TFPI-2基因CpG岛甲基化与胰腺癌的关系

目的:检测胰腺癌组织组织因子途径抑制物-2(TFPI-2)基因CpG岛甲基化的状态,并分析甲基化改变与胰腺癌的关系。方法:应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测45例胰腺癌组织、相应癌旁组织中TFPI-2基因的甲基化状态。结果:胰腺癌组织中TFPI-2基因的甲基化阳性率为71.1%(32/45),明显高于癌旁组织的31.1%(14/45)(P<0.01)。8例正常胰腺组织中均未发生甲基化。TFPI-2基因甲基化阳性率还与胰腺癌的临床分期、组织分化程度、肿瘤直径有相关性(P<0.05)。结论:TFPI-2基因在胰腺癌组织中出现异常甲基化,可能与胰腺癌的发生发展关系密切。     

皮肤鳞癌组织中p14ARF、E-cad、FOS和JUN基因甲基化状态的分析

目的通过检测皮肤鳞癌及正常皮肤组织中p14ARF、E-cad、FOS、JUN基因启动子区域CpG岛的甲基化状态,探讨p14ARF、E-cad、FOS、JUN在皮肤鳞癌发生过程中的作用及诊断意义。方法采用甲基化特异性PCR(MSP)技术,检测30例皮肤鳞癌组织和20例正常皮肤组织基因启动子区附近CpG岛的甲基化情况。结果 30例皮肤鳞癌组织中发现p14ARF、E-cad基因高甲基化例数分别为18例(60.0%)和11例(37.6%),而20例正常组织分别为1例(5.0%)和2例(10.0%);30例皮肤鳞癌FOS、JUN基因非甲基化分别为22例(73.3%)和25例(83.3%);20例正常组织非甲基化分别为6例(30.0%)和1例(5%)。采用χ2检验进行统计分析,存在统计学差异(P<0.05)。结论 p14ARF、E-cad、FOS、JUN基因启动子区域异常甲基化状态与皮肤鳞癌发病联系紧密。     

胰腺癌细胞中Runx3基因表达及甲基化的研究

目的观察胰腺癌细胞中Runx3基因表达的情况,探讨其出现表达异常的机制。方法 (1)RT-PCR检测胰腺癌Panc-1、BxPC-3、AsPC-1细胞及正常胰腺组织中Runx3mRNA表达情况(2)Western blotting检测胰腺癌Panc-1、BxPC-3、AsPC-1细胞中Runx3蛋白表达情况;(3)甲基化特异性PCR(MSP)检测胰腺癌Panc-1、BxPC-3、As-PC-1细胞及正常胰腺组织中Runx3基因启动子区CpG岛的甲基化水平。结果 (1)Panc-1、BxPC-3、AsPC-1细胞中未检测到Runx3基因mRNA表达,而正常胰腺组织可检测到Runx3基因mRNA表达;(2)Panc-1、BxPC-3、AsPC-1细胞中未检测到Runx3蛋白表达;(3)Panc-1、BxPC-3、AsPC-1细胞中Runx3基因启动子区CpG岛均发生甲基化,而正常胰腺组织中Runx3基因启动子区CpG岛未检测到甲基化。结论胰腺癌细胞中存在Runx3基因失表达,其机制可能与Runx3基因启动子区CpG岛发生甲基化有关。     

粪便SEPT9基因甲基化检测在结直肠癌早期诊断中的应用研究

目的 探讨粪便SEPT9(Septin9)基因甲基化检测在结直肠癌诊断中的价值.方法 从126例结直肠癌手术切除癌组织、癌旁组织及其术前粪便中提取DNA,应用多重置换扩增(MDA)结合巢式甲基化特异性PCR(nMSP)检测结直肠癌粪便SEPT9基因甲基化水平;以手术后病理诊断为标准,比较结直肠癌组织和粪便中SEPT9甲基化检测在结直肠癌诊断中的敏感性和特异性.结果 在126例结直肠癌中,癌组织SEPT9检出率为84.1%,癌旁组织检出率为7.9%,二者比较有统计学差异(P<0.01),特异性为92.1%;结直肠癌粪便SEPT9基因甲基化检测结果与组织检测结果一致;在各临床分期之间,SEPT9甲基化检出率无统计学差异(P>0.05).结论 结直肠癌组织SEPT9基因甲基化异常发生率高;粪便SEPT9甲基化异常可作为结直肠癌早期诊断的肿瘤标志物.     

p16基因异常甲基化检测对周围型肺癌的诊断价值

目的:了解周围型肺癌患者外周血血浆中p16基因异常甲基化发生情况及其在周围型肺癌临床辅助诊断中的应用价值。方法:选取56例肺周围型结节手术患者的血浆和组织标本,其中31例为周围型肺癌,25例为肺部良性结节,采用甲基化特异性聚合酶链反应方法检测p16基因启动子的异常甲基化情况。结果:在周围型肺癌患者的血浆和肿瘤组织中,p16基因甲基化检出率分别为64.5%(20/31)和70.9%(22/31);周围型肺癌患者血清、肿瘤组织中p16基因的甲基化异常事件与肿瘤分期、分型无明显相关性。在25例良性肺部疾病患者中,3例血浆和手术切除标本检测出p16基因启动子的异常甲基化存在;良、恶性肺周围型结节的p16基因异常甲基化发生情况差异存在显著性。结论:检测周围型肺癌患者血浆中p16基因异常甲基化情况有可能成为有价值的临床辅助诊断手段。     

甲基化在肺癌中的意义

目的探讨基因T-钙黏蛋白(CDH13)在40例癌组织,40例的癌旁组织标本和非肺癌良性肺切除组织标本15例作为对照的表达的临床意义,进一步研究其基因异常甲基化与肺癌的相关性。方法采用特异性甲基化PCR(MSP)检测该基因在肺癌组织中异常甲基化的水平。结果 1.在肺癌组织中CDH13基因甲基化率明显高于癌旁组织和非肺癌良性肺切除组织,甲基化率分别为32.5%、7.5%、6.7%,有统计学意义(P<0.05)。2.CDH13基因异常甲基化和CDH13的表达水平呈负相关性(r=-0.520).3.CDH13基因启动子区5’CpG岛甲基化阳性率在肺癌组织中显著高于癌旁组织和非肺癌良性肺切除组织,CDH13基因启动子区5’CpG岛甲基化导致了CDH13的表达下调。结论在肺癌组织中CDH13基因异常甲基化率明显升高且有临床诊断意义,CDH13基因在癌组织中的异常甲基化水平将有望成为肺癌新的治疗靶点。     

p16基因甲基化对胃癌的早期诊断

目的:检测胃癌患者癌组织及全血DNAp16基因甲基化,并探讨其在胃癌早期诊断中的作用。方法:收集新鲜的胃癌组织及血液标本4 4例,胃溃疡等胃部良性疾病患者标本2 0例。采用甲基特异性PCR(MSP)技术分别检测肿瘤组织DNA和全血DNA中p16基因启动子甲基化。结果:38.6 % (17/ 4 4 )胃癌组织出现p16基因甲基化,出现甲基化组织对应的血液标本中88.2 % (15 / 17)出现p16基因甲基化。胃溃疡等胃部良性疾病患者标本中未发现甲基化。肿瘤组织中p16基因的甲基化状况与全血中出现p16基因甲基化关系密切(P<0 .0 1)。结论:胃癌组织及血液标本中p16基因甲基化的检测有助于胃癌的早期诊断。     

甲基化特异性PCR联合结合重亚硫酸盐限制性内切酶法在胃癌抑癌基因甲基化检测中的应用

目的探讨甲基化特异性PCR(MSP)方法检测胃癌组织中抑癌基因甲基化的准确性,联合应用MSP方法与结合重亚硫酸盐限制性内切酶法(COBRA)检测抑癌基因甲基化状态的意义。方法采用MSP检测胃癌组织抑癌基因Runx3启动子区甲基化的状态,随后再采用COBRA检测胃癌组织标本的甲基化状态。分析两种方法检测结果的关系。结果经MSP方法检测54例肿瘤组织中共有30例标本发生Runx3基因启动子区异常甲基化,甲基化阳性率为55.6%。经COBRA方法检测54例肿瘤组织中有27例出现酶切条带即存在甲基化,甲基化阳性率为50.0%。经COBRA方法检测,在MSP方法检测的30例阳性标本中有3例未出现酶切条带即为假阳性。在MSP方法检测Runx3基因甲基化阴性的24例标本中,经COBRA方法检测,Runx3基因甲基化阴性的标本亦为24例。两种检测方法检测结果的阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。结论甲基化特异性PCR方法在检测胃癌抑癌基因甲基化状态的研究中具有较高的灵敏度,COBRA方法可以检测出MSP方法中的假阳性标本,联合应用两种方法检测胃癌组织中抑癌基因的甲基化状态会使实验结果更可靠、准确。     

大肠癌肝转移患者血清中相关癌基因甲基化水平的检测

目的:探讨大肠癌肝转移患者血清相关癌基因甲基化水平的变化。方法:选择2011年9月—2013年12月因原发性大肠癌入院伴或不伴肝转移患者各32例,分别作为试验组A和试验组B。所有患者在入院之前均未进行化疗或放疗。另选择20例健康体检者作为对照组。提取研究对象血清中DNA,采用甲基化特异性PCR法检测E-cad、ID4、ESR1、APC或HACE基因甲基化异常。结果:试验组A检测出19例E-cad、ID4、ESR1、APC或HACE甲基化异常;试验组B检测出10例Ecad、ID4、ESR1、APC或HACE甲基化异常;对照组未检测出E-cad、ID4、ESR1、APC或HACE甲基化异常。3组间差异有统计学意义(P0.01)。结论:血清E-cad、ID4、ESR1、APC和HACE基因甲基化状态联合检测有利于大肠癌肝转移的临床诊治。     

结直肠癌患者p16基因甲基化的检测

目的检测p16基因启动子区异常甲基化发生情况,探讨p16基因异常甲基化作为结直肠癌临床辅助诊断分子生物学标志物的可能性。方法选取2004年5月至2004年12月第三军医大学西南医院及贵州省人民医院普外科住院的结直肠癌患者53例,所有患者均经病理学诊断证实,并按Dukes病理分期分为四期,提取肿瘤组织DNA,分别应用巢式甲基化特异性PCR(nested methylation specific polymerase chain reaction,nested-MSP)及甲基化特异性PCR(methylation specific polvmerase chain reaction,MSP)方法,检测患者肿瘤组织中p16基冈的异常甲基化情况;比较MSP及nested-MSP两方法的灵敏度。结果应用MSP方法,Dukes A、B期患者和Dukes C、D期患者p16基因的甲基化率分别为23.8%和59.4%,两组比较有显著性差异(P<0.05);应用nested-MSP方法,Dukes A、B期患者和Dukes C、D期患者p16基因的甲基化率分别为52.4%和84.4%,两组比较有显著性差异(P<0.05)。应用MSP与nested-MSP方法检测肿瘤组织p16基因甲基化的阳性率分别为45.3%(24/53)、71.7%(38/53),两组比较有显著性差异(P<0.01)。结论应用nested-MSP方法检测肿瘤组织p16基因甲基化的灵敏度明显高于普通的MSP方法,分析患者DNA的p16基因异常甲基化有可能成为结直肠癌辅助诊断及预后评估的有效方法之一。     

肝细胞癌多基因甲基化研究

目的 通过研究肝癌中多基因启动子区的甲基化,说明抑癌基因甲基化在肝癌发生的普遍性。 方法分别抽提冻存的肝癌、癌旁组织和正常肝组织的DNA,利用亚硫酸氢钠具有使未甲基化的胞嘧啶转为尿嘧啶而不改变甲基化胞嘧啶的特性分别设计甲基化引物和非甲基化引物,然后分别进行PCR 反应。我们分别检测了转移抑制基因p15, SYK, TIMP-3, E-cadherin,RASSAF1 和肿瘤相关基因p53, RB1, WT1, p14, p16启动子区在60个肝癌、癌旁和6个正常肝组织的甲基化情况。 结果60个肝癌标本中10个基因的甲基化情况各不相同:从p53的8%~90%的RASSAF1;肝癌组织比癌旁组织的甲基化平均水平高,二者在统计学上有显著差异（P<0.05）。 结论肝癌中有多个基因存在甲基化,且肝癌组织甲基化水平较癌旁组织高。      

膀胱癌组织中上皮细胞钙依粘连蛋白基因启动子区CpG岛甲基化状态的分析

目的　探讨膀胱癌中肿瘤抑制基因上皮细胞钙依粘连蛋白(E cadherin)启动子区CpG岛的甲基化状 态及其与mRNA表达的关系。方法　收集30例新鲜的膀胱癌组织及其癌周正常组织;采用甲基化特异聚合酶 链反应(MSP)检测E cadherin基因启动子区CpG岛的甲基化状态;采用逆转录PCR检测E cadherin基因的mR NA表达。结果　E cadherin基因在膀胱癌组织中的甲基化阳性率(43.3%)显著高于在癌周正常组织中的甲基 化阳性率(6.7%,P<0.01);在复发性膀胱癌中的甲基化阳性率(64.7%)显著高于在原发性膀胱癌中的甲基化 阳性率(15.4%,P<0.05);在不同分级、分期膀胱癌中的差异无显著性。13例异常甲基化的膀胱癌组织中有10 例未检测到CDH1mRNA的表达,而13例未甲基化膀胱癌组织中有2例未检测到,二者差异有显著性(P< 0.01)。结论　E cadherin在膀胱癌组织中有一定程度的过甲基化,但与膀胱癌的临床分期和病理分级无显著相 关性,提示其可能参与了膀胱癌的发生;E cadherin基因CpG岛的过甲基化可能成为判断膀胱癌复发的指标之 一;E cadherin基因CpG岛的过甲基化可能是造成E cadherinmRNA不表达的原因之一。     

肾癌组织中TβRⅡ基因甲基化状态的检测及其临床意义

目的探讨转化生长因子β受体Ⅱ(TβRⅡ)在肾透明细胞癌(RCCC)中的甲基化状态及其临床意义。方法应用甲基化特异性PCR(MSP)技术检测43例肾透明细胞癌组织,43例正常组织中TβRⅡ基因的甲基化状况;应用免疫组织化学P-V法检测40例肾透明细胞癌组织,28例正常组织中TβRⅡ基因的蛋白表达情况。结果 RCCC组织中TβRⅡ基因的甲基化率为58.1%(25/43),显著高于正常组织34.9%(15/43),差异有统计学意义(P0.05);肾透明细胞癌中TβRⅡ基因的甲基化率与患者年龄、性别、肿瘤的大小和肿瘤分化程度无显著相关性(P0.05)。TβRⅡ在RCCC组织中的免疫组化结果显示,基因蛋白表达在RCCC组显著低于正常组(P0.05),且其蛋白表达与肿瘤的大小和肿瘤分化程度相关(P0.05)。结论 TβRⅡ基因启动子甲基化可能与RCCC的发生有关。     

宫颈癌中FHIT基因CpG岛甲基化检测意义

目的探讨宫颈癌患者中脆性组氨酸三联体基因（fragile histidine triad,FHIT）CpG岛甲基化状态及其在宫颈癌诊断中价值。方法采用甲基化特异性PCR技术检测45例宫颈癌组织及血浆中、10例正常宫颈组织中FHIT基因CpG岛甲基化状态。结果 FHIT基因在宫颈癌组织及血浆中CpG岛甲基化率分别为55.6%和35.6%,正常宫颈组织中未检测出FHIT基因CpG岛甲基化,宫颈癌组织及血浆中CpG岛甲基化改变与正常对照比较差异有统计学意义（P〈0.05）;癌组织中FHIT基因甲基化发生率与年龄、病理分级、临床分期间差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 FHIT基因CpG岛甲基化检测在宫颈癌早期诊断中有一定价值。     

Ⅰ型钙黏蛋白基因异常甲基化及其功能蛋白表达与肺癌的相关性

目的 探讨Ⅰ型钙黏蛋白(cadherin 1,CDH1)基因甲基化及其功能蛋白表达与肺癌的相关性.方法 分别提取基因组DNA、总RNA和总蛋白,用半定量荧光甲基化特异PCR(MSP)、巢式逆转录PCR(nRT-PCR)和免疫印迹法(WB)检测30例肺癌患者的癌、癌旁和远癌肺组织及5例肺良性疾病对照肺组织中CDH1甲基化、mRNA相对表达和上皮钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)表达情况,并对部分表达阴性标本用免疫组化法进行验证.结果 半定量荧光MSP检测CDH1启动子甲基化相对比值,癌组织为0.13%～450.67%、中位数33.61%,癌旁组织为0.00%～177.02%、中位数18.04%,远癌组织为0.00%～51.68%、中位数13.69%.经配对秩和检验分析癌与癌旁组织和远癌组织中CDH1甲基化程度差异有统计学意义(Z分别为-2.355和-3.527,P分别为＜0.05和＜0.01).nRT-PCR检测CDH1 mRNA表达的相对比值,癌组织为1.33±0.48,癌旁组织为1.61±0.55,远癌组织为1.93±0.45、肺良性疾病对照肺组织为2.09±0.09,经方差分析,癌与癌旁和远癌组织的差异有统计学意义(F=9.081,P＜0.01).WB结果显示,癌组织E-cad阳性率为36.7%(11/30)、癌旁组织为70.0%(21/30)、远癌组织为96.7%(29/30),经确切概率法分析癌与癌旁和远癌组织的差异有统计学意义(X2分别为6.70、24.30和7.68,P均＜0.01).而肺良性疾病对照肺组织阳性率为100%(5/5).结论 肺癌患者癌组织CDH1启动子发生甲基化后,可抑制该基因的转录,进而影响E-cad蛋白的表达,CDH1异常甲基化与肺癌的发生有相关性.     

上皮型钙黏素E和β-连环蛋白在胰腺癌中的表达情况

目的：研究上皮型钙黏素E（E-cad）β-连环蛋白（β-cat）在胰腺癌中的表达情况及其临床意义。方法：采用免疫组织化学方法检测上皮型钙黏素E和β-连环蛋白在胰腺癌中及癌旁非肿瘤胰腺组织中的表达情况。并分析其与临床病理因素的关系。结果：上皮型钙黏素E和β-连环蛋白在胰腺癌组织中的表达明显低于癌旁非肿瘤胰腺组织。结论：上皮型钙黏素E和β-连环蛋白的低表达可能参与胰腺癌的转移,联合检测对判断胰腺癌的诊断和预后有一定价值。     

焦磷酸测序法快速检测胰腺癌K-ras基因点突变

目的 建立基于焦磷酸测序技术的胰腺癌K-ras基因点突变的检测方法,并与Sanger测序法作一比较.方法 用焦磷酸测序法(Pyrosequencing)和Sanger测序法(Sanger sequencing)分别在10名正常胰腺组织、49例胰腺癌、11例慢性胰腺炎、18例胰腺良性囊肿、7例胰岛素癌、9例壶腹癌、7例胆管癌及7例十二指肠乳头癌石蜡包埋组织的DNA中检测K-rag基因12密码子点突变.结果 采用上述两种方法在所有正常胰腺组织、慢性胰腺炎、胰腺良性囊肿、胰岛素癌、壶腹癌、胆管癌及十二指肠乳头癌均未见K-ras基因点突变,而采用焦磷酸测序法发现胰腺癌石蜡包埋组织K-ras基因点突变率为71.4%(35/49),显著高于采用Sanger测序法发现胰腺癌石蜡包埋组织K-rag基因点突变率(61.2%,30/49).结论 焦磷酸测序法较Sanger测序法更为敏感,且焦磷酸测序法准确、快速、高通量,适合临床标本的批量测定.