干细胞向雌性生殖细胞分化的研究进展

近年来,医学对于女性肿瘤患者的关注已从生存时间和生存率,逐步转为如何保留患者的生育能力。其中部分患者即使通过辅助生殖技术也无法获得有功能的卵子,利用干细胞技术获得卵细胞不仅可以为这类患者解决无法生育的难题,而且可能在研究器官发生发育、濒危动物保护、基因治疗等方面起到重要作用［1‐5］。根据干细胞所处的发育阶段和分化性质不同,将干细胞分为3类,包括：胚胎干细胞（embryonic stem cell , ESCs）,成体干细胞（adult stem cell ,ASCs）,以及诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell ,iPSCs）。现将近期各种干细胞向雌性生殖细胞分化的研究进展综述如下。     

全反式维甲酸促进多能干细胞向间充质干细胞样细胞分化

目的探索全反式维甲酸(RA)和SB431542对胚胎干细胞(ES)及诱导多能干细胞(i PS)分化为间充质干细胞(MSC)样细胞的影响。方法将培养的鼠ES和i PS根据不同的分化条件分为对照组、SB431542组及RA不同浓度组,对照组为达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)完全培养基,SB431542组为DMEM完全培养基中含10μmol·L-1SB431542,RA不同浓度组的DMEM中分别含0.05、0.10、0.20、0.40 nmol·L-1RA。分化培养4 d后观察细胞形态,流式细胞术检测细胞表面标志物CD105和干细胞抗原1(Sca-1)的表达,以CD105+细胞和Sca-1+细胞的比例确定i PS和ES向MSC分化的程度。结果小鼠ES和i PS在ESGRO-2i培养基里生长较好。ES分化4 d后,对照组和SB431542组ES和i PS分化成内皮样细胞,在含有不同浓度RA的培养基中ES和i PS可有效分化为纤维状细胞。ES分化4 d后,SB431542组Sca-1+细胞比例显著高于对照组(P<0.05),CD105+细胞比例与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。在RA 0.05、0.10、0.20、0.40 nmol·L-1RA组中,ES分化的CD105+细胞比例显著高于对照组和SB431542组(P<0.05),Sca-1+细胞比例显著高于对照组(P<0.05),但与SB431542组比较显著降低(P<0.05);0.20 nmol·L-1RA组的CD105+和Sca-1+细胞比例显著高于0.05、0.10、0.40 nmol·L-1RA组(P<0.05)。i PS分化4 d后,SB431542组CD105+细胞和Sca-1+细胞比例显著高于对照组(P<0.05)。0.05、0.10、0.20、0.40 nmol·L-1RA组中,i PS分化的CD105+细胞比例显著高于对照组和SB431542组(P<0.05),Sca-1+细胞比例显著高于对照组(P<0.05),但与SB431542组比较均显著降低(P<0.05);0.20 nmol·L-1RA组Sca-1+细胞比例显著高于0.05、0.10、0.40 nmol·L-1RA组(P<0.05),0.20 nmol·L-1RA组CD105+细胞比例显著高于0.05、0.10 nmol·L-1RA组(P<0.05),但与0.40 nmol·L-1RA组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论利用RA可以促进ES和i PS向MSC样细胞分化,分化方法较为简单,分化周期较短,为多能干细胞向MSC样细胞的分化提供了一定的方法基础。     

昆明小鼠胚胎干细胞定向分化为神经干细胞的实验研究

目的 探讨体外分离培养、诱导胚胎干细胞(ESC)分化为神经干细胞(NSC)的方法.方法 自孕3.5d的昆明小鼠获得附植前的早期胚胎,在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上培养获得ESC克隆. 进行Oct-4免疫细胞化学鉴定、碱性磷酸酶(AKP)染色鉴定及体外分化能力的鉴定.在无人重组白血病抑制因子(hLIF)存在的条件下将ESC悬浮培养4d,形成拟胚体(EB),再经全反式维甲酸(RA)诱导4d,在神经干细胞筛选培养基中扩增,采用免疫细胞化学方法检测NSC特异性标志物Nestin的表达.结果 所分离得到的ESC的AKP染色阳性,Oct-4表达阳性,符合ESC的一般特性.ESC经RA初步诱导,NSC选择性培养基筛选培养7d后,形成大量神经球样结构,所形成的神经球样结构呈Nestin抗原阳性.结论 体外分离得到的昆明小鼠ESC经RA诱导后,再经选择性培养基筛选培养可获得大量NSC,有望为神经系统损伤及神经变性疾病提供新的治疗途径.     

全基因组关联分析散发性阿尔茨海默病的研究进展

阿尔茨海默病（AD）的发生和发展涉及到复杂的环境因素-遗传因素的相互作用,目前尚无有效的治疗药物。利用全基因组关联分析对AD的风险基因进行遗传学研究可以为揭示这一复杂疾病的致病机制和为指导药物开发提供重要的信息。本文从AD的遗传学研究现状、风险基因及其AD的生物学关联性、遗传学研究对治疗阿尔茨海默病的提示等方面进行综述。     

失眠的全基因组关联分析研究进展

<正>失眠障碍(insomnia disorder, ID)主要表现为睡眠起始、维持困难或睡眠质量差,同时伴有一定的功能损害。世界卫生组织定义失眠为一周内至少有三个晚上出现入睡困难和(或)难以维持睡眠,或者有无法恢复精力的睡眠引起的不适,伴随白天的苦恼或影响社会功能,病程持续1个月以上。流行病学调查显示,我国失眠的发生率约为45.4%,严重的睡眠缺少不仅会对个体的健康及社会功能造成损害,而且容易导致各种意外事故,给社会带来沉重负担^[1]。     

CNV-seq技术在辅助生殖技术妊娠流产胚胎染色体异常中的研究价值

目的 分析低深度全基因组测序技术（CNV-seq）在辅助生殖技术（ART）妊娠流产胚胎染色体异常中的研究价值。方法 选定南阳市第一人民医院2020年6月至2022年6月接诊的98例ART妊娠流产患者,采集所有患者流产物100 mg,以CNV-seq技术检测胚胎染色体情况,同时进行染色体G显带核型分析,比较CNV-seq检查结果与核型检查结果,分析孕妇既往流产次数、孕周、年龄与染色体异常发生率的关系。结果 98例患者共检出染色体异常70例,染色体异常率为71.43%,以常染色体重排或缺失、45, X染色体异常最为常见,异常率为14.29%。其次是10三体,占12.86%;13三体,占11.43%;47, XYY,占10.00%;21三体,占10.00%;3三体,占8.57%;2三体,占5.71%;22三体,占4.29%;16三体,占2.86%;8三体,占2.86%;47, XXX,占2.86%。染色体异常发生率自然流产次数≥3次者（90.00%）高于自然流产次数<3次者（66.67%）(P<0.05)。孕周≥12周者染色体异常发生率（57.14%）低于孕周<12周者（8...     

自发性早产肝功能检测指标全基因组关联分析

目的 探究自发性早产孕妇全基因组范围内单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)与肝功能检测指标之间的联系。方法 纳入2018年8月～2020年10月在上海国际和平妇幼保健院成功分娩的344例自发性早产孕妇,利用PLINK和MAGMA软件针对孕妇DNA基因分型数据和肝功能检测指标数据进行全关联研究。结果 验证了DNAJB3基因、UGTA1基因簇与中国人群血液中的总胆红素相关,基因ABO与中国人群血液中碱性磷酸酶相关。在中国早产孕妇人群中发现基因MROH2A、ATG16L1与总胆红素的关联,基因ATP8B1、MICAL3、PKHD1、EDAR与早产孕妇人群血液中的γ-谷氨酰转肽酶相关,基因SMAD6、ZNF883、LAMA2与早产孕妇人群血液中的天冬氨酸氨基转移酶相关。另外发现一些基因与自发性早产和肝功能检测指标同时相关。结论 中国人群中肝功能检测指标的遗传具有群体差异性,部分基因与自发性早产和肝功能检测指标均显著相关,但其影响机制有待于进一步研究。     

一株肠致病性大肠杆菌的全基因组序列分析

目的 分析并找出肠致病性大肠杆菌Deng(Enteropathogenic Escherichia coli Deng,EPEC Deng)的全基因组序列特点.方法 EPEC Deng来源于我国婴幼儿腹泻患者的粪便标本,菌株采用诊断血清鉴定血清型,通过自动细菌鉴定仪,使用微量肉汤法进行药敏试验.进一步提取细菌总DNA,构建测序文库,通过Illumina 2000仪器测序,然后利用多引物PCR等方法进行补缺口及拼接,最终获得完整的全基因组.采用相关软件获得基因序列,通过对比已知的蛋白数据库进行基因功能注释及生物信息学分析.结果 EPEC Deng菌株归属O119:H6,药敏结果显示该菌株对环丙沙星、左氧氟沙星、氨苄西林及氨苄西林/舒巴坦耐药,对其余的抗菌药物均敏感.EPEC Deng基因组包含5 233 046 bp,GC含量50.48％.基因组通过注释后总共有5 347个编码蛋白序列,80个tRNA的编码基因,以及22个完整的rRNA基因编码的操纵子.EPEC染色体基因组中含有致病岛,大小约为40Kb左右,与数据库中的一个37Kb的致病岛(AF200363.1)序列极为相似,相似度达到99％.结论 完成了肠致病性大肠杆菌基因组精细测序分析,PAI是EPEC致病的关键,为进一步研究菌株的进化关系提供了基因数据.     

胚胎干细胞分化为表皮样细胞的基因表达谱差异研究

 [摘 要] 目的：用全基因表达谱芯片技术筛选小鼠胚胎干细胞（ESC）定向分化为表皮样细胞(Epidermal-like cells, ELC)的差异表达的基因并对其进行分析,以进一步阐明ESC分化为ELC的分子机制。方法：利用人羊膜建立体外诱导体系,将小鼠ESC诱导定向分化为ELC,做3次生物学重复,分别取未分化的ESC和诱导分化的ELC提取总RNA进行扩增、Cy3标记,与NimbleGen 135k 小鼠全基因表达谱芯片（含44170个基因）杂交,荧光扫描,筛选出差异表达基因,并进行GO分析和pathway分析,用实时定量PCR对结果进行验证。结果：芯片筛选结果显示,分化后的ELC与ESC间的差异表达的基因多达4856个（Cut off：2）。基因本体（Gene Ontology,GO)分析显示与生物学过程（Biological Process,BP）相关的差异表达基因最多的是细胞过程（cellular process,CP）,1931个;与亚细胞组分（Cellular Component, CC）相关的差基因中最多的是细胞和细胞组分（Cell, Cell part）相关基因,2391个;与分子功能（Molecular Function, MF）相关的差异基因中最多是的结合功能(binding)基因,1869个。Pathway分析显示,与DNA复制（DNA replication）通路相关的差异基因有23个;与蛋白酶体（Proteasome）通路相关的24个;剪接体（spliceosome）通路相关有47个;细胞周期（Cell cycle）相关的有44个。结论：ESC体外诱导定向分化为ELC过程中,基因表达谱发生了巨大的变化,提示细胞分化是一个众多基因参与的复杂的生物学过程,这些基因在分化过程所起的作用和作用机制尚需大量的实验研究阐明。     

Expansive effects of aorta-gonad-mesonephros-derived stromal cells on hematopoietic stem cells from embryonic stem cells

Background Hematopoietic stem cells (HSCs) give rise to all blood and immune cells and are used in clinical transplantation protocols to treat a wide variety of refractory diseases, but the amplification of HSCs has been difficult to achieve in vitro. In the present study, the expansive effects of aorta-gonad-mesonephros (AGM) region derived stromal cells on HSCs were explored, attempting to improve the efficiency of HSC transplantation in clinical practice.Methods The murine stromal cells were isolated from the AGM region of 12 days postcoitum (dpc) murine embryos and bone marrow（BM）of 6 weeks old mice, respectively. After identification with flow cytometry and immunocytochemistry, the stromal cells were co-cultured with ESCs-derived, cytokines-induced HSCs. The maintenance and expansion of ESCs-derived HSCs were evaluated by detecting the population of CD34+ and CD34+Sca-1+cells with flow cytometry and the blast colony-forming cells (BL-CFCs), high proliferative potential colony-forming cells (HPP-CFCs) by using semi-solid medium colonial culture. Finally, the homing and hematopoietic reconstruction abilities of HSCs were evaluated using a murine model of HSC transplantation in vivo.Results AGM and BM-derived stromal cells were morphologically and phenotypically similar, and had the features of stromal cells. When co-cultured with AGM or BM stromal cells, more primitive progenitor cells (HPP-CFCs ) could be detected in ESCs derived hematopoietic precursor cells, but BL-CFC’s expansion could be detected only when co-cultured with AGM-derived stromal cells. The population of CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells were expanded 3 times,but no significant expansion in the population of CD34+Sca-1+ cells was noted when co-cultured with BM stromal cells. While both CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells and CD34+Sca-1+ cells were expanded 4 to 5 times respectively when co-cultured with AGM stromal cells. AGM region-derived stromal cells, like BM-derived stromal cells, could promote hematopoietic reconstruction and HSCs’ homing to BM in vivo.Conclusions AGM-derived stromal cells in comparison with the BM-derived stromal cells could not only support the expansion of HSCs but also maintain the self-renewal and multi-lineage differentiation more effectively. They are promising in HSC transplantation. Chin Med J 2005; 118(23):1979-1986     

Propofol inhibits neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells in vitro

Propofol （2, 6-diisopropylphenol） is a general intravenous anesthetic which plays roles in the central neural system by binding GABAA receptors （GABAARs） and enhancing the chloride channels of the neurons.1 Previous studies mainly focused on the effects of anesthetics on mature neurons, but little attention was paid to their role in early neural differentiation or neural stem cells. Therefore, in the present study, we choose the widely used mouse embryonic cells （ES） cells as the model to investigate the potential effect ofpropofol on neuronal differentiation.     

低氧对小鼠胚胎干细胞诱导分化成心肌细胞的影响

目的探讨在胚胎干细胞诱导分化过程的不同阶段进行低氧处理对分化心肌细胞的影响。方法建立胚胎干细胞向心肌细胞诱导分化的实验方法,在分化过程的不同阶段采取低氧（氧浓度为4%）处理,并设立常氧组（约为20%）作为对照,用免疫荧光鉴定分化后的心肌细胞,以流式细胞术检测低氧对分化心肌细胞的增殖、分化、凋亡的影响。结果分化细胞经免疫荧光检测显示,部分细胞呈α辅肌动蛋白阳性（红色）、心肌肌钙蛋白I阳性（绿色）;分化细胞经流式检测显示,与常氧组相比,悬滴低氧组α-actinin阳性细胞和cTnI阳性细胞的比率分别提高了12.55%（P〈0.01）和6.11%（P〈0.05）,悬浮低氧组凋亡比率与常氧组相比明显提高（P〈0.01）,悬滴低氧组处于S期的细胞比率与常氧组相比明显降低（P〈0.01）。结论在胚胎干细胞向心肌细胞的定向诱导分化过程中,采用悬滴阶段低氧处理,使心肌特异性蛋白阳性细胞比率提高,细胞凋亡率稳定,细胞增殖能力因细胞分化成熟而有所降低,为低氧处理的最佳方案。     

小鼠骨髓间充质干细胞、骨髓单核细胞和胚胎成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞的效率比较

目的比较小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)、小鼠骨髓单核细胞(BM-MNCs)和小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)重编程为诱导性多能干细胞(iPS细胞)的效率。方法用慢病毒LV-ef1a-mOct4-IRES-EGFP、LV-ef1a-mSox2-IRES-EGFP、LV-ef1a-mKlf4-IRES-EGFP和LV-ef1a-mc-Myc-IRES-EGFP感染BMSCs、BM-MNCs和MEFs,通过计算碱性磷酸酶染色阳性克隆数比较这3种细胞重编程为iPS细胞的效率。用胚胎干细胞表面标记检测、胚胎干细胞内源基因检测、拟胚体形成实验和畸胎瘤形成实验验证重编程获得的iPS细胞的多能性。结果起源于小鼠BMSCs、BM-MNCs及MEFs的3种iPS细胞均能形成边缘光整的致密克隆,可表达干性基因Nanog、Rex-1、SSEA-1,并能在体内外分化为三胚层组织。但是BMSCs来源的碱性磷酸酶阳性克隆数低于BM-MNCs和MEFs来源的克隆数。结论小鼠BMSCs、BM-MNCs及MEFs均可重编程为iPS细胞,但BMSCs重编程为iPS细胞的效率低于BM-MNCs和MEFs。     

Very small embryonic like（VSEL） stem cells

It is generally accepted that adult bone marrow(BM) contains both hematopoietic stem cells(HSCs) and mesenchymal stem cells (MSCs). Recently, a rare population of stem cells different from HSCs and MSCs were identified in murine BM and human cord blood (CB), named as very small embryonic like(VSEL) stem cells. These cells are tiny round and CXCR4 Sca-1 Lin- CD45-, expressing SSEA-1/4, Oct-4 and Nanog, which have potent of differentiation into all three germ-layer lineages, such as cardiomyocytes, neural and pancreatic cells.     

体外诱导人胚胎干细胞定向分化为神经干细胞

目的:探讨体外定向诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)生成高纯度神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法.方法:模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境,分三阶段诱导hESCs定向生成NSCs.形态学观察结合免疫荧光细胞化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志和神经干细胞标志;NSCs分化实验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测.结果:体外培养的hESCs在胚胎成纤维细胞饲养层上连续传代培养50代,仍保持SSEA-4,TRA-1-81阳性,表达Nanog基因,流式细胞术检测SSEA-4阳性表达率为83.44%;经三步法最终可诱导形成纯度高达90%以上的nestin阳性细胞,表达nestin基因,流式细胞术检测nestin阳性表达率为89.38%;诱导生成的细胞反复传代,仍表现为nestin阳性,并可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞.结论:模拟体内神经分化过程的三步诱导法,可诱导hESCs生成较高纯度的NSCs,并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力.     

敲除PKD1基因的小鼠胚胎干细胞的建立

目的：通过PKD1基因打靶载体的胚胎干细胞转染，药物筛选以及分子鉴定，获得发生同源重组的胚胎干细胞克隆，为产生PKD1基因缺陷小鼠品系准备条件。方法：体外培养小鼠胚胎干细胞，用电穿孔的方法进行PKD1基因打靶载体的转移，并用G418进行筛选培养，得到阳性克隆后，进一步扩大培养，抽提胚胎干细胞的基因组DNA，采用DNA印迹法进行分子鉴定。结果：经G418筛培养得到192个阳性在隆，分子鉴定获得2个发生同源重组的胚胎干细胞克隆。结论：鉴定得到的2个同源重组胚胎干细胞克隆，为进一步建立PKD1基因缺陷小鼠奠定了基础。     

卵巢内生殖干细胞的研究进展和应用

对于哺乳动物卵巢中生殖干细胞(germline stem cells,GSCs)是否存在一直有争议,以往的研究表明哺乳动物卵巢中卵泡是不可再更新的,但最近基于小鼠的研究对其提出了异议,并通过大量实验来证实。最新的研究更从人类的卵巢中分离出生殖干细胞,这一发现对生殖干细胞进一步的研究和未来的临床应用提供了动力。因此本文对生殖干细胞的研究进展及应用做一综述。     

人类胚胎干细胞向造血细胞的自发分化

目的 研究人类胚胎干细胞自发向造血分化过程中造血干细胞和成熟血细胞标志出现时间,这将为胚胎干细胞定向诱导分化提供依据.方法 将我所建立的人类胚胎干细胞系(chESC3)自发分化形成拟胚体,RT-PCR方法检测不同时间点造血相关基因KDR、Bmil、Scl、gata2等的表达、流式细胞术检测6、8、10、12 d造血干细胞标志CD34表达,并通过造血集落培养方法检测这些时间点造血集落形成能力,最后将拟胚体制备石蜡切片,免疫细胞化学检测10、12、15、18 dCD45阳性阳性细胞数.结果 造血干细胞早期基因KDR、Bmil在hESCs中有表达,同时该基因随着拟胚体培养时间的延长,在第4～6天开始上调表达;造血干细胞标志性基因Scl,gata2在6～8 d开始表达,并且维持高表达到12 d.流式细胞术检测不同时间点hEBs中CD34阳性细胞数,发现其随时间的延长有增多的趋势,6、8、10、12 d分别为(1.4±0.4)%、(3.4±1.3)%、(5.5±2.2)%、(5.1%±1.7)%;6、8、10、12 d的拟胚体细胞进行集落培养检测形成的集落数在每105个拟胚体细胞中分别为0、7±2、37±11、89±29,P<0.01;集落细胞表达CD45,瑞士吉姆撒染色,可以检测到分叶核粒细胞;免疫细胞化学法对10、12、15、18 d拟胚体进行切片染色,发现在这4 d中可以明显观察到CD45阳性细胞的出现,并随时间的延长而数量增多,分别为:0、40.5±15.09、178.6±55.89、253.0±52.04,P<0.05.结论 在自发向造血细胞分化的过程中经历了 3个阶段:hESCs向胚层特异性细胞分化(前6～8 d);造血干祖细胞扩增期(第8～12天);成熟血细胞大量出现期(15 d以后).