真核表达人和鼠可溶性VEGFR 2的双基因疫苗的构建及抗肿瘤实验研究

目的 构建能同时表达人和鼠可溶性VEGFR2的双基因真核表达载体.并初步验证其功能.方法 分别以pORF-hVEGFR2和pORF-mVEGFR2为模板,通过PCR将人和鼠的sVEGFR2基因定向克隆人真核细胞双顺反子载体pVITR02的多克隆位点区.构建pVITRO2-hm-sVEGFR2双基因表达质粒.通过体外实验研究pVITRO2-hm-sVEGFR2的表达产物能否阻断VEGF对脐静脉血管内皮细胞的促增殖能力,体内实验建立小鼠B16肿瘤模型研究其抗肿瘤活性,CD31免疫组化染色检测其对肿瘤新生血管的抑制情况.结果 pVITR02一hm-sVEGFR2双基因表达质粒成功构建,体外能阻断VEGF对血管内皮细胞的促增殖能力,能明显抑制肿瘤在小鼠体内的生长以及肿瘤组织内的新生血管生成,其抑制作用大于人或鼠可溶性VEGFR2单基因治疗方案.结论 pVITRO2-hm-sVEGFR2明显抑制新生血管生成活性,是一种新型的抗血管生成DNA疫苗,为抗肿瘤治疗研究提供了新的思路和方法.     

抑制肿瘤血管淋巴管生成的VEGFR分子机制及调控的研究进展

血管内皮生长因子受体（VEGFR）是靶向于血管与淋巴管生成的重要的信号分子,是人们研究抑制肿瘤药物的关键作用点,调控肿瘤新生淋巴管上的VEGFR可作为多种类型肿瘤的治疗靶点。由于作用于肿瘤新生淋巴管上的VEGFR的调控机制较为复杂,对抑制淋巴管生成的药物和肿瘤细胞转移之间复杂的相互作用关系了解甚少,为此,本文从血管内皮生长因子（VEGF）及VEGFR、肿瘤淋巴管生成及其调控因子、VEGF家族及其受体为靶点的淋巴管生成的调控、VEGFR为靶点的淋巴管抑制药物四个方面综述抑制肿瘤血管淋巴管生成的VEGFR分子机制及调控的研究进展,探讨肿瘤淋巴管生成中VEGF家族及其受体作用靶点的分子水平上的形成机制,探索可阻断相应作用靶点的理想型药物,为临床更好的治疗肿瘤提供思路。     

以血管内皮生长因子及血管内皮生长因子受体为靶点的抗肿瘤血管生成的治疗进展

肿瘤生长、浸润和转移都依赖于肿瘤血管生成,而肿瘤血管生成又受多种因子影响.血管内皮生长因子(VEGF)是最重要的血管生成因子,可特异性作用于血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR),通过促进内皮细胞增殖,增加血管通透性,而诱导肿瘤血管生成.因而以VEGF及VEGFR为靶点抗肿瘤血管生成已越来越成为人们研究的热点.对以VEGF及VEGFR为靶点抗肿瘤血管生成的治疗进展作一综述.     

携带flk-l的减毒沙门疫苗菌抗胶质瘤血管生成的研究

目的观察表达鼠血管内皮生长因子受体2(VEGFR2,flk-1)的重组减毒鼠伤寒沙门疫苗菌对胶质瘤荷瘤小鼠的抗肿瘤血管及肿瘤生长抑制作用。方法构建真核表达载体pcDNA3 1.-flk-l,通过电转化法将pcDNA3 1.-flk-1导入减毒鼠伤寒沙门菌SL7207中,经由胃管饲于C57BL/6J小鼠,对胶质瘤荷瘤小鼠进行免疫预防及治疗。通过观察免疫动物的生存期,免疫荧光法检测肿瘤血管密度,评价重组疫苗菌的抗血管及肿瘤生长抑制作用。分离免疫小鼠的脾细胞,分析重组疫苗菌免疫后小鼠体内的特异性细胞毒性T细胞(CTL)应答。结果重组疫苗菌免疫能够明显减少肿瘤血管密度,延缓胶质瘤的生长,延长小鼠生存期,获得明显的抗肿瘤效果。重组疫苗菌免疫后可诱导小鼠脾淋巴细胞产生针对flk-l的CTL活性。结论表达鼠flk-l的重组减毒鼠伤寒沙门疫苗菌经口服免疫,可打破小鼠对于自身抗原flk-1的免疫耐受,诱导小鼠产生抗flk-1的特异性免疫反应,特异性杀伤肿瘤血管内皮细胞,预防和治疗小鼠胶质瘤。     

携带flk-1的减毒沙门疫苗菌抗胶质瘤血管生成的研究

目的观察表达鼠血管内皮生长因子受体2（VEGFR2，flk-1）的重组减毒鼠伤寒沙门疫苗菌对胶质瘤荷瘤小鼠的抗肿瘤血管及肿瘤生长抑制作用。方法构建真核表达载体pcDNA3、1-flk-1通过电转化法将pcDNA3．1-flk-1导入减毒鼠伤寒沙门菌SL7207中，经由胃管饲于C57BL／6J小鼠，对胶质瘤荷瘤小鼠进行免疫预防及治疗。通过观察免疫动物的生存期，免疫荧光法检测肿瘤血管密度，评价重组疫苗菌的抗血管及肿瘤生长抑制作用。分离免疫小鼠的脾细胞，分析重组疫苗菌免疫后小鼠体内的特异性细胞毒性T细胞（CTL）应答。结果重组疫苗菌免疫能够明显减少肿瘤血管密度，延缓胶质瘤的生长，延长小鼠生存期，获得明显的抗肿瘤效果。重组疫苗菌免疫后可诱导小鼠脾淋巴细胞产生针对flk-1的CTL活性。结论表达鼠flk-1的重组减毒鼠伤寒沙门疫苗菌经口服免疫，可打破小鼠对于自身抗原flk-1的免疫耐受，诱导小鼠产生抗flk-1的特异性免疫反应，特异性杀伤肿瘤血管内皮细胞，预防和治疗小鼠胶质瘤。     

以血管内皮生长因子及血管内皮生长因子受体为靶点抗肿瘤血管生成的基因治疗

肿瘤的血管生成是一个复杂的过程,包括内皮细胞激活、增生、迁移、血管基底膜破坏、形成新的血管和血管网,并且与已存在的血管网连接。肿瘤血管为肿瘤细胞的生长输送营养并排泄代谢产物,转移灶的形成和发展也依赖于新生血管的形成。如能有效抑制血管生成、切断肿瘤血供,有望达到抑制肿瘤生长、发展和转移的目的。绝大多数恶性肿瘤中,血管内皮生长因子(VEGF)及血管内皮生长因子受体(VEGFR)均呈高表达,形成旁／自分泌作用方式,促进内皮细胞分裂、增殖,诱导血管新生,并直接作用于肿瘤细胞刺激其生长。     

肺纤方对肺间质纤维化大鼠VEGF及VEGFR1、VEGFR2基因表达的影响

目的 探讨肺纤方提取物对肺间质纤维化大鼠血管新生的影响.方法 将大鼠分为假手术组、模型组、泼尼松组、氯沙坦组、肺纤方大剂量组、肺纤方中剂量组、肺纤方小剂量组7组,除假手术组外,其余6组采用气管插管灌注博莱霉素3 mg/kg进行大鼠肺间质纤维化造模;造模第2天各组予以相应药物灌胃干预.于第14天及第28天分2批进行取材,HE染色观察肺泡炎程度、MAS-SON染色观察肺纤维化程度,RT-PCR检测血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)l、VEGFR2mRNA表达.结果 肺纤方大中剂量均能抑制肺泡炎和纤维化程度、下调VEGF及VEGFR1、VEGFR2mRNA表达水平(P＜0.05).肺纤方中剂量作用更显著.结论 肺纤方通过下调VEGF及VEGFR1、VEGFR2基因表达水平,抑制血管新生,发挥抗肺纤维化作用.     

血管内皮生长因子受体及其小分子抑制剂的研究进展

目前抗血管生成治疗是抗肿瘤研究的热点。血管内皮生长因子（VEGF）是刺激血管生成的重要因子之一,血管内皮生长因子受体（VEGFR）在肿瘤新生血管中高表达,因此成为肿瘤靶向治疗的理想靶点。以VEGF、VEGFR为靶点的抗肿瘤药物除了常见的单克隆抗体药物阿伐斯汀外,小分子抑制剂舒尼替尼、索拉非尼等也已经广泛使用;另外,一些具有上市潜力的药物,如范得他尼、西地尼布、瓦他拉尼、阿西替尼等也值得关注。已上市和正在进行临床研究的VEGFR小分子抑制剂按结构大致分为6类：喹啉及喹唑啉类、哒嗪类、吲唑类、咪唑和吡咯嘧啶类、吲哚类和其他结构等。对VEGF、VEGFR的生物学功能,其代表性的小分子抑制剂研究进行综述。     

人可溶性血管内皮生长因子受体-2基因的克隆与鉴定

目的获取人可溶性血管内皮生长因子受体-2(sKDR)基因,构建sKDR基因真核表达载体,为进一步研究sKDR抗肿瘤血管生成的基因治疗奠定基础。方法提取人胎盘组织总RNA,利用RT-PCR方法扩增获得sKDR基因cDNA,将其克隆到pMD18-T载体中,测序证实后,用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pMD18-T-sKDR重组载体,胶回收sKDR基因,再将其定向亚克隆到真核表达载体pCMV-Script中,提取质粒做双酶切和测序鉴定。结果构建的重组sKDR基因真核表达载体pCMV-Script-sKDR分别做双酶切和测序鉴定,证实其中含有sKDR基因,测序结果经BLAST分析,与预期设计的编码区cDNA序列一致。结论成功克隆了人sKDR基因的真核表达载体。     

VEGF及其受体KDR在肿瘤血管生成中的作用

人体肿瘤大部分都是实体瘤,肿瘤组织是由肿瘤细胞和间质构成,间质成分主要包括血管、淋巴管、结缔组织、炎细胞及细胞外基质等成分。其中,血管和结缔组织起营养、支持肿瘤细胞的作用。肿瘤内的新生血管是通过血管生成实现的,血管生成在肿瘤的生长、侵袭和转移中起到重要作用。血管生成是指活体组织在已存在的微血管床上芽生出新的以毛细血管为主的血管系统过程[1]。肿瘤的血管生成受多种血管生成因子调控,已知的血管生成因子有数十种,包括成纤维细胞生长因子家族、血管内皮生长因子(VEGF)家族及其受体、血管生成素家族及其受体家族以及表皮生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子等。其中VEGF家族及其受体是已知的、特异性     

Anti-angiogenesis Effect on Glioma of Attenuated Salmonella Typhimurium Vaccine Strain with flk-1 Gene

To investigate the anti-vasculature effects and the anti-glioma effects of attenuated Salmonella typhimurium vaccine strain expressing VEGFR2 (flk-1) gene, plasmid pcDNA3, 1-flk1 was constructed and electro-transfected into live attenuated Salmonella typhimurium strain SL7207. Mouse models of intracranial G1261 glioblastoma were treated with an orally administered attenuated Salmonella typhimurium expressing flk-1 gene. The survival period was recorded and vessel density was observed by immunofluorescence. CTLs activity was measured by MTT assay. Our results showed that attenuated Salmonella typhimurium vaccine strain expressing flk-1 gene could significantly inhibit glioblastoma growth, reduce vessel density, prolong the survival period and improve the survival rate in these mice. The flk-1 specific CTLs activity was increased obviously after the vaccination. Our study showed that attenuated Salmonella typhlmurium vaccine strain expressing flk-1 gene could break peripheral immune tolerance a in glioma gainst this self-antigen and kill endothelial cells by the orally administered vaccine and can be used for both prophylactic and therapeutic purposes.     

SAGl和R0P1混合基因真核表达质粒接种小鼠诱导产生拮抗致死性弓形虫感染的保护性免疫

目的 检测混合SAGl和ROP1编码基因真核表达质粒疫苗诱导小鼠的免疫应答，评价其抗弓形虫感染的保护性免疫效果。方法 将SAGl和ROP1编码基因片段克隆入pEGEP—N3表达载体，构建重组质粒；RT—PCR体外验证重组质粒在N1H3T3细胞中的表达；通过检测抗体、抗体分型及细胞因子来评价体液免疫和细胞免疫；流式细胞仪测定脾脏淋巴细胞亚群；腹腔内注射毒性株弓性虫速殖子攻击免疫小鼠。结果 RT-PCR结果显示重组质粒能在哺乳动物细胞内表达；SAGl和ROP1混合重组质粒疫苗诱导小鼠产生很强体液免疫和细胞免疫，对于毒性株弓形虫感染攻击具有免疫保护作用。结论 不同候选抗原编码基因混合重组质粒能够诱导小鼠产生抗弓形虫感染保护性免疫，提示含有多种成份的混合DNA疫苗的研制可作为核酸免疫研究的策略之一。     

肿瘤血管生成模型的建立

肿瘤血管生成是肿瘤生长与转移的重要条件，我们利用鸡胚及裸小鼠分别建立了２组血管生成模型，并研究了肿瘤血管与肿瘤细胞转移能力之间的关系，结果表明，高转移性肿瘤细胞诱发血管生成的能力远高于低转移肿瘤细胞，证明这２组模型揭示了血管生成在恶性肿瘤生长与转移过程中的作用，并为预防和控制肿瘤生长与转移的研究提供了有力工具。     

SAG1和ROP1混合基因真核表达质粒接种小鼠诱导产生拮抗致死性弓形虫感染的保护性免疫

目的检测混合SAG1和ROP1编码基因真核表达质粒疫苗诱导小鼠的免疫应答,评价其抗弓形虫感染的保护性免疫效果.方法将SAG1和ROP1编码基因片段克隆入pEGFP-N3表达载体,构建重组质粒;RT-PCR体外验证重组质粒在NIH3T3细胞中的表达;通过检测抗体、抗体分型及细胞因子来评价体液免疫和细胞免疫;流式细胞仪测定脾脏淋巴细胞亚群;腹腔内注射毒性株弓性虫速殖子攻击免疫小鼠.结果 RT-PCR结果显示重组质粒能在哺乳动物细胞内表达;SAG1和ROP1混合重组质粒疫苗诱导小鼠产生很强体液免疫和细胞免疫,对于毒性株弓形虫感染攻击具有免疫保护作用.结论不同候选抗原编码基因混合重组质粒能够诱导小鼠产生抗弓形虫感染保护性免疫,提示含有多种成份的混合DNA疫苗的研制可作为核酸免疫研究的策略之一.     

大肠肿瘤COX-2表达和肿瘤血管生成的研究

目的 探讨环氧化酶-2(cyclooxygenase,COX-2)表达和大肠肿瘤血管生成的关系。方法 免疫组化检测大肠肿瘤COX-2表达、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达,并测定肿瘤微血管密度(microvessel density,MVD)。结果 大肠肿瘤COX-2表达阳性组和阴性组MVD有显著差异(P<0.05)。偏相关分析显示COX-2表达和VEG表达相关(校正MVD因素,偏相关系数r=0.801,P<0.01),VEG表达和MVD相关(校正COX-2因素,偏相关系数r=0.392,P<0.01),COX-2和MVD不相关(校正 VEGF因素,偏相关系数r=0.138 0,P>0.05)。结论 大肠肿瘤COX-2表达和肿瘤血管生成有关,VEGF可能参与COX-2对肿瘤血管生成的促进作用。     

缺氧诱导因子和血管生成素在直肠癌中的表达及血管形成中的作用

目的:研究缺氧诱导因子(HIF-1α)及血管生成素(Ang-2)在直肠癌组织中的表达,及其与临床病理特征和肿瘤新生血管形成之间的关系。方法:采用免疫组化法检测56例直肠癌组织和20例切缘正常组织中HIF-1α、Ang-2和CD105的表达。结果:HIF-1α和Ang-2在直肠癌组织和切缘正常组织中的表达差异有统计学意义(P<0.05);HIF-1α和Ang-2在直肠癌组织中的表达均与直肠癌的临床分期和血行转移有关(P<0.05);而与患者的性别、年龄、淋巴转移和浸润深度无关(P>0.05),Ang-2在直肠癌组织中的表达与肿瘤大小、分化程度有关(P<0.05),并且在溃疡型和隆起型中阳性表达的差异有统计学意义(P<0.05)。HIF-1α、Ang-2阳性表达的直肠癌组织中微血管密度(MVD)数值比阴性表达组显著增高(P<0.05),且三者的表达两两之间呈正相关(r=0.333,r=0.355,r=0.280;P<0.05)。结论:HIF-1α和Ang-2在直肠癌中的高表达可能与预后、转移以及肿瘤新生血管形成有密切关系。     

IL-12联合结核杆菌DNA疫苗初免-BCG加强免疫的免疫效果观察

目的研究并比较IL-12联合结核分枝杆菌(TB)DNA(Ag85A和ESAT-6)疫苗初免-BCG加强免疫的应答效果。方法将小鼠随机分成PBS阴性对照组和4组免疫组:BCG组、DNA(Ag85A和ESAT-6)初免-BCG异源加强组、DNA IL-12初免-BCG异源加强组和DNA初免-BCG IL-12异源加强组。末次免疫后4、6、8周分别测定血清总IgG水平,同时分离小鼠脾细胞,进行淋巴细胞增殖实验(流式细胞仪检测),测定脾细胞培养上清中IFN-γ分泌水平,并检测小鼠脾脏淋巴细胞表型。结果4组免疫组体外经TB纯蛋白衍生物(TB-PPD)刺激后均检测到特异性IgG抗体产生,且抗体水平在末次免疫后4～8周逐渐增加,4组平均效价为1∶80,1∶120、1∶160、1∶160,各组抗体水平增加无明显差异(P>0.05);小鼠脾细胞体外经TB-PPD刺激后,4组免疫组均能产生特异性淋巴细胞增殖并诱生较强的IFN-γ反应,且DNA IL-12/BCG和DNA/BCG IL-12组特异性淋巴细胞增殖活性和IFN-γ分泌水平均明显强于BCG,DNA/BCG组(P<0.05),但DNA IL-12/BCG和DNA/BCG IL-12组间差异不明显;4组免疫组小鼠CD4 、CD8 T淋巴细胞较PBS组有较大升高(P<0.05),且DNA IL-12/BCG和DNA/BCG IL-12组CD4 、CD8 T淋巴细胞百分比大于BCG以及DNA/BCG组(P<0.05)。结论IL-12联合DNA疫苗初免-BCG加强的免疫策略较BCG免疫以及单纯的DNA疫苗初免-BCG加强免疫能在小鼠体内诱导更强的特异性细胞免疫反应,产生高水平的IFN-γ。     

血浆纤溶酶原激活剂抑制物1在肿瘤血管新生中的作用及机制研究进展

肿瘤血管新生在肿瘤生长及转移过程中起重要作用。血浆纤溶酶原激活剂抑制物1(PAI-1)是由多种细胞分泌的糖化蛋白,在体内参与多种生理过程。近年研究发现,PAI-1在肿瘤血管新生过程中发挥双重作用,在生理浓度范围内PAI-1可以促进肿瘤血管新生,而在药理作用范围内高浓度的PAI-1则抑制肿瘤血管新生,其作用可能是通过对细胞外基质的降解、细胞黏附以及细胞迁移的调节而实现的。     

肿瘤血管生成的分子机制

目的:综述肿瘤血管生成的分子机制。方法:查阅文献。结果:肿瘤血管生成是一个复杂的过程,有多种生长因子、胞外基质(ECM)组分、蛋白水解酶、细胞黏附分子以及癌基因和抑癌基因等参与反应。结论:肿瘤血管生成的分子机制还需要真正全面了解,而肿瘤血管生成抑制剂的研制为肿瘤治疗提供了新的更为广阔的前景。