子痫前期患者血清对滋养-平滑肌细胞共培养体系平滑肌细胞凋亡的影响

目的:探讨子痫前期血清对滋养-平滑肌细胞共培养体系滋养细胞侵袭力改变及对平滑肌细胞凋亡的影响.方法:采用组织块贴壁法培养人孕早期细胞滋养细胞(CTB)和人脐动脉平滑肌细胞(HUASMC),传代后建立滋养细胞与HUASMC共培养模型并分别加入正常和子痫前期患者静脉血清培养24小时并设立相对应的单培养组;用不同的方法检测细胞滋养细胞的侵袭能力、HUASMC活力、HUASMC凋亡率、滋养细胞基质金属蛋白酶MMP-2mRNA、MMP-9mRNA、人脐静脉内皮细胞自杀相关因子(Fas)及HUASMC的Fas配体(Fasl)mRNA的表达;HUASMC的Fas蛋白的表达.结果:子痫前期患者血清能显著抑制共培养体系中的细胞滋养细胞的侵袭能力,上调HUASMC活力,降低HUASMC早期凋亡率,降低细胞滋养细胞MMP-2mRNA、MMP-9mRNA、FasmRNA及HUASMC的Fasl mRNA和Fas蛋白水平的表达.结论:子痫前期血清可能通过降调细胞滋养细胞MMP-2、MMP-9表达而影响滋养-平滑肌细胞共培养体系滋养细胞的侵袭能力,子痫前期血清培养滋养-平滑肌细胞共培养体的Fas/Fasl的表达异常可能与HUASMC凋亡下降有关.提示滋养细胞MMP-2、MMP-9、Fas/Fasl 系统的表达异常可能参与了子痫前期子宫螺旋动脉重铸障碍的病理过程.     

子痫前期血清对滋养-平滑肌细胞共培养体系平滑肌细胞凋亡的影响

目的:探讨子痫前期血清对细胞滋养细胞-平滑肌细胞共培养体系平滑肌细胞凋亡的影响。方法:采用组织块贴壁法培养人早孕期细胞滋养细胞(CTB)和人脐动脉平滑肌细胞(HUASMC),传代后建立滋养细胞与人脐动脉平滑肌细胞共培养模型并分别加入正常和子痫前期患者静脉血清培养24h,并设立相对应的单培养组;Transwell小室检测CTB的侵袭能力;细胞计数试剂盒(CCK-8)测定HUASMC活力;Annexin V-FITC检测HUASMC凋亡率;RT-PCR检测滋养细胞FasL mRNA与HUASMC的Fas mRNA的表达;W estern blot检测HUASMC的Fas蛋白的表达。结果:子痫前期患者血清能显著降低共培养体系中CTB的侵袭能力,上调HUASMC活力,降低HUASMC早期凋亡率、FasmRNA和Fas蛋白的表达。结论:子痫前期血清可能通过降调细胞滋养细胞-平滑肌细胞共培养体系滋养细胞的侵袭能力,降调共培养体系HUASMC Fas的表达,从而抑制HUASMC凋亡。     

MMP-9在绒毛外滋养细胞诱导内皮细胞凋亡中作用的研究

目的:探讨绒毛外滋养细胞基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达对血管内皮细胞凋亡的影响。方法:MMP-9的siRNA转染绒毛外滋养细胞株(TEV-1),利用实时定量逆转录-聚合酶链反应(real time RT-PCR)和ELISA法检测转染前后细胞中MMP-9、FasL基因及蛋白表达的变化;通过trans well共培养技术,研究滋养细胞对内皮细胞凋亡的影响。结果:(1)MMP-9 siRNA转染后24h,滋养细胞MMP-9 mRNA的表达较对照组明显降低(P0.05),而FasL mRNA表达与对照组无明显差异(P0.05);转染后48h,细胞培养液中MMP-9蛋白及FasL蛋白表达均较对照组显著降低(P0.05);(2)与未转染者比较,转染MMP-9 siRNA的滋养细胞与内皮细胞共培养48h后,内皮细胞凋亡率显著降低,差异有显著性(P0.05)。结论:绒毛外滋养细胞表达MMP-9的水平影响其诱导内皮细胞凋亡的作用,此作用可能与MMP-9调节FasL蛋白的分泌表达有关。     

子痫前期患者胎盘组织中Rho激酶Ⅱ表达与滋养细胞凋亡的研究

目的探讨Rho激酶Ⅱ(Rho-associatedProteinKinaseⅡ,ROCKⅡ)在正常妊娠和子痫前期患者胎盘的分布和表达及与滋养细胞凋亡的关系。方法采用免疫组织化学法检测30例子痫前期(轻、重度)孕妇和15例正常妊娠妇女胎盘中ROCKⅡ的分布和表达,采用TUNEL法检测三组胎盘滋养细胞的凋亡情况。结果ROCKⅡ在正常妊娠和子痫前期患者胎盘的滋养细胞、内皮细胞、基质细胞中均有表达,以滋养细胞表达为主。子痫前期重度和轻度组以及正常妊娠组ROCKⅡ的免疫组化积分分别为(4.53±0.58)、(3.18±0.59)和(2.06±0.63),P<0.01。正常妊娠和子痫前期患者胎盘的滋养细胞、内皮细胞、基质细胞均存在凋亡,以滋养细胞凋亡为主。重度子痫前期组胎盘滋养细胞凋亡(0.28±0.03)%显著高于子痫前期轻度组(0.22±0.04)%,子痫前期轻度组显著高于正常妊娠组(0.16±0.05)%(P<0.01)。滋养细胞ROCKⅡ表达和滋养细胞凋亡具有相关性(r=0.96,P<0.01)。结论子痫前期患者胎盘组织中Rho激酶Ⅱ的高表达可能与其滋养细胞凋亡增加有关。     

缺氧调控滋养细胞和内皮细胞sFlt-1差异表达的研究

目的:探讨缺氧条件下,人早孕绒毛滋养细胞(TEV-1)及人脐静脉内皮细胞(EVC-304)中可溶性血管内皮生长因子受体-1(sFlt-1)差异表达的特点。方法:CoCl2诱导TEV-1及EVC-304化学缺氧,并于0,6,12,24,48,72,96,120h用ELISA法分别检测上清中sFlt-1蛋白表达,RealtimeRT-PCR法检测各组sFlt-1mRNA表达。结果:缺氧72h后滋养细胞sFlt-1mRNA及蛋白表达随时间延长明显升高(P<0.05),而内皮细胞sFlt-1mRNA及蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论:正常情况下滋养细胞及脐静脉内皮细胞中均有sFlt-1表达;缺氧诱导滋养细胞sFlt-1表达明显增加,而内皮细胞sFlt-1表达对缺氧刺激无明显反应。     

GPR30在妊娠期胎盘中的表达及其对滋养细胞侵袭能力影响的研究

目的:探讨G-蛋白偶联受体30(GPR30)在妊娠期胎盘中的表达,以及其对人胎盘滋养细胞侵袭力的影响。方法:免疫组化法检测早孕期绒毛、正常产妇胎盘和重度子痫前期患者胎盘组织中GPR30表达。用17-β-雌二醇(17β-E2)、GPR30激动剂G1和阻滞剂G15预处理体外培养绒毛组织和人绒毛外滋养细胞株HTR8/SVneo。显微镜下观察体外绒毛组织滋养细胞生长侵袭范围,Transwell侵袭实验检测HTR8/SVneo细胞侵袭能力。免疫荧光法检测绒毛组织和HTR8/SVneo细胞中GPR30蛋白表达。Western blot法检测HTR8/SVneo细胞中GPR30和MMP-9蛋白表达。结果:GPR30在早期绒毛组织和正常末期胎盘滋养细胞上都有表达,且早孕期的表达水平高于正常末期胎盘,但在重度子痫前期胎盘上GPR30蛋白表达明显减少。E2及GPR30激动剂G1可增加滋养细胞的侵袭能力,阻滞剂G15则可下调其侵袭性;E2、G1可诱导滋养细胞GPR30蛋白表达上调,而G15则下调其表达。GPR30蛋白水平与侵袭相关蛋白MMP-9表达水平有相关性。结论:GPR30可能参与人类滋养细胞侵袭力的调节,对滋养细胞的侵袭力有正性促进作用。     

子痫前期患者血浆对人脐静脉内皮细胞生长活性及Edg4表达的影响

目的:探讨子痫前期患者血浆对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)生长活性的影响以及与溶血磷脂酸受体蛋白内皮分化基因-4(Edg4)的关系。方法:体外培养HU-VECs,取对数生长的细胞,分组实验:对照组,正常晚孕组,轻度子痫前期组,重度子痫前期组。用MTT比色法和流式细胞仪检测各组细胞增殖及凋亡情况,免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组细胞Edg4蛋白及mRNA表达水平。结果:(1)子痫前期组HUVECs增殖减少,细胞凋亡增加;各组间细胞增殖率及细胞凋亡率差异显著(P<0.05);(2)Edg4蛋白主要表达于HUVECs的细胞浆和细胞膜,子痫前期病情越重,其血浆诱导的HUVECs Edg4蛋白表达越强;(3)子痫前期组Edg4 mRNA表达明显升高,与对照组和正常晚孕组相比显著差异(P<0.05);重度子痫前期组Edg4 mRNA表达较轻度组显著升高(P<0.05)。结论:子痫前期患者血浆可诱导HUVECs Edg4蛋白表达增强,并抑制HUVECs细胞增殖,促进细胞凋亡,提示子痫前期患者溶血磷脂酸升高可能与血管内皮细胞功能异常有关。     

子痫前期患者滋养细胞浸润相关基因mRNA及蛋白表达的研究

目的研究子痫前期患者胎盘滋养细胞基质金属蛋白酶(MMP)9、2及其组织抑制物(TIMP)1、2,肿瘤转移抑制基因KiSS-1 mRNA、蛋白的表达变化及其与子痫前期发病的关系。方法采用RT-PCR、免疫印迹(western blot)法对30例正常足月妊娠妇女(正常妊娠组)和10例妊娠期高血压患者(高血压组)及27例子痫前期(子痫前期组)患者胎盘滋养细胞中MMP-9、MMP-2、KiSS-1、TIMP-1和TIMP-2基因mRNA及蛋白表达水平[均以相对吸光度(A)表示]进行检测;应用明胶酶谱分析法,检测3组妇女胎盘孵育液MMP-9、MMP-2活性。结果(1)胎盘滋养细胞浸润相关基因mRNA表达水平:子痫前期组MMP-9、MMP-2 mRNA表达水平分别为0．39±0．05和0．71±0．16,均明显低于正常妊娠组的0．78±0．11和1．63±0．31,两组分别比较,差异有统计学意义(P均<0．05)。高血压组MMP-9 mRNA的表达水平明显高于重度子痫前期患者,差异有统计学意义(P<0．05)。子痫前期组胎盘滋养细胞KiSS-1 mRNA和TIMP-1 mRNA的表达水平分别为1．97±0．21和1．11±0．18,均明显高于正常妊娠组的0．69±0．27和0．65±0．19,差异均有统计学意义(P<0．05);高血压组胎盘滋养细胞KiSS-1 mRNA表达水平低于子痫前期组,但与正常妊娠组比较,差异无统计学意义(P>0．05)。重度子痫前期患者胎盘滋养细胞TIMP-2 mRNA表达水平明显高于正常妊娠组,差异均有统计学意义(P<0．05)。(2)胎盘滋养细胞浸润相关基因的蛋白表达水平:子痫前期组MMP-9、MMP-2基因的蛋白表达水平分别为1．07±0．35和0．74±0．23,均明显低于正常妊娠组的2．43±0．92和1．48±0．78,差异均有统计学意义(P<0．05)。子痫前期组胎盘KISS-1和TIMP-1蛋白表达水平分别为2．46±0．39和1．51±0．40,均明显高于正常妊娠组的0．91±0．35和0．93±0．56,差异均有统计学意义(P<0．05)。子痫前期组胎盘滋养细胞TIMP-2蛋白表达水平与正常妊娠组及高血压组比较,差异均无统计学意义(P>0．05)。(3)胎盘MMP-9和MMP-2酶比活性:子痫前期组分别为(2．67±0．53)和(1．13±0．28)灰度·g-1·L-1,均明显低于正常妊娠组的(8．44±3．70)和(3．87±1．43)灰度·g-1·L-1,差异均有统计学意义(P<0．05)。结论子痫前期患者胎盘滋养细胞促进浸润基因。MMP-9、MMP-2表达降低和抑制浸润基因KiSS-1和TIMP-1表达升高,可能在子痫前期胎盘缺血缺氧中起重要作用。     

miR-18a对人正常滋养细胞中MMP-2、MMP-9表达的影响

目的:研究子痫前期(pre-eclapmpsia,PE)相关微小RNA-18a(miR-18a)对人正常滋养细胞(HTR-8细胞)中基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9的影响。方法:按照HTR-8细胞中miR-18a的表达情况分为3组(每组重复5次):miR-18a过表达组、miR-18a抑制组、阴性对照组;实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测转染后HTR-8细胞中miR-18amRNA的表达量;RT-qPCR和蛋白质印迹(Western blotting)检测转染后HTR-8细胞中MMP-2、MMP-9mRNA和蛋白表达量。结果:miR-18a过表达组miR-18amRNA表达量比阴性对照组升高,miR-18a抑制组miR-18amRNA表达量比阴性对照组降低,差异均有统计学意义(均P<0.001)。miR-18a抑制组MMP-2、MMP-9mRNA和蛋白表达量比阴性对照组降低,差异均有统计学意义(均P<0.001)。结论:miR-18a影响人正常滋养细胞中MMP-2、MMP-9在mRNA及蛋白水平的表达,可能通过该途径参与对滋养细胞浸润能力的调控。     

川芎嗪对子痫前期脐血清诱导脐静脉内皮细胞NF-κB活性及VCAM-1表达的影响

目的:探讨川芎嗪对子痫前期患者脐静脉血清诱导脐静脉内皮细胞(HU-VEC)核因子-κB(NF-κB)活性及其靶基因血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达变化的影响。方法:用胰酶消化法培养正常妊娠HUVEC,传代后待细胞长满至70%~80%,加或不加川芎嗪作用30min后分别加入正常妊娠及子痫前期脐静脉血清,培养48h后,MTT测定细胞活力,流式细胞学测定细胞凋亡率,Western-blot测定HUVEC NF-κB的表达,酶联免疫检测VCAM-1的表达。结果:子痫前期患者脐静脉血清培养HUVEC的增殖活力明显低于正常妊娠组,胞核NF-κB及VCAM-1表达明显高于正常妊娠组(P<0.01),子痫前期患者脐静脉血清培养HUVEC的细胞凋亡率明显高于正常妊娠组(P<0.01)。加川芎嗪预处理后,子痫前期组HUVEC增殖活力明显增加,细胞凋亡率、胞核NF-κB及VCAM-1表达明显下降(P<0.01)。结论:川芎嗪可抑制子痫前期患者脐静脉血清诱导的HU-VEC凋亡,NF-κB的核转位及VCAM-1的表达。     

白细胞介素-1β对人早孕期细胞滋养层细胞核因子-κB的激活机制

目的:研究核因子-κB(NF-κB)在离体培养的人早孕期细胞滋养层细胞激活的机制。方法:离体培养人早孕期细胞滋养细胞,以白细胞介素-1β(IL-1β)和NF-κB抑制剂——吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)作为处理因素,通过免疫荧光检测NF-κB的亚基p65的核转位;凝胶电泳迁移率改变分析(EMSA)法检测NF-κBDNA结合活性。结果:①IL-1β作用30min后细胞滋养细胞出现了p65的核转位;②细胞滋养细胞NF-κBDNA结合活性显著增高;PDTC能显著降低NF-κBDNA结合活性。结论:IL-1β在离体培养的人早孕期细胞滋养细胞可引起NF-κB的短暂激活,PDTC可以抑制IL-1β诱导的NF-κB的激活。这为进一步研究激活或抑制NF-κB是否能调节NF-κB的靶基因、尤其是在胚胎着床和妊娠发挥重要作用的靶基因提供了理论基础。     

血管内皮祖细胞与妊娠的研究进展

血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPC）是血管内皮细胞的前体细胞,主要来源于骨髓、脐血、成人外周血,不仅参与胚胎血管形成,而且在出生后的血管生成过程中有重要的促进作用。妊娠是对母体血液循环系统的巨大挑战,需要机体系统性地适应和子宫发生足够变化。子痫前期患者及妊娠期糖尿病患者中多存在内皮功能的失衡。就近年对妊娠中EPC的研究进展综述。     

血管内皮祖细胞与妊娠的研究进展

血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPC）是血管内皮细胞的前体细胞,主要来源于骨髓、脐血、成人外周血,不仅参与胚胎血管形成,而且在出生后的血管生成过程中有重要的促进作用。妊娠是对母体血液循环系统的巨大挑战,需要机体系统性地适应和子宫发生足够变化。子痫前期患者及妊娠期糖尿病患者中多存在内皮功能的失衡。就近年对妊娠中EPC的研究进展综述。     

二氯化钴化学缺氧对细胞滋养层细胞凋亡及侵润的影响

目的:研究二氯化钴(CoCl2)诱发化学缺氧对培养的细胞滋养层细胞凋亡及侵润的影响。方法:采用MTT和流式细胞术检测细胞滋养层细胞的增殖和凋亡,并运用Transwell体外侵润实验检测化学缺氧对细胞滋养层细胞侵润能力的影响。结果:CoCl2可抑制细胞滋养层细胞增殖,并促进其凋亡,以缺氧24h最为明显(P<0.05)。CoCl2诱导细胞滋养层细胞缺氧24h,对其侵润及运动有显著抑制作用(P<0.05)。结论:CoCl2诱导缺氧抑制细胞滋养层细胞增殖并促进其凋亡,同时也抑制了细胞滋养层细胞的侵润。     

不同氧浓度对原代培养人早孕绒毛细胞滋养细胞血管内皮生长因子及其可溶性受体表达的影响

目的:探讨原代培养人早孕绒毛细胞滋养层细胞(CT)在缺氧时血管内皮生长因子(VEGF)和可溶性血管内皮生长因子受体-1(sFlt-1)的表达。方法:将经胰蛋白酶/DNA酶Ⅰ联合消化通过Percoll分离纯化得到的细胞滋养层细胞进行原代培养。采用ELISA法测定正常氧浓度(20%O2,A组)、低氧浓度Ⅰ组(8%O2,B组)和Ⅱ组(2%O2,C组)及低氧复氧组(2%O2/20%O2,D组)培养的不同时段细胞上清液中VEGF和sFlt-1蛋白的表达。结果:B组、C组于培养72h、96h、120h、144h时间点测得VEGF、sFlt-1的浓度明显高于A组(P<0.01);D组于培养96h、120h、144h后测得VEGF、sFlt-1的浓度较72h低,且分别与A组同期相比无明显差异(P>0.05)。结论:细胞滋养层细胞在低氧条件下VEGF、sFlt-1分泌增加,低氧复氧后VEGF和sFlt-1表达均恢复正常。     

Oestradiol Stimulates Morphological and Functional Differentiation of Human Villous Cytotrophoblast

Trophoblast differentiation is a complex process involving interactions of cytotrophoblastic cells with their evolutive milieu. During pregnancy, the feto-placental unit produces large amounts of steroids. Progesterone and oestradiol are increasingly produced when the syncytiotrophoblast is highly differentiated. Furthermore, receptors to these hormones are expressed by the trophoblast. This led us to test the hypothesis that steroid production could affect the morphological and functional differentiation of the trophoblast during gestation.The fusion of cytotrophoblastic cells into syncytiotrophoblast was assessed using fluorescence recovery after photobleaching for gap junctional communication analysis (gap-FRAP), desmoplakin immunostaining and connexin 43 expression. In parallel, functional differentiation was assessed by beta-human chorionic gonadotrophin (betahCG) production and human chorionic somatomammotropin (hCS) expression analysis. The presence of oestradiol, 1 microm, increased the percentage of coupled cells (3. 8-fold), connexin 43 expression and stimulated the syncytium formation. In parallel, oestradiol (1, 3 and 5 microm) induced a significant increase in the daily hCG production. The steroid action was specific, as the stimulatory effects were inhibited by tamoxifen. Oestradiol also stimulated hCS expression (51 per cent compared to control after 3 days). As trophoblastic differentiation is specifically stimulated by hCG, oestradiol could act via the stimulation of hCG production or via a direct action. In the presence of an efficient concentration of hCG antibody, oestradiol still stimulated hCS expression, suggesting a self-sufficient effect of the steroid. Physiological concentrations of progesterone were ineffective in modulating trophoblast differentiation.In conclusion, oestradiol could be implicated in the maturation and aging of the trophoblast.     

Inhibitors of Heme Oxygenase Reduce Invasion of Human Primary Cytotrophoblast Cells In vitro

Having previously demonstrated that heme oxygenase (HO) is expressed on invasive trophoblast within the human placental bed, we have now further hypothesised that HO may play a role in trophoblast invasion. To begin to test this hypothesis we have used a well characterised in vitro model of trophoblast invasion to determine whether antibodies raised against HO-1 and HO-2, or selective inhibition of HO with the HO inhibitor zinc protoporhyrin-9 (Zn PP-9), would affect the invasive ability of trophoblast cells. Cytotrophoblast cells were purified from term human placenta then cultured on Matrigel-coated chambers in the presence or absence of HO antibodies or Zn PP-9. The HO-1 antibody had no effect on invasion whereas the presence of the HO-2 antibody significantly inhibition invasion (p < 0.05). The presence of Zn PP-9 resulted in a significant reduction in invasion (p < 0.05) whereas the vehicle alone had no effect. Taken together these results suggest, that at least in vitro, HO-2 may be important in controlling trophoblast invasion.     

Relaxin Stimulates Interleukin-6 and Interleukin-8 Secretion from the Extraplacental Chorionic Cytotrophoblast

In the absence of infection, decidual relaxin (RLN) expression is increased in patients with preterm premature rupture of the membranes (PPROM) resulting in preterm birth, but it is not known whether inflammation stimulates RLN expression or vice versa. This study examined the effect of lipopolysaccharide (LPS) on the expression of RLN mRNA and secreted protein and whether RLN treatment influences secretion of proinflammatory cytokines from the fetal membranes. Explants of human fetal membranes in vitro and rhesus monkey fetal membranes in vivo were treated with LPS, which increased expression of IL-6 but had no effect on RLN. RLN treatment stimulated IL-6 and IL-8 secretion from choriodecidual explants in a subset of patients, as well as from isolated chorionic cytotrophoblast cells but not decidual cells. In vivo results obtained in rhesus monkeys after intra-amniotic infusion of RLN demonstrated increased IL-6 and IL-8 concentrations in amniotic fluid. Our results indicate that increased decidual RLN expression is independent of LPS but may induce a local sterile inflammatory process which potentially contributes to extracellular matrix degradation and weakening of the fetal membranes.