去甲基化处理对NK-92MI细胞系抑制性受体KIR表达的影响

为分析NK细胞系NK-92MI细胞中抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体（killercellimmnoglobulin-likere—ceptor,KIR）的基因启动子区的甲基化模式及去甲基化处理对基因表达的影响,探讨基因kir可能的表达调控机制,采用亚硫酸氢盐测序法检测NK-92MI细胞kir2DL1和kir2DL2／2DL3基因启动予区的甲基化水平,应用甲基化抑制剂5-氮胞苷处理NK-92MI细胞以诱导CpG岛去甲基化,RT—PCR方法检测其基因表达。结果显示：kir2DL1和kir2DL2／2DL3基因启动子区CpG二核苷酸甲基化频率依次在25％-88％、5％-80％之间;应用甲基化抑制剂5-氮胞苷可以诱导NK-92MI细胞重新表达kir2DL1基因,并使kir2DL1、kir2DL2和kir2DL3基因表达量增加。结论：启动子甲基化参与调控NK-92MI细胞基因kir表达。     

LRP15基因启动子区甲基化与其表达的关系

为了研究LRP15基因启动子区的甲基化状况及其与基因表达的关系,探讨LRP15基因的甲基化调控机制,采用甲基化特异性聚合酶链反应(MS—PCR)检测LRP15基因启动子区的甲基化状况,应用甲基化抑制剂-杂氮-2’-脱氧胞嘧啶(CdR)及去乙酰化酶抑制刑曲古抑菌素(TSA)诱导CpG岛去甲基化及组蛋白乙酰化,观察启动子区CpG岛甲基化与基因表达的关系。结果显示：白血病细胞系K562中LRP15基因启动子区呈高甲基化状态,并抑制了该基因的表达。单独应用或联合TSA应用CdR均可去除该基因启动子区的高甲基化状态,并诱导该基因的表达。这表明LRP15基因的表达受到启动子区甲基化的调控;该基因在K562细胞系中不表达与其启动子区高甲基化及组蛋白去乙酰化密切相关。结论：甲基转移酶抑制剂与去乙酰化酶抑制剂在白血病治疗中可能具有一定的价值。     

kir3dl1启动子表达调控载体的构建及其在K562细胞中的活性

为了分析kir3dl1基因核心启动子区域的功能并明确其表达调控机制，构建了kir3dl1基因启动子．荧光素酶报告载体，分析其在K562细胞中的活性。采用PCR方法从含有kit3dl1基因转录起始位点5’侧翼区的质粒中扩增kir3dl1基因核心启动子序列，插入经Bg1II和NcoI双酶切的荧光素酶报告载体pGL3-Basic；采用阳离子脂质体SuperFect包裹荧光素酶报告重组子转染K562细胞，应用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性；采用MTT法检测脂质体-DNA复合物对细胞存活率的影响。结果表明：成功构建了含有254bp的kir3dl1基因核心启动子序列的荧光素酶报告重组子3DL1-luc254并通过酶切及基因测序方法的鉴定；荧光素酶报告重组子在K562细胞中的荧光素酶活性明显高于阴性对照，且荧光素酶活性、相对活性持续3天无明显衰减。转染了3DLl-luc254报告质粒的K562细胞存活率在76％-92％之间。结论：成功构建了kir3dl1基因启动子-荧光素酶报告载体，本研究采用的转染系统能够有效地在K562细胞中进行基因转染，kir3dl1基因核心启动子在K562细胞中具有较高活性。     

5-氮杂胞苷对骨髓瘤细胞增殖抑制作用及对XAF1基因表达的影响

目的 探讨5-氮杂胞苷处理对骨髓瘤细胞系RPMI 8226和XG-7细胞中XAF1基因表达的影响及体外抗骨髓瘤作用的机制.方法 采用逆转录PCR和Western blot方法检测骨髓瘤细胞系RPMI 8226和XG-7细胞中XAF1基因和蛋白的表达.采用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测XAFI基因启动子CpG岛甲基化状态.采用0～5 μmoL/L 5-氮杂胞苷处理骨髓瘤细胞株.采用CCK-8比色法检测5-氮杂胞苷处理对骨髓瘤细胞增殖抑制作用.采用Annexin V/7-AAD染色流式细胞术检测细胞凋亡.结果 XG-7细胞不表达XAF1 mRNA及蛋白,RPMI 8226细胞表达XAF1 mRNA转录本1和2.XG-7和RPMI 8226细胞XAFl基因启动子CpG岛均存在过甲基化.XG-7和RPMI 8226细胞经2.5μmol/L 5-氮杂胞苷处理72 h后仅表达XAF1 mRNA转录本1并表达XAF1蛋白,并且XAF1基因启动子CpG岛甲基化程度降低.5-氮杂胞苷抗骨髓瘤作用呈时间和浓度依赖性.5-氮杂胞苷处理RPMI 8226和XG-7细胞48 h的IC50值分别为2.4 μmol/L和2.6 μmol/L.结论 骨髓瘤细胞中抑癌基因XAFI表达缺失或表达异常与XAF1基凶启动子CpG岛过甲基化有关.5-氮杂胞苷处理可以诱导XAF1 mRNA及蛋白表达.5-氮杂胞苷在临床上能达到的药物浓度下具有抗骨髓瘤作用,其作用机制是诱导骨髓瘤细胞凋亡.     

恶性血液病细胞株中IEX-1基因启动子区CpG岛甲基化状态的初探

本研究探讨基因IEX-1启动子区CpG岛甲基化状态的改变及其与恶性血液病发生的相关性.应用MSP的方法检测9种恶性血液病细胞系中IEX-1基因启动子区CpG岛甲基化状态,并把经M.sssI酶处理过的正常人外周血单个核细胞中IEX-1 CpG岛甲基化状态作为阳性对照,把正常人外周血单个核细胞中IEX-1 CpG岛甲基化状态作为阴性对照.结果显示:在NB4、Molt4.、Raji细胞系中IEX-1基因启动子区CpG岛呈高甲基化状态;在CA46、CEM、U937、K562、HL-60、Jurkat细胞系中IEX-1基因启动子区CpG岛呈部分甲基化状态;在正常人外周血单个核细胞中IEX-1基因启动子区CpG岛呈非甲基化状态;经M.sssI酶处理过的正常人外周血单个核细胞中IEX-1基因启动子CpG岛呈高甲基化状态.结论:IEX-1基因启动子区CpG岛甲基化状态的改变与恶性血液病有一定的相关性.     

转录因子E2F1调控KIR3DL1基因表达的分子机制

目的 研究转录因子E2F1对KIR3DL1基因启动子转录活性的影响,明确其调控KIR3DL1基因表达的分子机制.方法 采用PCR方法 从K562细胞基因组DNA中扩增突变型KIR3DL1基因启动子序列,将产物连接到pGL3-Basic荧光素酶载体,构建报告重组子;采用染色质免疫共沉淀方法 检测E2F1与KIR3DL1启动子在细胞内的结合;采用阳离子脂质体SuperFect包裹突变型和野生型KIR3DL1启动子-荧光素酶报告重组子,然后转染K562细胞,染色质免疫共沉淀方法 检测E2F1与重组子在细胞内的结合,双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性;将E2F1真核表达载体与野生型KIR3DL1启动子-荧光素酶报告重组子共转染K562细胞,双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性.结果 成功构建突变型KIR3DL1启动子-荧光素酶报告重组子,测序证实,在K562细胞KIR3DL1启动子区1个潜在的转录因子E2F1结合位点有1个自然发生的点突变(TTTGGCGC→TTCGGCGC);E2F1完全不能与K562细胞中突变型KIR3DL1启动子结合,但能与NK-92MI细胞中没有突变的野生型KIR3DL1启动子结合;突变型KIR3DL1启动子.荧光素酶报告重组子保留了部分与E2F1的结合能力,但其相对荧光素酶活性较野生型降低了50%;共转染E2F1真核表达载体使野生型KIR3DL1启动子-荧光素酶报告重组子的相对荧光素酶活性增加为对照组的2倍以上.结论 转录因子E2F1参与调控KIR3DL1基因转录激活,E2F1结合位点上CpG二核苷酸的数量和甲基化模式可能影响转录因子E2F1与靶序列的结合.     

5-氮杂胞苷体外抗骨髓瘤细胞增殖及诱导凋亡的初步研究

本研究探讨5-氮杂胞苷对骨髓瘤细胞株中XAFI基因表达的影响及体外抗骨髓瘤细胞增殖效率。采用逆转录PCR方法检测骨髓瘤细胞株RPMI8226和XG-7中XAF1基因的表达。采用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测XAF1基因CpG岛甲基化状态。采用0—5μmol／L5-氮杂胞苷处理骨髓瘤细胞株。采用CCK-8比色法检测5-氮杂胞苷处理对骨髓瘤细胞增殖抑制作用,应用Graphpad5．0软件分析5-氮杂胞苷对骨髓瘤细胞的生长抑制作用。采用AnnexinV／7-AAD染色流式细胞仪检测细胞凋亡。结果表明：XG17细胞不表达XAF1mRNA,RPMI8226细胞表达XAF1mRNA转录本1和2。XG-7和RPMI8226细胞株XAF1基因启动子CpG岛均存在过甲基化。XG-7和RPMI8226细胞株经2．5μmol／L5-氮杂胞苷处理72小时后仅表达XAF1mRNA转录本1,并且XAF1基因启动子CpG岛甲基化程度降低。5-氮杂胞苷抗骨髓瘤作用呈时间和浓度依赖性。5-氮杂胞苷处理48小时抑制XG-7骨髓瘤细胞株的IC50值为2．6μmol／L。1．0、2．0、2．5、5．0μmol／L浓度的5一氮杂胞苷处理XG-7细胞48小时后诱导细胞凋亡率分别为（34．3±8．0）％,（54．8±3．1）％,（64．1±3．4）％,（81．0±4．1）％。1．0—4．0μmol／L5-氮杂胞苷与1．0—4．0μmol／L亚砷酸联舍应用具有协同抗骨髓瘤细胞作用,联合指数均小于1．0。结论：骨髓瘤细胞中XAF1表达缺失与启动子CpG岛过甲基化有关。5-氮杂胞苷在临床上能达到的药物浓度下具有抗骨髓瘤作用,其作用机制是诱导骨髓瘤细胞凋亡,与亚砷酸具有协同抗骨髓瘤作用。     

表观遗传学调控急性B淋巴白血病细胞系表面脊髓灰质炎病毒受体表达

本研究探讨急性B淋巴白血病细胞表面脊髓灰质炎病毒受体表达是否受表观遗传学调控。利用重硫酸盐PCR测序方法比较去甲基化药物5-氮杂胞苷作用前后,急性B淋巴白血病细胞系RS4：11和SUP-B15中脊髓灰质炎病毒受体基因启动子区甲基化CpG百分比的变化,利用流式细胞分析技术和实时定量PCR技术在转录和翻译水平比较该基因表达的变化;比较组蛋白去乙酰化酶抑制剂作用前后,该基因在转录和翻译水平表达的变化。结果显示：急性B淋巴白血病细胞系RS4：11和SUP-B15中脊髓灰质炎病毒受体基因启动子区存在异常高甲基化的CpG岛,经去甲基化药物作用后甲基化CpG含量减低,而且该基因在转录及蛋白水平的表达也相应增加。经过组蛋白脱乙酰酶抑制剂作用后,该基因在转录和蛋白水平的表达也相应增加。上述两种药物合用与单药作用相比,并未进一步提高该基因在转录和蛋白水平的表达,提示异常甲基化和组蛋白去乙酰化这2种表观遗传学调控机制在抑制脊髓灰质炎病毒受体表达方面没有协同作用。结论：急性B淋巴白血病细胞系表面脊髓灰质炎病毒受体表达受表观遗传学调控,药物处理后能部分逆转异常的表观遗传学调节机制,使得该基因的表达部分恢复。     

胰腺癌细胞中Runx3基因表达及甲基化的研究

目的观察胰腺癌细胞中Runx3基因表达的情况,探讨其出现表达异常的机制。方法 (1)RT-PCR检测胰腺癌Panc-1、BxPC-3、AsPC-1细胞及正常胰腺组织中Runx3mRNA表达情况(2)Western blotting检测胰腺癌Panc-1、BxPC-3、AsPC-1细胞中Runx3蛋白表达情况;(3)甲基化特异性PCR(MSP)检测胰腺癌Panc-1、BxPC-3、As-PC-1细胞及正常胰腺组织中Runx3基因启动子区CpG岛的甲基化水平。结果 (1)Panc-1、BxPC-3、AsPC-1细胞中未检测到Runx3基因mRNA表达,而正常胰腺组织可检测到Runx3基因mRNA表达;(2)Panc-1、BxPC-3、AsPC-1细胞中未检测到Runx3蛋白表达;(3)Panc-1、BxPC-3、AsPC-1细胞中Runx3基因启动子区CpG岛均发生甲基化,而正常胰腺组织中Runx3基因启动子区CpG岛未检测到甲基化。结论胰腺癌细胞中存在Runx3基因失表达,其机制可能与Runx3基因启动子区CpG岛发生甲基化有关。     

脐血CD34＋细胞和外周血单个核细胞中HOXB4基因表达及其启动子区CpG岛甲基化状态的研究

本研究旨在通过检测脐血CD34＋细胞和正常人外周血单个核细胞（PBMNC）中HOXB4基因表达水平及其启动子区CpG岛的甲基化水平,初步探讨造血系统中HOXB4基因的表达水平与其启动子区甲基化的相关性。采用半定量RT—PCR检测脐血CD34＋细胞和PBMNC中HOXB4基因的表达,应用亚硫酸氢盐测序法检测这两种细胞中HOXB4基因启动子区CpG岛的甲基化位点。结果发现,CD34＋细胞高表达HOXB4,HOXB4基因启动子区CpG岛未发生甲基化;PBMNc不表达HOXB4,HOXB4基因启动子区在ATG上游-129bp的C碱基发生甲基化。结论：HOXB4基因启动子甲基化程度是其基因表达水平的负性调节机制之一。HOXIM在CD34＋细胞中的高表达与其基因启动子低甲基化有关,而HOXB4在PBMNC中的基因沉默则可能与其启动子区的甲基化密切相关。初步筛选出的HOXB4基因启动子区CpG岛甲基化位点,为后续研究奠定了基础,也为扩增造血祖细胞提供一条新途径。     

甲基化抑制剂5-aza-2′-deoxycytidine对K562细胞SHP-1基因表达及细胞增殖与凋亡的影响

本研究探讨5-氮杂胞苷（5-aza-2′-deoxycytidine,5-aza-CdR）对K562细胞中抑癌基因SHP．1的转录调控作用及对K562细胞增殖凋亡的生物学影响,为寻找肿瘤治疗新靶点提供实验依据。采用MSP方法检测SHP-1基因甲基化状态,MTT法检测不同剂量（0．5,1,2μmol/L）5-aza-CdR作用K562细胞1,3,5天时对K562细胞存活率的影响,流式细胞术（FCM）分析5-aza-CdR作用1,3,5天时细胞周期及凋亡率的变化,实时定量PCR（FQ-PCR）和Westernblot方法检测5-aza-CdR处理前后SHP-1mRNA及蛋白表达水平、P-STAT5蛋白表达变化。结果表明,K562细胞中存在SHP-1基因的甲基化,5-aza-CdR作用使K562细胞中SHP-1mRNA和蛋白重新表达．而P-JAK2蛋白表达随之呈下降趋势;5-aza-CdR明显抑制K562细胞增殖,并与药物浓度及作用时间呈正相关。JAK2特异性抑制荆AG490明显抑制K562细胞增殖;5-aza-CdR可使K-562细胞凋亡率增加,且作用也呈时间依赖性,用药1,3,5天细胞凋亡率分别为9．3％,24．2％,37．7％。2μmoL／L的5-aza-CdR处理24小时后,G0／G1期细胞逐渐增多,G2／M期细胞逐渐减少,细胞阻滞在G0／G1期。5-aza-CdR作用1,3,5天时G：／M期细胞比例分别为30．7％,23．4％,19．3％。结论：特异性甲基化转移酶抑制剂5-aza-CdR能使K562细胞中沉默的SHP-1基因重新表达,并可能通过JAK／STAT路径活化抑制白血病细胞增殖并诱导其凋亡。     

重型β地中海贫血γ珠蛋白基因启动子区甲基化状态

本研究旨在通过对广西省重型β地中海贫血患者和正常人外周血中γ珠蛋白基因启动子区CpG岛的甲基化位点的确认和对各个CpG位点甲基化率在重型β地中海贫血患者与正常人之间的差异性分析,初步筛选出可能影响γ珠蛋白表达的主要甲基化位点。采用重亚硫酸盐测序法修饰,递降PCR扩增,最后对PCR产物进行DNA克隆测序,得到目的片段中每个CG位点的甲基化情况,定量检测甲基化的确切位置与程度。结果表明:重型β地中海贫血患者与正常人γ珠蛋白基因启动子区存在4个CpG甲基化位点,在序列中分别位于28、122、231和234bp,均呈高度甲基化,其中122和231 bp位点甲基化率明显低于正常对照组,差异均有统计学意义。28和234 bp位点甲基化率与正常对照组均无显著性差异。结论:证实γ基因启动子区存在甲基化位点、明确位点位置且经定量分析证实无论地中海贫血患者还是正常人各个甲基化位点均呈高甲基化状态;初步筛选出影响γ珠蛋白表达的主要位点可能在122和231 bp,为后续通过调节γ珠蛋白的表达缓解重型β地中海贫血的临床症状、靶向基因治疗研究提供了实验依据。