广州地区人腺病毒5型血清中和抗体阳性率初步调查

目的评估广州地区人群中人腺病毒5型(HAdV-5)中和抗体阳性率情况。方法采用以β-半乳糖苷酶(LacZ)为报告基因,结合CMV启动子的人重组腺病毒5型载体,运用化学发光法,检测209份免疫功能正常的成人血清样本中HAdV-5的中和抗体。结果 HAdV-5中和抗体的阳性率为82.3%(172/209)。HAdV-5中和抗体在<1:20(低滴度)、1:40-1:160(中滴度)、1:320-1:1280(高滴度)、>1:1280(超高滴度)时均能检测到,而且随着滴度的增加,阳性率逐渐升高。在20～40岁时HAdV-5中和抗体阳性率最高,在<20岁时HAdV-5阳性率最低。结论广州地区人群中针对HAdV-5的先存中和抗体阳性率高,应用基于该种DNA病毒作为载体进行基因疫苗及基因治疗的研究时,具有一定的局限性。     

普通棉耳狨猴腹泻、消瘦的病例分析及处理

目的 分析引起此次普通棉耳狨猴腹泻、消瘦的原因,制定切实可行的预防控制措施,为规模化狨猴养殖提供值得借鉴的经验.方法 对腹泻、消瘦的狨猴进行病因分析,包括病症、饮食状况、饲喂状况、病理剖检、组织切片、肛门拭子采集检测等.结果 通过实验室诊断、饲养管理改善等进行病因分析,确定了引起狨猴腹泻、消瘦并最终导致2例死亡的原因,是由于饲养环境内部分应激因素（如温度）改变、饲养动物处于空调送风口位置、人员进出频繁等,导致机体内条件致病菌（肺炎克雷伯氏菌）引起动物发病.采取改变饲养管理方式、调整饮食等措施后,逐步控制了病情.结论 科学的饲养管理方式以及良好的兽医护理对防止普通棉耳狨猴腹泻、消瘦疾病的发生具有重要作用.     

两种狨猴血红蛋白及血清乳酸脱氨酶同工酶的比较

应用聚丙烯酸胺凝胶电泳法对２种狨猴的血红蛋白及血清乳酸脱氢酶同工酶进行了比较分析。结果表明：①２种狨猴之间的血红蛋白群体遗传型既有关联又不完全相同。普通狨猴血红蛋白电泳表型，群体为单一型，有３个成分，即１个主要成分（９５．９９％），２个次要成分；棉顶狨猴的血红蛋白电泳星遗传多态性，有２种血红蛋白型，Ⅰ型有３个成分，即１个主要成分（９３．９４％），２个次要成分，Ⅱ型有４个成分，即１个主要成分（９７．０７％），３个次要成分，是一个具有２个遗传型的混合型群体。②２种狨猴血清乳酸脱氨酶同工酶的电泳图谱均有５条区带，普通狨猴血清乳酸脱氢酶同工酶表型为：ＬＤＨ２＞ＬＤＨ３＞ＬＤＨ１＞ＬＤＨ５＞ＬＤＨ４。棉顶狨猴则为ＬＤＨ１＞ＬＤＨ２＞ＬＤＨ５＞ＬＤＨ３＞ＬＤＨ４。同时对２种狨猴血清乳酸脱氢酶同工酶的亚基进行了分析。     

化学发光法中和抗体检测技术对广州地区人5型腺病毒的流行病学研究

目的 建立高通量、可定量中和抗体检测方法,并且调查广州健康成人及儿童人群中人5型腺病毒中和抗体存在情况.方法 采用以带有分泌型碱性磷酸酶报告基因的5型重组腺病毒使用化学发光法,调查116份成人血清和94份儿童血清中5型腺病毒中和抗体情况.结果 该方法是一种适合高通量调查的血清学调查方法,广州地区成人中人5型腺病毒中和抗体阳性比例占26.72%,儿童中阳性比例为17.02%.结论 5型腺病毒在广州人群中具有一定的免疫程度,结合中和实验结果来应用该种病毒载体并同时开发其他血清型的腺病毒载体很有必要.     

棉耳型狨猴肠道菌群的研究

通过对40只普通棉耳型狨猴的大便培养研究发现，大肠杆菌(Eseherichia coli)的分离率为100％。在肠道兼性需氧菌群中所占比例为10％～95％，粪肠球菌(Escherichia faecalis)的分离率为90％所占比例为4％～60％，葡萄球菌(Genns steaphylococcus)、变形杆菌(Proteus)分离率分别为55%和58％，此外还分离出产气肠杆菌(Enteobacler derogenes)、白色念珠菌(Candida albicans)等9种细菌。其中大肠杆菌、粪肠球菌的分离率及所占比例同人类肠道菌群近似，而葡萄球菌及变形杆菌分离率及比例同人类肠道菌群的差异较大.     

西南地区部队官兵55型人腺病毒中和抗体的研究

目的 探究西南地区官兵55型人腺病毒（human adenovirus type 55,HAdV55）抗体流行情况,并检测HAdV55抗体（anti-HAdV55）的中和活性,为部队预防和控制HAdV55疫情提供参考依据。 方法 收集西南地区部队官兵血清325份,采用ELISA方法检测血清中anti-HAdV55,通过体外中和试验检测抗体阳性血清中和HAdV55感染的活性。 结果 西南地区部队官兵体内anti-HAdV55的阳性率较低,325份血清中抗体阳性仅为19份,阳性率为5.85%。19份抗体阳性的血清中,14份在细胞水平上具有中和活性,中和效价最高为1:64。 结论 西南地区官兵体内anti-HAdV55水平较低,抵抗 HAdV55感染的能力较弱。因此一旦出现个别感染者,部队应加强对HAdV55感染的预防和控制,防止感染的扩散。     

比格犬注射重组腺病毒Ad-HGF后血清中抗腺病毒抗体及中和抗体的检测

目的:观察Beagle犬重复给予Ad-HGF后血清中抗腺病毒抗体及抗肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)抗体的出现时间及消失规律. 方法:将24只比格犬随机分为四组:正常对照组、手术对照组、Ad-HGF小剂量组(2.4×107 pfu/ kg)和Ad-HGF大剂量组(2.4×108 pfu/ kg). Ad-HGF各组犬给予不同剂量Ad-HGF共14次. 在给药2次后分别利用病毒中和反应和ELISA 方法检测血清中抗腺病毒抗体和抗HGF抗体. 结果:手术组、正常对照组及实验组动物于给药前及给药3次时血清细胞均未出现明显中和反应. 给药4次后各剂量组动物血清均对腺病毒有不同程度中和作用,至停药后12 wk抗体水平很低或已不存在. 各时间点血清样品中未检测到抗HGF抗体. 结论:犬肌注Ad-HGF 4次后动物血清中检测到了抗腺病毒抗体,停药4 wk后抗体水平有不同程度下降,直至12 wk后血清中腺病毒抗体基本消失.     

人白细胞介素21基因重组复制缺陷型腺病毒的制备与鉴定

目的 制备表达绿色荧光蛋白的含人白细胞介素21(IL-21)基因的重组复制缺陷型腺病毒,为IL-21基因治疗肿瘤的研究奠定基础.方法 从人外周血淋巴细胞提取总RNA,经RT-PCR扩增IL-21基因片段,PCR产物和pDC316-mCMV-EGFP载体分别经限制性内切酶Notl与HindⅢ双酶切,然后将酶切产物连接、转化,构建pDC316-IL21-EGFP重组质粒.重组质粒经酶切和测序鉴定后,与腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3CreF35共转染293细胞,包装产生Ad5F35-IL21-EGFP重组腺病毒,并测定病毒滴度.观察Ad5F35-IL21-EGFP腺病毒转染后食管癌细胞EC-9706的生长曲线和细胞周期的变化.结果 pDC316-IL21-EGFP重组质粒经酶切和测序证实,IL-21基因片段正确插入pDC316-mCMV-EGFP栽体中且与GenBank中,IL-21基因序列一致.AdSF35-IL21-EGFP重组腺病毒栽体在293细胞中包装成功.获得成熟的病毒颗粒,经鉴定有IL-21基因和绿色荧光蛋白的表达.测得Ad5F35-IL-21-EGFP病毒颗粒滴度为9×1011VP/ml,感染性滴度为5×1010IU/ml.AdSF35-IL21-EGFP转染后,EC-9706细胞的生长缓慢(P＜0.05),G1期细胞增加,而G2期和S期细胞减少.结论 成功制备了表达绿色荧光蛋白的人IL-21基因的重组腺病毒,且病毒滴度较高.腺病毒介导的外源性IL-21基因可有效转染EC-9706细胞,并对其生长有抑制作用.     

华东部分地区12岁以下儿童5型腺病毒感染状况调查——用于Ad5型重组载体疫苗或者基因治疗剂的适宜人群筛选

目的调查12岁以下儿童腺病毒（adenovirus,Ad）感染所诱发的免疫力状况,尤其是针对5-型腺病毒（Ad5）的免疫力状况,旨在筛选应用Ad5重组疫苗和基因治疗剂的适宜人群。方法通过采集华东部分省市和地区12岁以下儿童的血清标本,采用ELISA方法检测Ad非特异性总抗体（Ad Total antibody,Ad-TAb）,用蚀斑减少中和试验（Plague Reduction Neutralization Test,PRNT）来检测Ad5中和抗体（Ad5 neutralizing antibody,Ad5-NAb）,用Stata9．0软件进行数据分析。结果经过ELISA和PRNT检测,发现Ad-TAb和Ad5-NAb的滴度水平以及各组标本的阳性率,均随着年龄的增长而呈上升的趋势。以低于2岁的年龄组各项数据最低,与其它各组有显著性差异（P〈0．05）。结论在12岁以下儿童人群中,以低于2岁的年龄组应用Ad5型重组疫苗或基因治疗剂是可行的。     

重组人5型腺病毒对B16黑色素瘤生长的抑制作用

目的 研究瘤内直接注射重组人5型腺病毒H101对B16黑色素瘤生长以及对手术后再次接种B16黑色素瘤细胞后肿瘤生长的影响.方法 建立小鼠B16黑色素瘤动物模型.瘤内直接注射H101腺病毒,测量肿瘤体积,切除肿瘤,再次接种B16黑色素瘤细胞,观察肿瘤生长情况.结果 细胞接种8 d后,全部小鼠均长出肿瘤.H101注射组肿瘤的体积在给药后3,6,9 d,都显著小于对照组.再次接种B16黑色素瘤细胞后,H101注射组肿瘤的生长速度也显著小于对照组.结论 瘤内直接注射H101对B16黑色素瘤生长具有抑制作用,对手术后再次接种的肿瘤生长也具有抑制作用.     

重组人5型腺病毒注射液局部瘤内注射治疗晚期肝癌的临床研究

目的 探讨重组人5 型腺病毒注射液局部瘤内注射治疗晚期肝癌的临床疗效及安全性。方法 选择2009 年1 月至2013 年1 月来自复旦大学附属华山医院的80 例晚期肝癌患者,分为对照组（n=40）和观察组（n=40）,对照组患者只给予顺铂及5-氟尿嘧啶化疗,观察组患者在化疗基础上联合B 超引导下经皮瘤内注射重组人5 型腺病毒注射液,连续使用两个周期。比较两组患者肿瘤客观有效率、肿瘤进展时间及不良反应。结果 观察组的客观有效率为22.50%,高于对照组的5.00%,差异有统计学意义（P＜0.05）。观察组的平均肿瘤进展时间为（11.93±2.54）周,高于对照组的（8.06±2.21）周,差异有统计学意义（P＜0.05）。局部瘤内注射后48 h 观察组血液中IFN-γ、IL-1α、IL-6 及TNF-α 显著高于治疗前,差异有统计学意义（P<0.05）。两组患者治疗后ALT、AST、ALP、TBIL 及AFP 指标均有所下降,而观察组下降幅度大于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。观察组患者不良反应主要为发热、局部反应及流感样症状,均为Ⅰ/Ⅱ级。观察组患者生活质量提高率为55.00%,高于对照组的22.50%,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 晚期肝癌患者在化疗基础上局部瘤内注射重组人5 型腺病毒注射液,可提高客观有效率和患者生存期,且安全性及耐受性好。     

过氧化物酶体特异性绿色荧光蛋白的腺病毒构建

目的设计特异性标记过氧化物酶体的绿色荧光蛋白,构建腺病毒载体,并感染培养的大鼠心肌细胞H9C2,检测该腺病毒载体的表达效率,通过共聚焦显微镜观察细胞过氧化物酶体的分布,同时给予细胞缺氧处理,对比细胞内过氧化物酶体的变化。方法（1）设计带有过氧化物酶体信号肽序列的绿色荧光蛋白序列。（2）PCR扩增该序列片断,并将其克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack中;pAdTrack经限制性内切酶Pme Ⅰ酶切线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183感受态细胞中进行同源重组。重组绿色荧光蛋白质粒经限制性内切酶PacⅠ酶切线性化后,转染293A细胞,进行病毒包装,得到Ad-GFP-Peroxi重组腺病毒颗粒。（3）用Ad-GFP-Peroxi腺病毒和不带有信号肽序列的Ad-GFP腺病毒感染培养的H9C2,24h后共聚焦显微镜下观察。（4）用Ad-GFP-Peroxi腺病毒感染H9C2细胞后,分为正常培养和1%氧浓度培养两组,24h后观察。结果重组Ad-GFP-Peroxi腺病毒载体构建成功;与Ad-GFP腺病毒相比,Ad-GFP-Peroxi腺病毒能够特异性显示大鼠心肌细胞内过氧化物酶体的分布;且缺氧刺激后H9C2细胞内过氧化物酶体分布出现聚集现象。结论利用同源重组的方法成功构建的过氧化物酶体特异性绿色荧光蛋白的过表达腺病毒,对大鼠心肌细胞H9C2有较高的感染效率,共聚焦显微镜下可以明确显示心肌细胞内过氧化物酶体的分布情况,且缺氧刺激导致过氧化物酶体分布聚集。     

嵌合性5型腺病毒载体Ad5/F35体外转染大鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的:研究携带35型腺病毒纤毛的嵌合性5型腺病毒载体Ad5/F35能否有效地将增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因体外转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),并观察eGFP基因在大鼠BMSCs内持续表达的时间.方法:贴壁培养法分离、扩增大鼠BMSCs.用带有eGFP基因的Ad5/F35(Ad5/F35-eGFP)分别以1、10、100、1000的感染复数(MOI)转染第2代大鼠BMSCs;荧光倒置显微镜和流式细胞仪(FCM)检测eGFP基因的转染效率与表达水平,观察细胞生长状态以评估病毒对大鼠BMSCs基本生物学特性的影响;对MOI=100的病毒转染的大鼠BMSCs在转染后第2、7、14、21、30天分别用FCM检测大鼠BMSCs内eGFP的表达情况.结果:MOI在1到1000范围内,eGFP基因转染效率和表达水平与Ad5/F35-eGFP的MOI呈正向剂量相关性.MOI=100的病毒可转染90%左右的大鼠BMSCs,且eGFP基因在1个月内均有表达.MOI为1、10、100的病毒不影响大鼠BMSCs的活力和增殖能力.结论:Ad5/F35可以高效地将eGFP基因体外转染大鼠BMSCs,eGFP基因可持续表达1个月.本研究为Ad5/F35作为BMSCs的基因转移和表达载体进行细胞治疗与基因治疗提供了实验依据.     

重组腺病毒介导的绿色荧光蛋白基因转染大鼠间充质干细胞的实验研究

目的 体外研究重组腺病毒载体介导绿色荧光蛋白基因转染大鼠间充质于细胞(MSCs)的方法.方法 用密度梯度离心及贴壁法相结合的方法分离纯化大鼠MSCs并进行鉴定,重组绿色荧光蛋白的腺病毒载体Ad-GFP转染,荧光显微镜检测其转染效率,CCK-8法检测转染细胞的增殖能力.结果 Ad-GFP对大鼠MSCs的感染率高达90.0%,感染1月后仍有稳定表达;转染细胞的增殖能力与未转染细胞相比,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 重组腺病毒载体Ad-GFP可高效感染MSCs,基因转染后细胞的增殖能力不受影响,可作为一种高效的大鼠MSCs的标记方法.     

HEK293T细胞扩增重组腺病毒研究

目的探讨HEK293T细胞扩增重组腺病毒的可行性。方法重组腺病毒保存液稀释后感染HEK293T细胞,观察细胞病变效应,半数组织培养感染量测定扩增病毒的滴度,通过体外感染心肌细胞,成纤维细胞验证其感染活性。结果HEK293T细胞可以扩增带有绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒,病毒滴度为5×10^6PFU/mL,扩增后的腺病毒可以感染体外培养的心肌细胞和成纤维细胞。结论HEK293T细胞可有效扩增带有绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒。     

携带K5基因突变体的腺病毒构建及K5蛋白表达

 目的 对血管生成抑制因子纤溶酶原Kringle 5（K5）基因进行突变,构建于重组腺病毒中,并观察突变后K5蛋白的表达情况。方法 用重叠延伸技术对K5基因Furin蛋白酶水解识别位点进行定点突变,分别构建携带K5基因和突变后的K5m基因表达框的腺病毒载体Ad-EF1&#61537;-K5/K5m;用RT-PCR法比较腺病毒感染TC-1细胞后K5和K5m mRNA的表达;用免疫沉淀和Western blot法比较腺病毒感染TC-1细胞后K5蛋白和突变后K5蛋白的表达。结果 成功对K5基因进行点突变,携带K5突变基因腺病毒K5蛋白表达量明显多于携带未突变K5基因腺病毒。 结论 对K5基因Furin蛋白酶水解识别位点进行定点突变能提高腺病毒介导的K5蛋白分泌表达量,为进一步以腺病毒为载体携带K5基因在眼部新生血管异常增生性疾病的实验研究提供基础。