建立Taqman探针实时荧光PCR检测食品中肠炎沙门氏菌的方法

目的利用Taqman探针实时荧光PCR检测食品中肠炎沙门氏菌。方法根据沙门氏菌属共有基因序列和肠炎沙门氏菌的特异序列分别设计2组引物及探针,运用实时荧光PCR进行特异性、灵敏性及模拟样品的检测实验。结果采用沙门氏菌属探针可检测到25种不同血清型沙门氏菌(共49株),而11株阴性对照菌株未得到扩增;利用肠炎沙门氏菌探针可从25种不同血清型的沙门氏菌(共49株)和11株阴性对照菌株中特异性的检测出全部15株肠炎沙门氏菌;以肠炎沙门氏菌系列稀释度菌液DNA为模板进行实时荧光PCR扩增,菌株的模板浓度与Ct值之间呈现良好线性关系,线性系数(R2)0.993,扩增效率87%,最低检测浓度260cfu/mL;分别接种肠炎沙门氏菌于四种样品进行模拟样品检测,实时荧光PCR检测结果与经典培养鉴定方法的检测结果相吻合。结论实时荧光PCR检测食品中肠炎沙门氏菌的方法特异性强、敏感度高,可应用于食品中肠炎沙门氏菌的检测。     

蓝谱食品安全检测试剂盒隆重上市

日前蓝谱公司推出两款食品安全检测试剂盒——沙门氏菌核酸检测试剂盒和军团菌核酸检测试剂盒。 沙门氏菌核酸检测试剂盒将预培养后的菌进行核酸提取,以沙门氏菌属保守的侵入性相关基因invA为靶基因设计引物进行环介导等温扩增,包括核酸提取和扩增步骤,能在1小时内特异性检测出食品中的沙门氏菌。     

应用PCR技术快速检测伤寒沙门氏菌

目的 研究伤寒沙门氏菌的快速检测方法.方法 采用PCR技术通过两对引物扩增伤寒沙门氏菌鞭毛抗原基因Ⅵ区一段特异性DNA片段及inv A和inv E DNA版段,并用其它致病菌作为对照.结果 仅伤寒沙门氏菌各出现一条特异性扩增带,与已知阳性对照相符,确定为阳性.结论 该PCR方法可用于伤寒沙门氏菌的快速检验,具有抗干扰性强、灵敏性高的特点.     

用聚合酶链反应检测伤寒患者血液中的伤寒沙门氏菌

作者报告了用扩增伤寒患者血液中伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白基因检测伤寒沙门氏菌DNA的聚合酶链反应(PCR)。用三种试验进行PCR。首先,扩增从沙门氏菌和其它细菌分离的DNA,以试验PCR产物的特异性;其次,扩增从伤寒沙门氏菌ATCC19430分离的连续稀释DNA,确定PCR的最低可测水平,第三,用从12例     

巢式聚合酶链反应检测伤寒沙门氏菌

本文采用扩增伤寒沙门氏菌鞭毛抗原基因Ⅵ区一段特异性片段的两对引物，用ＰＣＲ法检测伤寒沙门氏菌与非伤寒沙门氏菌，结果表明阳性符合率达１００％，且反应体系中达１０２ｃｆｕ／ｍｌ浓度时，伤寒沙门氏菌即可检出。检查伤寒确诊患者粪便标本４份，ＰＣＲ扩增均阳性。     

伤寒沙门氏菌扩增片断长度多态性——银染体系的建立

目的建立伤寒沙门氏菌AFLP—银染体系。方法对EcoRⅠ和MseⅠ两种限制性内切酶用量、酶切时间、连接产物及预扩增产物的稀释倍数等进行研究。结果建立了伤寒沙门氏菌AFLP—银染体系在20μl的酶切体系中,含基因组DNA 250ng,EcoRⅠ和MseⅠ各2.5U,37℃下酶切3h;21℃连接过夜;连接产物稀释10倍后进行预扩增;预扩增产物稀释50倍后再进行选择性扩增;选择性扩增完成后加等量Loading buffer,90℃变性3min,立即冰浴;在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析;银染法检测PCR产物。结论AFLP—银染体系有望在伤寒沙门氏菌的多态性研究和流行病学调查中发挥重要作用。     

3种食源性致病菌的多重PCR检测方法研究

目的建立一种快速、经济、实用的多重PCR方法,期望能同时检测3种常见致病菌。方法根据沙门氏菌的侵袭蛋白A（invasion protein A,invA）、志贺氏菌的侵袭性质粒抗原H基因（invasion plasmid antigen,ipaH）、副溶血性弧菌的不耐热肠毒素基因（thermolabile hemolysin,tlh）分别设计了3对引物,预计PCR扩增的目的片段依次为284、450、606bp。对单个基因PCR和单管多重PCR扩增进行特异性、敏感性试验以及优化反应体系,建立快速检测沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌的单管多重PCR方法。结果含沙门氏菌：42cfu/g,志贺氏菌：36cfu/g,副溶血性弧菌：116cfu/g的肉陷样品经过增菌、DNA提取、扩增、电泳,在16～18h内应用多重PCR体系能够检出。通过对10株目的菌和15株非目的菌检测,提示该体系特异性高。结论初步建立能快速,灵敏,特异地检测沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌的多重PCR体系,可以作为食物中毒病原菌检测的有效方法。     

巢式聚合酶链反应检测伤寒沙门氏菌H及Vi抗原基因的应用研究

应用巢式聚合酶链反应技术，通过两种引物（共四对）分别对伤寒沙门氏菌鞭毛Ｈ和Ｖｉ抗原基因扩增，并用非伤寒沙门氏菌作对照。实验表明，两种基因的扩增产物均是特异的，Ｈ抗原基因引物仅对伤寒沙门氏菌鞭毛抗原基因扩增，Ｖｉ抗原基因引物对伤寒沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌Ｖｉ抗原基因扩增，余均为阴性。扩增Ｖｉ抗原基因比扩增Ｈ抗原基因敏感，当反应体系中达０．５个菌细胞时，Ｖｉ抗原基因就可检出，而鞭毛抗原基因则需５个菌细胞。检测９２例伤寒患者血液标本，血培养阳性２８例（３０．４３％），巢式ＰＣＲ检测Ｖｉ抗原基因阳性３３例（３５．８６％），Ｈ抗原基因阳性３１例（３３．７０％）。伤寒发病早期，当机体伤寒特异性抗体尚处于低水平时，应用巢式ＰＣＲ检测Ｖｉ抗原基因，可提高伤寒的诊断率，使该病得到早期治疗     

聚合酶链反应结合斑点杂交技术检测伤寒沙门氏菌的临床应用研究

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增伤寒沙门氏菌鞭毛抗原基因Ⅵ区一段特异性的ＤＮＡ片断，再用地高辛标记探针与之杂交检测，并用非伤寒沙门氏菌作对照，结果仅伤寒沙门氏菌阳性。实验表明，当标本中伤寒沙门氏菌含量达１０ｃｆｕ／ｍｌ时，即可检出。在伤寒发病早期，当机体抗体水平尚处于低水平时，应用ＰＣＲ斑点杂交检测伤寒沙门氏菌可提高伤寒的诊断率；在伤寒病程后期，应用ＰＣＲ斑点杂交检测治疗后带菌状态具有重要价值。     

单核细胞增生李斯特氏菌快速检测方法建立

[目的]建立单核细胞增生性李斯特氏菌(Lm)快速检测(PCR)方法.[方法]用PCR特异性检测方法,根据Lm的inlA、 plcA、 plcB、 hlyA基因设计4对相应的引物,检测不同浓度Lm纯培养物、金黄色葡萄球菌和乙型副伤寒沙门氏菌标准菌株的纯培养物以及Lm模拟污染的牛奶样品.[结果]Lm扩增出4个相应的产物(分别为255bp、 129bp、 260bp、 234bp),金黄色葡萄球菌和乙型副伤寒沙门氏菌菌株均未扩增出特异性的片段,其中inlA基因最低检出限为25.5μg/ml,其他3对引物最低检测限达2.55μg/ml.对模拟污染的牛奶TSBYE增菌培养液用PCR检测,只扩增出3个相应基因的产物(plcA、 plcB、 hlyA).[结论]扩增plcA、 plcB、 hlyA基因的PCR法对Lm的鉴定具有特异性强、灵敏度高、速度快和易操作等优点,可用于食品的Lm的分离.     

Study on Identification of Salmonella in Textiles with LAMP-MALDI TOF MS

Objectives To establish a rapid analytical procedure for salmonella in textiles by LAMP in combination with MALDI TOF MS. The gene sequence invA of salmonella is specific to pathogenic strains. Based on its characteristic,a set of LAMP primer for salmonella is designed. If the amplification result is suspicious or positive,the strains are separated and the determination is rapidly performed through MALDI TOF MS technique. Methods About 70 reference strains closely related to the textiles and public health are selected to perform the specificity study(Salmonella enterica,Salmonella tyhimurium,Salmonella choleraesuis,Salmonella paratyphi A etc.); The bacterium solution of salmonella is diluted to different gradients for the sensitivity study. Results The results show this method is appropriately specific and sensitive,the limit of detection up to 4.6 CFU/mL. Conclusions The procedure is a new technique to detect salmonella in textiles.     

沙门菌属LAMP检测方法在食品卫生检验中的应用评价

目的探讨沙门菌属环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法在食品卫生检验中的应用价值。方法利用文献报道的LAMP检测方法和分离培养法分别对135份食品标本进行沙门菌检测,评价LAMP法和分离培养法的一致性。结果 LAMP方法检出14份食品标本沙门菌阳性,阳性率为10.4%,电泳和加荧光染料染色后均能判断结果;分离培养法检出6份食品标本沙门菌阳性,阳性率为4.4%。LAMP法检出阳性率高于培养法(P=0.021)。LAMP方法可在24 h内从食品中检测出沙门菌,而分离培养法检出沙门菌需要4~7 d,LAMP检测方法更快速。结论沙门菌属LAMP方法检测阳性率高于分离培养法,LAMP方法可用于食品中沙门菌的核酸检测。     

环介导等温扩增（LAMP）技术检测沙门菌属方法的建立

建立一种检测沙门菌属快速敏感的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）检测方法。针对沙门菌属侵袭蛋白（invA）基因序列的六个区域设计四条LAMP引物，65℃保温约60min，完成对沙门菌属的扩增，扩增产物经电泳和酶切鉴定。利用LAMP和普通PCR方法同时检测4株沙门菌和9株非沙门菌（对照组）来验证LAMP方法的特异性；将肠炎沙门菌菌液做一系列10倍稀释后用LAMP和PCR方法进行检测来比较两者敏感性。4株沙门菌扩增出LAMP特征性梯状条带，9株非沙门菌没有出现LAMP扩增，LAMP产物的特异性通过限制性内切酶得到了证实；LAMP检测沙门菌属的特异性与普通PCR相同，但其敏感性比普通PCR高10倍，LAMP检测沙门菌属的检测下限为10cfu／ml，PCR检测下限为100cfu／ml。LAMP检测速度相比PCR更快速，在60min内即可完成扩增反应。建立了一个快速、特异、敏感的沙门菌属LAMP检测方法。     

应用LAMP同时快速检测沙门菌和志贺菌的效果评价

目的探讨环介导等温扩增（LAMP）方法同时快速检测沙门菌和志贺菌的应用价值。方法通过通用增菌培养,应用LAMP方法和分离培养法分别对76份食堂从业人员粪便标本进行沙门菌和志贺菌检测。结果LAMP方法检出1份标本沙门菌阳性,阳性率为1．32％;分离培养法检出1份都柏林沙门菌,阳性率为1．32％;2种方法的检测结果一致。LAMP方法可在3h内检出沙门菌、志贺菌,而分离培养法需要3-5d,鼠伤寒沙门菌LAMP方法的灵敏度为170CFU／ml,福氏志贺菌LAMP方法的灵敏度为190CFU／ml,与常见的食源性致病菌均无交叉反应。结论与分离培养法相比,LAMP方法特异性高,灵敏度高,不需要特殊仪器,能够在简易的实验条件下,快速、简便地同时检测沙门菌和志贺菌,LAMP方法适用于基层疾病控制实验室开展沙门菌和志贺菌的快速筛查检测。     

环介导等温扩增技术在呼吸道感染病原体检测中的应用

目的 应用环介导等温扩增法(LAMP)对肺炎患者下呼吸道分泌物进行11种常见致病菌的核酸检测,探讨其临床应用价值.方法 收集福建省立医院2009-2010年呼吸科诊断为下呼吸道感染患者的合格痰标本289例,行LAMP方法检测,与痰培养结果比较,分析其灵敏性和特异性.结果 LAMP检测时间仅需2～3 h,明显短于痰培养;...     

三种乙型肝炎表面抗原检测方法在口岸体检中的应用评估

目的循证检验医学(EBLM)指导下,对电化学发光法(ECLIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、胶体金免疫层析法等3种乙型肝炎表面抗原(HBsAg)检测方法进行评价,为口岸出入境人员寻求最佳的快速HBsAg检测方法和检测程序提供科学依据。方法ECLIA、ELISA、胶体金免疫层析法检测40份(HBsAg)标准血清盘标本,以血清盘预期结果为标准,比较3种方法灵敏度、特异度、总符合率。同时应用成本最小化分析方法,分别计算3种方法的成本。结果在血清盘HBsAg检测中,ECLIA法的灵敏度、特异性和总符合率皆达100.0%,Kappa值为1.000;而ELISA法国产科华试剂灵敏度76.9%、特异性100.0%和总符合率85.0%,Kappa值为0.432;胶体金免疫层析法灵敏度34.6%、特异性100.0%和总符合率57.5%,经Kappa检验其值为0.216。成本最小化分析结果显示:ECLIA法成本20元,ELISA法(科华,国产试剂)成本3元,胶体金免疫层析法成本3元,ECLIA法成本最高。结论ECLIA方法适用于需评估免疫状态,为接种疫苗做准备的出国留学人员、出国商务人员、入境留学生、入境商务人员的HBsAg检测。ELISA国产试剂适用于出国劳务人员、海员等一般人群。胶体金免疫层析法适用于紧急事情人员和日常复查的检测。     

两种检测乙肝表面抗原方法的比较

目的了解两种检测乙型肝炎方法的优缺点,为实验室提供快速、准确的检验方法。方法先后采用胶体金免疫层析测试条法和做血清学检测乙型肝炎表面抗原,并将资料进行整理、分析。结果胶体金免疫层析法检出阳性250份,阳性率为54．82％;ELISA法检出阳性275份,阳性率为60.31％。两法检测结果的总符合率为94．52%。以ELISA法为常规法验证胶体金免疫层析法的敏感性,敏感性为90．91％,特异性为100％。结论胶体金免疫层析法敏感性较酶联免疫法(ELISA)差,认为检测HBsAg仍然以ELISA法为主。     

入境旱獭皮鼠疫危险陛及快速侦检实验研究

[目的]研究中蒙边境口岸入境旱獭皮感染鼠疫的风险性,建立实用于口岸的快速有效的入境旱獭皮鼠疫检测方法。[方法]采用反向间接血凝试验（RIHA）、聚合酶链反应（PCR）、胶体金和免疫层析（UCP）方法检测旱獭皮携带的鼠疫杆菌,并进行对比分析。[结果]检测样品8060份,反向间接血凝试验（RIHA）检出鼠疫F1抗原阳性120份,经复判阳性60份,阳性率0．74％;PCR方法检出阳性样品70份,阳性率0．87％;UCP检测到阳性样品45份,阳性率0．56％;胶体金快速试纸检测,未获得阳性结果。对新鲜旱獭皮样90份经过处理后进行细菌学检验,未发现阳性结果。经统计学处理,PCR与RIHA阳性率间差异无显著性（P〉0．05）;UCP与RIHA阳性率间差异有显著性（0．01〈P〈0．05）;PCR与UCP阳性率间差异有极显著性（P〈0．01）。重复性试验结果分别为：PCR100％;RIHA98．6％;UCP80％。[结论]采用的几种检测方法都揭示被检入境旱獭皮鼠疫抗原标志物呈现不同程度的阳性。PCR的检测结果灵敏性较好、特异性好,假阳性较少,漏检率较低,试验过程中对操作者要求较低,对旱獭皮样品不失为一种快速、准确、实用的检测方法。     

心肌肌钙蛋白I胶体金免疫层析法的建立

目的 心肌肌钙蛋白I (Cardiac TroponinI cTnI)胶体金免疫层析法(GICA)的建立。方法 从心肌组织中提取心肌肌钙蛋白I作为抗原,免疫新西兰大耳白家兔,制备出抗人心肌肌钙蛋白I抗体,并用胶体金标记cTnI抗体,采用免疫层析技术,建立了cTnI胶体金免疫层析法。结果 心肌肌钙蛋白I抗血清滴度达1:100 000,Ka=2.38×10⁹L/mol;心肌肌钙蛋白I胶体金免疫层析法:灵敏度为5 ng/ml;特异性:与心肌肌钙蛋白T,心肌肌钙蛋白C,激酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)均无交叉反应。结论 本方法特异性强、快速、简便,适于急性心肌梗死的早期诊断及科研工作需要,具有广泛应用前景。     

蚊虫携带登革病毒快速筛查方法的建立

[目的]研究一种适合现场使用的快速检测方法,用于对蚊虫携带登革病毒的初步筛查。[方法]采用双抗体夹心技术,建立上转换发光（UCP）免疫层析方法,筛查蚊体携带的登革病毒。[结果]该方法能在15min内对蚊虫携带的登革病毒进行快速筛查。[结论]建立的免疫层析方法简便、快速、敏感、特异,适合卫生检疫工作现场使用。