的原核表达、纯化及抗铜绿假单胞菌活性初探

目的制备原核表达的重组人β防御素4(human beta defensin 4,HBD4),初步探讨其对铜绿假单胞菌的体外抗菌活性.方法将编码HBD4的DNA片段连接到大肠杆菌表达载体pET42a中,构建好的表达质粒pET42a-HBD4转化到表达菌株BL21(DE3)中,0.5 mmol/L IPTG诱导表达4 h,亲和纯化融合蛋白后经Western blot鉴定,再以肠激酶酶切融合蛋白,镍柱亲和层析分离HBD4;采用打孔法初测其抗铜绿假单胞菌活性,并用微量稀释法测定HBD4与3种抗生素的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),比较其抗铜绿假单胞菌活性并异.结果 GST-HBD4在大肠杆菌中以可溶形式成功表达,纯化的重组HBD4体外对铜绿假单胞菌有抗菌活性,其效能略低于亚胺培南,而高于哌拉和环丙沙星.结论采用基因工程技术成功表达了重组HBD4,其对铜绿假单胞菌有较强的杀菌活性,具有烧伤创面感染治疗的应用前景.     

铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因的扩增与克隆

目的PCR扩增及克隆铜绿假单胞菌的弹性蛋白酶基因.方法从铜绿假单胞菌培养物中提取染色体DNA,PCR扩增弹性蛋白酶基因成熟蛋白编码区,A-T克隆于pMD 18-T载体中,对重组质粒进行酶切与测序鉴定.结果从高GC含量的铜绿假单胞菌染色体DNA中扩增到弹性蛋白酶基因并进行了克隆与鉴定.结论本研究成功克隆到铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因,为实现活性弹性蛋白酶的高效表达奠定了基础.     

铜绿假单胞菌mexA基因原核表达载体的构建

目的 构建mexA基因的原核载体,为进一步表达MexA蛋白奠定基础.方法 从临床分离多重耐药的铜绿假单胞菌抽提DNA,经PCR扩增出mexAl基因与PUC18克隆载体连接,PCR、酶切及测序鉴定,再以PUC/mexA1质粒为模板PCR扩增mexA目的 基因,克隆至质粒pQE30中,构建表达质粒pQE30/mexA,构建的表达质粒pQE30/mexA转化大肠杆菌M15,培养后提取纯化重组质粒pQE30/mexA酶切鉴定.结果 获得长约1.5 kbPCR mexA1产物,酶切结果显示所构建的重组质粒PUC/mexA1已成功地克隆了mexA1(1.5 kb)基因,序列分析结果与PA01/mexA1序列相同,构建的表达质粒pQE30/mexA酶切鉴定,与插入pQE30的目的基因mexA(1.2 kb)片段相符.结论 含mexA(1.2 kb)基因的原核表达载体构建成功,为进一步表达MexA蛋白奠定了基础.     

铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF和OprH基因扩增、融合、克隆及原核表达

目的 在大肠杆菌中串联表达铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF和OprH，获得重组融合蛋白OprF／H，为抗铜绿假单胞菌的疫苗研究打下基础。方法 从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA，设计PCR引物扩增出OprF和OprH基因，扩增片段经过酶切、连接和PCR扩增后，割胶回收PCR产物并将其克隆至克隆质粒，测序后构建表达质粒pGEX-F／H，并转化大肠杆菌BL21。结果 重组表达质粒经IPTG诱导后表达融合外膜蛋白OprF／H。结论 成功构建融合外膜蛋白OprF／H的原核表达质粒并在大肠杆菌中表达成功。     

铜绿假单胞菌抗菌物质对白色念珠菌的

目的 观察铜绿假单胞菌抗菌物质对白色念珠菌的体外抑菌活性.方法 用交叉条带实验方法测定铜绿假单胞菌对18株白色念珠菌等的体外抑制活性.结果 铜绿假单胞菌抗菌物质对白色念珠菌体外抑菌活性良好,第6和8株铜绿假单胞菌对白色念珠菌的抑制率均达到了100%,铜绿假单胞菌产生色素的菌株抗真菌活性显著优于不产色素的菌株.铜绿假单胞菌抑制白色念珠菌的生长,主要是铜绿假单胞菌产生的绿脓素.结论 铜绿假单胞菌产生的抗菌物质对白色念珠菌具有较强的抗真菌活性.     

产金属酶铜绿假单胞菌携带Ⅰ类整合子的研究

目的 研究产金属酶铜绿假单胞菌携带Ⅰ类整合予及其基因盒的情况.方法 收集铜绿假单胞菌68临床株,进行金属酶IMP-1、VIM基因的PCR检测,选取阳性株再作第Ⅰ类整合酶基因的PCR检测,然后选取整合酶基因阳性株进行Ⅰ类整合子相关基因盒的PCR检测.结果 PCR检测出68株铜绿假单胞菌中的1株同时含有IMP-1基因和Ⅰ类整合子基因盒;55株含有VIM基因,其中26株含有Ⅰ类整合酶基因,在这26株中只有18株含有Ⅰ类整合子基因盒,根据电泳条带可分为5种类别.结论 首次在中国西南地区发现产IMP-1并同时带有Ⅰ类整合子的铜绿假单胞菌.Ⅰ类整合子在产金属酶铜绿假单胞菌中分布广泛,基因盒携带率为69.2%,对细菌的耐药性传播具有重要意义.     

亚胺培南和阿米卡星双耐药铜绿假单胞菌的特性分析

目的通过分析亚胺培南(IPM)和阿米卡星(AMK)同时耐药的铜绿假单胞菌的特性,为探讨耐药机制、评估菌株临床危害提供实验数据。方法针对临床分离的25株铜绿假单胞菌,采用Etest试纸条法测定IPM、AMK的最小抑菌浓度(MIC);通过RT-qPCR检测外排泵MexY和膜孔蛋白OprD表达水平;通过结晶紫染色测定生物膜形成能力;采用氯仿萃取法测定绿脓菌素产生量。结果依据25株铜绿假单胞菌对IPM和AMK的敏感度不同将其分为GroupⅠ(5株,IPM敏感或中介、AMK敏感)、GroupⅡ(8株,IPM耐药、AMK敏感或中介)、GroupⅢ(12株,IPM、AMK均耐药)三组,其中对AMK耐药的菌株同时对IPM耐药。GroupⅢ菌株在生物膜形成能力和绿脓菌素产量上明显强于GroupⅠ和GroupⅡ菌株,差异有统计学意义(P0.05)。与参考菌株ATCC27853比较,GroupⅢ菌株的外排泵mexY表达显著上调4～12倍、膜孔蛋白oprD表达显著下调70%～80%,差异有统计学意义(P0.05)。结论AMK耐药的铜绿假单胞菌极可能对IPM耐药;生物膜形成能力、mexY和oprD的表达变化可能参与了铜绿假单胞菌对IPM和AMK的同时耐药。