慢病毒介导的RNA干扰沉默Slug基因对结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术沉默Slug基因,观察对结肠癌HCT116细胞增殖和周期的影响。方法:构建Slug基因特异性siRNA慢病毒载体,感染结肠癌HCT116细胞,设立空白对照组、阴性对照组及SlugsiRNA三组,应用Real-time PCR和Western blot方法分别从基因和蛋白质水平检测各组干扰质粒对Slug基因的干扰效果,MTT法检测Slug基因在siRNA作用下的细胞增殖率,流式细胞仪检测细胞凋亡周期变化情况。结果:转染Slug siRNA后,结肠癌HCT116细胞中Slug基因mRNA和蛋白表达明显受到抑制(P<0.05);MTT检测,干扰组细胞增殖水平明显低于阴性对照组;流式细胞仪检测细胞G1期细胞百分比(52.3±0.6)高于阴性对照组(45.1±0.3,P<0.05)。结论:Slug siRNA能明显下调靶基因Slug的表达,在体外可抑制结肠癌HCT116细胞的生长并促进其凋亡。     

E盒锌指结合蛋白1基因沉默抑制结肠癌HCT116细胞增殖并促进其凋亡

目的使用针对E盒锌指结合蛋白1(ZEB1)的siRNA在结肠癌HCT116细胞中下调ZEB1的表达,研究其对HCT116细胞增殖和凋亡的影响。方法根据人ZEB1的mRNA序列设计并合成2对针对ZEB1的siRNA,瞬时转染HCT116细胞后,利用实时荧光定量PCR,Western blot法分别在mRNA和蛋白水平检测siRNA对ZEB1的抑制效果;利用MTT法检测细胞增殖;AnnexinⅤ-FITC/PI染色结合流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果与对照组相比,针对ZEB1的siRNA可在mRNA和蛋白水平有效抑制ZEB1的表达,ZEB1的表达下调可有效抑制HCT116细胞的增殖,并促进细胞凋亡。结论 ZEB1对结肠癌细胞的生存和增殖具有重要作用,可能参与结肠癌的发生发展过程。     

AEG1蛋白在结肠癌细胞中表达异常及其调控IL-6/STAT3通路影响结肠癌增殖和凋亡的机制研究

目的探讨星形细胞上调基因1(AEG1)在结肠癌细胞中的表达及其调控IL-6/STAT3通路影响结肠癌增殖和凋亡的潜在机制。方法 RT-qPCR检测人正常结肠黏膜上皮细胞株NCM460和结肠癌细胞株SW480、HCT116中AEG1 m RNA表达,Western blot实验检测AEG1蛋白表达。将结肠癌SW480细胞随机分为5组:对照组、SH5-07处理组、si-NC组(siRNA干扰对照组)、si-AEG1组(siRNA干扰AEG1组)和si-AEG1+IL-6组,MTT法检测各组细胞增殖活性,流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,Western blot检测各组细胞中IL-6、STAT3、p-STAT3蛋白表达。结果与NCM460细胞相比,结肠癌SW480、HCT116细胞中AEG1 mRNA和蛋白表达均升高(P0.05);与si-NC组比较,si-AEG1组结肠癌SW480细胞增殖活性降低(P0.05),细胞凋亡率升高(P0.05),细胞中IL-6、STAT3、p-STAT3蛋白表达水平降低(P0.05);与对照组比较,SH5-07组结肠癌SW480细胞增殖活性降低(P0.05),细胞凋亡率升高(P0.05);与si-AEG1组比较,si-AEG1+IL-6组结肠癌SW480细胞增殖活性增强(P0.05),细胞凋亡率降低(P0.05)。结论在结肠癌细胞中干扰AEG1的表达,能通过抑制IL-6/STAT3信号通路进而抑制结肠癌细胞增殖并诱导细胞凋亡。     

miR-375对人结肠癌细胞株HCT116活性、细胞周期及凋亡的影响

目的:探讨微小RNA-375(microRNA-375,miR-375)对人结肠癌细胞HCT116活性、细胞周期及凋亡的影响。方法:Real-time PCR检测不同结直肠癌细胞中miR-375的表达情况。脂质体转染法将miR-375模拟物(mimics)转入HCT116细胞,用real-time PCR法检测miR-375及AEG-1 mRNA的表达情况;MTT法检测细胞活性的改变情况;流式细胞技术检测miR-375对细胞凋亡及细胞周期的影响。结果:Real-time PCR结果显示HCT116在4个结直肠癌细胞株中miR-375的表达量最低;miR-375 mimics组中miR-375表达量较对照组明显上调;miR-375高表达可以显著抑制AEG-1 mRNA的表达水平。miR-375 mimics组细胞活性明显受到抑制,同时细胞凋亡率明显增加,G1期所占细胞数增加,而S期所占细胞数减少。结论:miR-375可以抑制结肠癌HCT116细胞的活性,介导细胞周期阻滞并促进其凋亡。miR-375作为一种抑癌因子,在结肠癌中可能通过抑制AEG-1发挥抑癌作用。     

siRNA对卵巢癌细胞周期及EGFR表达的影响

目的体外构建编码人类表皮生长因子受体（EGFR）的小干扰RNA（siRNA）的质粒表达载体,观察其对卵巢癌Skov-3细胞EGFR的特异性抑制作用及对细胞凋亡和周期的影响。方法构建pSilencer-EGFR siRNA真核基因表达载体,采用脂质体介导的方法将其转染到卵巢癌细胞株Skov-3,实验分为以下3组：空白对照组（未经转染的人卵巢癌Skov一3细胞）、非特异性转染组（转染非特异性质粒载体）及特异性转染组。用RT-PCR的方法检测mRNA水平的变化,用免疫荧光法检测EGFR蛋白水平的变化,流式细胞仪检测其对卵巢癌细胞周期及凋亡的影响。结果成功构建pSilencer—EGFR siRNA真核基因表达载体。psiRNA—EGFR质粒明显下调Skov-3细胞中EGFR的表达,阻断细胞周期在G1期,促进细胞凋亡。结论重组质粒psiRNA—EGFR能有效地抑制Skov-3细胞内EGFR的表达、抑制细胞增殖,其抑制机制可能与引起细胞周期再分布、降低S期细胞比例和促进细胞凋亡有关。     

miR-144靶向PIK3CD基因影响结直肠癌细胞增殖和细胞因子表达的作用机制

目的:探究miR-144与磷脂酰肌醇-3肌酶催化亚基δ(PIK3CD)的靶向关系及其影响结直肠癌(CRC)细胞增殖和免疫功能的作用机制。方法:RT-qPCR和Western blot检测CRC肿瘤组织以及HCT116细胞中miR-144和PIK3CD表达水平的变化。miRcode在线预测miR-144和PIK3CD的靶向关系,使用双荧光素酶实验进行验证。将miR-144模拟物、抑制剂和PIK3CD siRNA分别转染至HCT116细胞后,RT-qPCR和Western blot检测miR-144以及PIK3CD mRNA和蛋白表达水平的变化,MTT法检测细胞增殖能力的变化,ELISA法检测TNF-α和s IL-2R表达水平的变化。结果:在CRC肿瘤组织和HCT116细胞中,miR-144表达下调,PIK3CD表达上调。PIK3CD siRNA和miR-144模拟物能够促使PIK3CD mRNA和蛋白表达下调,抑制HCT116细胞增殖,同时促进TNF-α和s IL-2R表达下调; miR-144抑制剂作用与之相反。结论:miR-144通过靶向PIK3CD基因抑制HCT116细胞增殖及其免疫功能。     

OPN siRNA慢病毒载体的构建及其对大肠癌细胞增殖的抑制作用

目的构建OPN-siRNA的慢病毒载体,探讨其对结肠癌SW480细胞增殖的调节作用。方法设计合成针对OPN的siRNA序列,退火形成双链DNA并克隆到pSicoR质粒后,包装重组慢病毒。应用Real-time PCR及Western blot检测病毒刺激SW480细胞后OPN的mRNA和蛋白的表达水平,应用MTT法检测慢病毒对SW480细胞增殖的调节作用。结果成功构建了携带OPN-siRNA的重组慢病毒。该重组慢病毒可使SW480细胞内OPN的mRNA和蛋白的表达降低,LV-siRNA-OPN慢病毒对SW480细胞增殖有明显的抑制作用(P<0.05)。结论成功构建的LVsiRNA-OPN慢病毒可以有效抑制SW480细胞内OPN的mRNA和蛋白表达,并抑制SW480细胞的增殖。     

靶向XBP1S的RNA干扰质粒对细胞增殖的影响

目的 构建靶向人XBP1S的siRNA真核表达载体(pSUPER-XBP1S)并观察其对人HeLa细胞和HepG2细胞增殖能力的影响.方法 设计并合成针对XBP1S基因的siRNA,退火成互补双链后克隆至真核表达载体pSUPER构建重组质粒,并将其转染入HeLa细胞和HepG2细胞中.采用RT-PCR检测转染前后XBP1S在HeLa细胞和HepG2细胞中的转录,Western印迹检测转染前后XBP1S蛋白的表达;MTT法、细胞计数检测重组质粒对HeLa细胞和HepG2细胞增殖能力的影响.结果 重组质粒能有效地抑制HeLa细胞和HepG2细胞中XBP1S基因的转录和表达;转染HeLa细胞和HepG2细胞后,细胞增殖抑制率及细胞增殖数与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建了靶向人XBP1S的siRNA表达载体pSUPER-XBP1S,并且有效的抑制了HeLa细胞和HepG2细胞中XBP1S的转录和表达,有效抑制了细胞的增殖能力.     

阿司匹林与氟尿嘧啶协同抑制结肠癌细胞生长增殖的机制研究*

 目的：检测阿司匹林与氟尿嘧啶协同抑制结肠癌细胞生长增殖的能力及相关作用机制。方法：将体外培养的结肠癌细胞分为4组：空白对照组、阿司匹林组、氟尿嘧啶组和阿司匹林+氟尿嘧啶组,采用MTT法检测阿司匹林和氟尿嘧啶抑制结肠癌细胞增殖的效果,采用Hoechst 33258染色、caspase活性检测和流式细胞术检测研究药物诱发凋亡的作用及机制,采用real-time PCR和Western blotting方法检测药物对凋亡相关蛋白表达的调控作用。结果：氟尿嘧啶有效抑制HCT116和SW620结肠癌细胞增殖,且低浓度阿司匹林具有协同抑制的效果。氟尿嘧啶诱发HCT116细胞核出现明显的凋亡形态,caspase酶活性增高及sub-G1期比例增加。阿司匹林协同作用明显提高HCT116细胞凋亡的比例和caspase酶活性。此外,低浓度阿司匹林可以显著增强氟尿嘧啶抑制Bcl-2 mRNA及蛋白表达的效果。结论：阿司匹林和氟尿嘧啶具有协同抑制结肠癌细胞生长增殖的效果,且主要通过诱发细胞凋亡发挥作用。     

MIF激活lncRNA-ZEB1-AS1/miR-200b信号通路促进结肠癌增殖和转移作用研究北大核心CSCD

目的:探讨巨噬细胞移动抑制因子(MIF)在结肠癌中发挥的作用及其可能的调控机制。方法:qRT-PCR检测MIF在结肠癌组织和癌旁组织中的表达及其对结肠癌患者预后的影响;qRT-PCR和免疫荧光检测MIF在结肠癌细胞HCT116和正常肠上皮细胞HIEC-6中的表达;si-RNA沉默MIF在HCT116细胞中的表达,CCK-8、Transwell和细胞划痕实验观察HCT116细胞增殖和迁移能力的变化,同时检测长链非编码RNA锌指E-盒结合同源异形盒1-反义链1(lncRNA-ZEB1-AS1)表达;starBase数据库预测分析lncRNA-ZEB1-AS1和miR-200b间的关系,双荧光素酶进行验证;分别过表达lncRNA-ZEB1-AS1和沉默miR-200b后检测HCT116增殖能力变化。结果:MIF在结肠癌组织中的表达显著高于癌旁组织;MIF在HCT116细胞中表达显著高于HIEC-6细胞。靶向沉默MIF表达后,HCT116细胞增殖和转移能力降低,且lncRNA-ZEB1-AS1表达随着MIF沉默显著降低;starBase数据库预测及双荧光素酶标记实验结果表明lncRNA-ZEB1-AS1抑制miR-200b表达,且过表达lncRNAZEB1-AS1和沉默miR-200b均可逆转沉默MIF导致的细胞增殖能力下降。结论:MIF可能通过激活ZEB1-AS1/miR-200b信号通路促进结肠癌细胞的增殖和转移。     

特异siRNA下调卵巢癌H08910细胞NAC-1基因表达并抑制生长

 目的：研究小RNA干扰NAC-1 (Nucleus accumbens-1,Nac1 or NAC-1)基因表达对卵巢癌HO8910细胞增殖的影响。方法：设计、合成针对NAC-1基因的特异性小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）及阴性siRNA,并同时设立空白对照,然后用脂质体转染HO8910细胞。通过实时荧光定量RT-PCR 和Western印迹法分别检测转染前后HO8910细胞中NAC-1 mRNA和蛋白表达水平,MTT法和克隆形成实验检测细胞增殖率,FCM法检测细胞周期分布。结果：针对NAC-1基因的特异性siRNA均能抑制NAC-1 mRNA和蛋白的表达,其中NAC-1-siRNA-1的沉默效率最高。转染NAC-1-siRNA-1 48h后,HO8910细胞中NAC-1 mRNA和蛋白表达水平分别下调74%和81%,而且细胞增殖明显受到抑制,细胞周期被阻滞于G1期,与转染阴性siRNA 及未转染组比较,有显著性差异(P?0.05)。结论：NAC-1特异性siRNA能够有效沉默NAC-1基因表达,并显著抑制卵巢癌HO8910细胞增殖。     

转酮酶样蛋白1在人类鼻咽癌细胞生长增殖中的作用

目的:探讨转酮酶样蛋白1(TKTL1)在体外培养的人类鼻咽癌细胞生长增殖中的作用.方法:构建针对TKTL1 mRNA 的干扰RNA质粒,转染人类鼻咽癌细胞(CNE细胞系);检测转染前后CNE细胞中转酮酶活性的变化;实时定量RT-PCR检测转染前后CNE细胞转酮酶基因家族(TKT、TKTL1、TKTL2)mRNA表达水平的变化;通过流式细胞术和MTT实验检测转染前后CNE细胞增殖和细胞周期的改变.结果:实验组CNE细胞中转酮酶活性(携带有pEGFP-C1-U6/TKTL1)明显低于质粒对照组(携带有pEGFP-C1-U6/UC)和空白对照组(未转染细胞);实时定量RT-PCR结果显示转染前后CNE细胞中TKT和TKTL2 mRNA的表达水平均无显著差异.然而,实验组细胞中TKTL1的表达水平明显低于对照组,且实验组CNE细胞增殖明显被抑制,癌细胞被阻滞在G0/G1期.结论:转酮酶蛋白TKTL1在人类鼻咽癌细胞的生长增殖中起重要作用,TKTL1可能成为肿瘤治疗研究的新靶点.     

Bcl-2 siRNA表达载体的构建及生物活性鉴定

目的: 构建bcl-2特异性siRNA真核细胞表达载体，并初步观察其对膀胱癌细胞生长的影响。方法： 根据GenBank 提供的bcl-2 cDNA序列，设计双链小干扰RNA（siRNA），再转化为能表达其小发卡结构RNA（shRNA）的DNA 序列，并与含U6启动子的pGenesil-1质粒定向连接，构建真核表达载体pGenesil-1545、pGenesil-1555。经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。转染T24细胞，采用半定量RT-PCR观察重组质粒对bcl-2 mRNA表达的影响；用MTT法观察重组质粒对T24细胞体外生长的抑制作用。结果: 构建了bcl-2 siRNA的真核表达载体pGenesil-1545、pGenesil-1555，并经限制性内切酶酶切和DNA 测序证实与设计完全一致。转染T24细胞72 h后，RT-PCR显示bcl〖STBX〗-2〖STBZ〗基因表达下调接近80％；MTT发现T24细胞的体外生长受到明显抑制。结论: bcl-2的特异性siRNA真核细胞表达载体成功构建，有效沉默 bcl-2在膀胱癌细胞中的表达，抑制了癌细胞的生长。     

CARMA3基因敲减对结肠癌细胞HCT116生长和侵袭转移的抑制

目的:探讨CARMA3基因在人结肠癌细胞HCT116生长和侵袭转移中的作用及其机制。方法:选取高表达CARMA3的人结肠癌细胞株。应用慢病毒技术敲减CARMA3基因,puromycin筛选后构建稳定转染的HCT116-sh CARMA3细胞株。Real-time PCR和Western blot鉴定mRNA和蛋白表达的抑制情况。WST-1法和RTCA S16系统分析细胞增殖情况。集落形成实验观察集落形成。流式细胞术检测细胞周期。显微镜下观察上皮-间充质转化(EMT)形态变化。划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移与侵袭能力的改变。Western blot分析相关分子变化,探讨可能机制。结果:4株人结肠癌细胞株中HCT116细胞的CARMA3 mRNA和蛋白表达量最高,构建稳定沉默CARMA3的HCT116-sh CARMA3细胞株,其中HCT116-sh CARMA3-93细胞中CARMA3的mRNA和蛋白受抑制最明显,将其作为细胞模型。相比于对照组,HCT116-sh CARMA3-93细胞形态发生EMT逆转,其增殖、集落形成、迁移和侵袭能力明显下降(P0.01)。HCT116-sh CARMA3-93的G_0/G_1细胞所占比例明显升高,S期细胞比例相应下降(P0.05)。信号通路分子Bcl10和NF-κB表达明显下调,MALT-1变化不明显;细胞周期相关蛋白cyclin D1显著下调,cyclin A表达略有下降;侵袭转移相关分子MMP-2和MMP-9的表达下调,MMP-7未见改变,TIMP-1和TIMP-2的表达上调;EMT相关分子E-cadherin的表达水平升高,N-cadherin、Snail、Slug和Twist的表达水平呈不同程度降低。结论:CARMA3可通过改变细胞周期和侵袭转移分子的表达、调控EMT来影响结肠癌细胞HCT116的生长和侵袭转移。这可能与NF-κB信号通路发生改变有关。     

TLR4通过NF-κB信号途径对宫颈癌细胞增殖的影响

目的:研究Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)小干扰RNA(siRNA)是否通过NF-κB信号途径下调Bcl-2而抑制宫颈癌细胞的增殖。方法:设计并合成针对TLR4基因的3条特异性siRNA)及阴性siRNA,并同时设立空白对照,然后用脂质体LipofectamineTM2000转染细胞。通过半定量RT-PCR和Western印迹法分别检测转染前后He La细胞中TLR4 mRNA和蛋白表达水平,Western印迹法检测p65及Bcl-2蛋白表达水平,MTT法和平板克隆检测细胞增殖率,Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞周期。结果:3条针对TLR4基因的siRNA均能抑制TLR4的mRNA和蛋白表达,其中TLR4-siRNA-003的沉默效率最高。转染TLR4-siRNA-003 48 h后细胞中TLR4的mRNA和蛋白表达水平分别下调62%和89%,p65及Bcl-2蛋白水平明显下调,同时细胞增殖明显受到抑制,细胞凋亡率显著升高,细胞周期被阻滞于G1期。结论:TLR4特异性siRNA能够有效沉默TLR4基因表达,并通过NF-κB信号通路下调Bcl-2而显著抑制宫颈癌He La细胞的增殖。TLR4可能成为治疗宫颈癌的一个新靶点。     

小分子干扰RNA 沉默RhoGDI2 基因表达对结肠癌细胞增殖侵袭的影响及其机制

目的:应用小分子干扰RNA(siRNA)沉默RhoGDI2 基因的表达,初步探讨其对结肠癌细胞增殖、迁移能力的影响及可能的机制。方法:分别运用Western blot 和RT-qPCR 检测结肠癌细胞株RKO、HT29、SW620、SW480、HCT116 基因RhoGDI2 的表达情况。设计并合成RhoGDI2 siRNA 干扰序列,按照LipofectamineTM2000 转染方法将siRNA 干扰序列转染到目的细胞,设置实验干扰组、空白对照和阴性对照组;CCK-8 实验检测细胞增殖能力,细胞划痕试验和Transwell 实验检测细胞迁移、侵袭能力。结果:人结肠癌细胞株RhoGDI2 表达量由高到低依次是RKO、HT29、SW620、SW480、HCT116;RKO 细胞siRNA干扰后RhoGDI2 表达抑制率大于70%:实验干扰组、阴性对照组、空白对照组细胞增殖率分别是(0.683±0.013)、(0.866±0.088)、(0.905±0.008),P<0.05;实验干扰组细胞迁移、侵袭速率较对照组均减慢。沉默RhoGDI2 基因的表达,实验组细胞E-Cadherin 较对照组表达量高,Vimentin 蛋白表达下降。结论:结肠癌RhoGDI2 基因沉默可能通过抑制EMT 进程阻止肿瘤恶性生物学行为。     

Hsp701A的RNA干涉诱导K562细胞凋亡

目的：研究RNA干涉（RNAi）Hsp701A基因的表达及其诱导慢性粒细胞白血病（慢粒）细胞株K562的凋亡。方法：构建Hsp701A基因小干涉RNA（siRNA）的真核表达载体，转染K562细胞并证实RNAi的有效性。用MTF比色法、AnnexinV-FITC／PI染色和流式细胞术，分别检测K562细胞的增殖、凋亡和细胞周期。结果：构建了Hsp701A siRNA的真核表达载体。将其稳定转染K562细胞后，RNAi组细胞中Hsp701 ARNA和蛋白的表达水平明显下降。Hsp701A siRNA能抑制K562细胞增殖并诱导其细胞凋亡，将其阻滞于G1期。结论：RNAi Hsp701A基因诱导的表达有望成为一种新的慢粒的治疗策略。     

siRNA沉默AFP基因对肝癌细胞系 EGHC-9901 增殖的影响

 目的 建立稳定表达AFP-siRNA质粒的肝癌细胞系并探讨对其增殖的影响。方法 构建AFP-siRNA,用脂质体法转染肝癌细胞系,G418筛选4～5周,Western blot 及RT-PCR检测靶基因表达,分组：实验组,转染AFP-siRNA组;阳性对照组,转染空载体组;空白对照组,未处理组。MTT绘制生长曲线,平板克隆实验观察集落形成,流式细胞仪分析细胞周期。结果 成功建立稳定表达AFP-siRNA的肝癌细胞系,实验组表达AFP近乎完全抑制;实验组增殖能力显著低于空载体组;实验组＞75μm集落形成数19±2,低于空载体组62±6;实验组G1期细胞数较空载体组提高20％左右。 结论 成功建立稳定表达AFP-siRNA的肝癌细胞系,抑制AFP表达可使肝癌细胞发生G1期阻滞,明显抑制其增殖及集落形成能力。