丙型肝炎病毒非结构区NS3基因在大肠埃希菌中的可诱导性表达

目的 构建丙型肝炎病毒（HCV）NS3基因的原核细胞表达载体。实现在大肠埃希菌中的可诱导性表达。方法 应用聚合酶链反应（PCR）技术，以美国HCV-H株全长cDNA质粒为模板，扩增获得NS3基因片段，克隆到原核表达载体pET-30C( )中，构建原核表达载体pET-NS3，转化BL21（DE3）宿主菌，以IPTG诱导，获得NS3蛋白的可诱导性表达，以HCVNS3的单链可变区抗体（ScFv)证实表达的NS3蛋白的特异性，结果 以HCVNS3基因序列特异性引物，PCR扩增获得1893bp的NS3DNA征段，插入pET-30C( )表达载体，转化BL21（DE3）受体菌，经培养，IPTG诱导，获得了重组HCVNS3蛋白的表达，以HCVNS3的ScFv证实了表达的重组蛋白HCVNS3的特异性。结论 以大肠埃希菌表达了HCVNS3的重组蛋白质。     

登革2型病毒NS3蛋白NTPase/RNA解旋酶结构域的原核表达及活性研究

目的 表达登革病毒非结构蛋白NS3 NTPase／RNA解旋酶结构域（dNS3），纯化表达产物并对其活性作初步研究。方法提取感染登革2型病毒的BHK-21细胞总RNA，RT-PCR扩增目的基因，经NcoⅠ、HindⅢ双酶切后连入表达载体pET28a，转化宿主菌BL21（DE3），优化诱导表达条件，SDS-PAGE和免疫印迹鉴定表达蛋白。表达产物经亲和层析纯化，超滤浓缩脱盐，孔雀绿钼酸铵法检测NTPase活性。结果成功构建重组表达载体pET28a-dNS3并在大肠杆菌中获得可溶性表达，纯化产物经测定具有良好的NTease活性及抗原性。体外条件下证实登革2型病毒非结构蛋白NS5（RDRP）对dNS3的ATPase活性有促进作用，提示在病毒复制时NS3与NS5间的相互作用对NS3的生物活性及对病毒复制过程可能具有调控作用。结论本研究为基于抑制NS3 NTPase／RNA解旋酶活性的抗病毒药物的筛选提供了实验依据。     

丙肝病毒NS5A蛋白对NS5B的RdRP活性影响的研究

丙型肝炎病毒 (Hepatitis C virus,HCV )非结构蛋白 (Nonstructural,NS) 5 A在 HCV基因组复制中的作用目前尚不清楚。本文研究 His- NS5 A对 NS5 B的 RNA依赖性 RNA酶 (Rd RP)活性的影响 ,以了解 NS5 A在HCV RNA复制中的作用。采用变性 -复性方法 ,纯化大肠杆菌表达的重组组氨酸 NS5 A融合蛋白。 GST结合洗脱实验 (GST pull- down assay)研究 NS5 A和 NS5 B是否结合。以不同的摩尔浓度比 ,将纯化的 NS5 B和 NS5 A蛋白混合 ,检测 NS5 A对 NS5 B的 Rd RP活性的影响。获得高得率的纯化 His- NS5 A蛋白。重组 NS5 A蛋白可在体外与NS5 B结合并抑制后者的 Rd RP活性。本研究报道了纯化重组 His- NS5 A蛋白的变性 -复性方法 ,结果显示纯化的重组 NS5 A在体外可与 NS5 B相互结合 ,并明显抑制 NS5 B Rd RP活性。提示了 HCV NS5 A在病毒复制中的可能作用。     

HCV非结构蛋白NS5A人源单链可变区抗体基因的筛选与鉴定

目的 筛选、鉴定抗丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS5A的人源单链可变区抗体（ScFv)的编码基因,为HCV NS5A蛋白质生物学功能的研究及抗HCV的基因治疗研究开辟新途径。方法 采用噬菌体表面展示技术,以重组纯化的HCV非结构蛋白NS5A为固相抗原,从噬菌体单链可变区抗体半合成库中经过5轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程,获得抗原结合活性和特异性较强的HCVNS5A人源单链可变区抗体基因片段的阳性克隆,并对其进行免疫检测及序列测定,结果 筛选得到的ScFv片段基因核苷酸序列为789nt,编码由262个氨基酸残基组成的多肽,具有典型的免疫球蛋白轻链和重链可变区的结构特点,基因编码产物具有HCV NS5A蛋白反应的免疫学活性和特异性。结论 利用噬菌体抗体库技术,成功获得了HCV NS5A人单链可变区抗本ScFv编码基因,并获得了可溶性单链抗体的表达。     

HCV NS5A-B片段的表达及在酶活性研究中的应用

目的：利用原核表达载体pBVIL1，表达丙型肝炎病毒非结构蛋白（NS3）丝氨酸蛋白酶催化底物NS5A—B小分子，为进一步研究蛋白酶活性提供方法学。方法：将PCR合成的NS5A—B（2412—2427aa）基因直接插入高效原核表达载体pBVIL1，融合表达NS5A—B片段．包涵体形式的表达产物用8mol／L脲溶解后，采用离子交换和凝胶过滤两步纯化。利用SDS—PAGE、Western blot和ELISA方法，于37℃酶催化条件下，分析NS5A—B底物的降解活性。结果：（1）构建了pBVIL1／NS5A—B重组质粒，鉴定证明NS5A—B基因片段正确地插入表达载体上：融合蛋白在转化质粒的HB101菌中得到高效表达。分离纯化重组蛋白后浓度可达0．73g／L。（2）在NS3蛋白酶作用不同时间后，用SDS—PAGE和Western blot证实，底物带可被明显降解，ELISA分析也证明，NS5A—B具有酶底物活性。结论：含有酶切位点的NS5A—B融合蛋白可被NS3丝氦酸蛋白酶有效地降解，可用作为NS3蛋白酶的底物，可替代全长NS5A—B和化学合成肽用于酶活性和酶阻断剂的研究     

HCV NS5A基因在hepG2细胞中的表达以及对PI3K的影响

目的：探讨HCV—NS5A对PI3K表达的影响。方法：应用PCR技术从含有HCV全长开放阅读框的质粒中获得NS5A全长基因片段，利用基因重组技术将其克隆至真核表达载体pcDNA3．0（-）中。通过酶切、PCR及测序鉴定，NS5A基因已正确插入到pcDNA3．0（-）中，再利用脂质体转染HepG2细胞。结果：经RT—PCR及Western blot检测，HCV的NS5A基因在HepG2细胞中获得表达，而且在表达重组NS5A的转染HepG2细胞中，检测到PI3K蛋白的表达。结论：NS5A可在体外激活PI3K及其信号通路。     

HCV单片段抗原EIA与重组免疫印迹分析对丙型肝炎病毒抗体检测比较的研究

利用基因重组技术分别克隆表达了丙型肝炎病毒(HCV)蛋白相对应的抗原 (HCV C、NS3、NS4、NS5 ) ,组建了单片段抗原EIA检测试剂。与进口重组免疫印迹分析试剂(OrhtoHCVRIBA3.0 )分别检测了国家第 3代抗 HCV参比血清盘和临床血清样品 ,并对检测结果进行了初步比较。1　材料和方法1.1　HCV分片段抗原的研制　选择了抗原性强的HCV不同优势抗原表位 ,氨基酸位置分别为HCV C :10～ 5 3aa ;NS3:1192～ 14 5 7aa;NS4 :1916～ 194 7aa ;NS5 :6 796～ 7374aa。基因插入原核表达载体pBVIL 1中 ,在E .coli中表达1.2　抗 HCV分片…     

产肠毒素D金黄色葡萄球菌的筛选及其基因克隆和蛋白表达

目的克隆金黄色葡萄球菌肠毒素D基因（entD），表达和纯化其重组蛋白（rSED），以进一步制备抗rSED抗体，研制SED金标免疫快速检测试纸条。方法利用PCR技术．从野生型金黄色葡萄球菌中筛选产肠毒素D金黄色葡萄球菌标准株，扩增entD基因，克隆至pGEM—T Easy载体．亚克隆至原核表达载体pET28a，重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达蛋白，Ni-NTA亲和层析纯化蛋白，免疫印迹检测抗原活性。结果分离获得1株产肠毒素D金黄色葡葡球菌标准株．成功克隆entD序列．测序表明该基因共684bp，与其他entD序列（GenBank登陆号：M28521）具有99％的同源性。rSED蛋白在大肠杆菌中得到高效的可溶性表达。免疫印迹结果表明．rSED蛋白能被抗天然SED抗体识别。结论通过基因重组技术制备的重组SED蛋白具有良好的免疫反应性。     

卵巢癌抗独特型单链抗体 6B11ScFv 与鼠 HSP70 融合蛋白的构建、表达及鉴定

 目的 构建卵巢癌抗独特型单链抗体 6B11ScFv 与小鼠热休克蛋白 70（mHSP70）融合蛋白 6B11ScFv/mHSP70,并初步鉴定其免疫活性。 方法 根据 Genebank 上已发表的 mHSP70 基因序列（NM_010478）合成引物行 PCR 扩增,以扩增所得 mHSP70 基因插入 pET30a（+）-6B11ScFv 质粒后转化入 E.coli DH5α,获得 pET30a（+）-6B11ScFv/mHSP70 重组质粒。将鉴定正确的 pET30a（+）-6B11ScFv/mHSP70 重组质粒转化入 E.coli BL21（DE3）,获得 E.coli BL21（DE3）[pET30a（+）-6B11ScFv/mHSP70]重组菌株。以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达并行 SDS-PAGE 分析,对表达产物进行复性和 Ni2+-NTA 柱亲和层析纯化后,采用蛋白质印迹法和 ELISA 方法进行鉴定和免疫活性检测。 结果 6B11ScFv/mHSP70 融合基因测序结果基本与理论序列相符。SDS-PAGE 分析显示,重组菌株表达产物相对分子质量与预期相符。复性、亲和层析纯化后的蛋白复性率达 20.9%,蛋白纯度达 95% 以上。蛋白质印迹分析证实 6B11ScFv/mHSP70 融合蛋白相对分子质量为 104 000,ELISA 检测表明其具有 6B11ScFv 和 mHSP70 的免疫 活性。 结论 构建表达的 6B11ScFv/mHSP70 融合蛋白具有良好的免疫活性,为进一步研究其体内外抗卵巢癌活性奠定了基础。     

庚型肝炎病毒NS5区优势抗原表位的表达及其抗原性的初步评价

目的 表达庚型肝炎病毒（HGV）基因且NS5区部分基因重组抗原，分析其抗原性。方法 分别亚克隆了HGV NS5a、NS5b以及NS5b与C区嵌和的基因至pThoiC表达载体上，构建成3个重组表达质粒，分别大肠埃希菌JM109（DE3），用IPTG诱导表达重组蛋白。表达产物经纯化后采用Western blot和间接ELISA方法分析3个重组蛋白的抗原性。结果 经酶切和序列分析鉴定正确，3种表达蛋白均高效表达且相对分子质量与预期大小相符。Western blot分析和间接ELISA试验表明，3种表达蛋白均能与抗－HGV阳性血清发生特异性反应。将应用重组蛋白检测的抗－HGV抗体与混合重组抗原（包括C区合成肽、NS5a合成肽、NS3区基因重组抗原）的检测结果进行了比较，在混合重组抗原阳性的22份血清中，P5a检出率为68％（15／22），P5b检出率为91％（20／22），Pc-5b检出率为73％（16／22）。在70份阴性标本中，3种抗原的检出率分别为P5a:7%(5/70);P5b:1%(1/70);Pc-5b:6%(4/70)。3个重组抗原单独检出阳性的标本，其中有一部分经RT－PCR检测亦为阳性。结论 原核表达的NS5区蛋白所检测的抗－HGV抗体不能完全被其他区段的抗原所覆盖，是免疫诊断HGV感染所必需的抗原表位之一。     

丙型肝炎病毒不同基因型NS3蛋白的抗原异质性分析

目的探讨不同基因型丙型肝炎病毒(HCV)NS3蛋白的抗原特性及其用于抗-HCV检测的意义。方法分别构建和表达含有HCV1型和6型NS3基因片段的重组质粒和重组蛋白，以EIJSA法和Western blot分析不同基因型重组蛋白与已知抗-HCV阳性血清的抗原反应性。结果HCV1型和6型NS3重组蛋白氨基酸序列的同源性为83．2％；85份抗-HCV阳性血清以此不同基因型HCV NS3单片段抗原检测，阳性检出率分别为61．2％(1型)和58．8％(6型)，其中有7份标本以NS3-1型抗原检测阴性，但可被NS3-6型抗原检出，反之，有9份血清以NS3-6型重组蛋白检测为阴性，而NS3．1型检测阳性；54份大学生体检血清和39份阴性质控血清以此两种抗原检测均为阴性。结论HCV1型和6型NS3重组蛋白存在抗原异质性，在发展HCV抗体检测试剂时需考虑加入不同基因型的NS3抗原。     

金黄色葡萄球菌 eap 基因的克隆与表达

 目的 构建携带 eap 基因的原核表达载体，诱导表达具有活性的重组 EAP 融合蛋白。 方法 PCR 法扩增金黄色葡萄球菌基因组 DNA，回收、 纯化的扩增产物与 pMD18-T 载体相连接得重组质粒 pMD18-T-EAP，转化 E.coli BL21（DE3）感受态细胞，酶切鉴定；未酶切组作为对照组重组质粒 pMD18-T-EAP 和 pET28a（+）表达载体分别用 Nde I 和 Xho I 限制性内切酶双酶切、连接，转化 E.coli BL21（DE3）感受态细胞，酶切鉴定；空载体作为对照组。用不同浓度（终浓度 1、2、4、8 mmol/L）和不同诱导时间（1、2、3、4、5、6 h）的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）对阳性重组菌进行表达优化，分别取 E.coli上清液和沉淀做电泳分析。应用 MagneHis^TM 蛋白纯化系统纯化重组 EAP 融合蛋白，并通过薄层扫描测定蛋白质的浓度。 结果 所获 eap 基因与 GeneBank 的基因序列同源性 > 99%；氨基酸同源性达 100%。重组质粒经 IPTG 诱导，阳性重组菌转化子均有表达；当吸光度（A ）值等于 0.6 ~ 0.8 时，相对分子质量约 70 000 处出现目的蛋白条带。破碎的重组菌 pET28a-EAP上清液中目的蛋白条带较清楚，沉淀中几乎看不到。终浓度 1 mmol/L 为最佳蛋白表达工作浓度。IPTG 诱导 1 h 重组 EAP 融合蛋白有一定量的表达，随着时间的延长，表达量增加不明显，3 h 时的表达量达最高，之后，蛋白表达量变化不明显。表达的重组 EAP 融合蛋白含量占全菌体蛋白的 29.6%。 结论 成功地克隆和表达了金黄色葡萄球菌重组 EAP 融合蛋白，为进一步研究以 EAP 蛋白作为免疫原预防和治疗由金黄色葡萄球菌引起的疾病奠定基础。     

HCV免疫学诊断抗原与链亲和素融合蛋白的制备及应用研究

目的 制备带有链亲和素（SA）标签的丙型肝炎病毒（HCV）融合蛋白,并初步探讨其在抗-HCV ELISA检测中的应用.方法 构建了HCV诊断抗原与链亲和素融合蛋白重组表达质粒pET-11d-C44P-SA,在大肠埃希菌BL21（DE3）中表达,并用Western Blot进行鉴定,表达的融合蛋白经镍金属螯合（Ni-NTA）层析柱进行纯化,透析复性后分别包被生物素化以及普通酶联板,进行人血清抗-HCV检测.结果 成功构建了带有SA标签的重组表达质粒,其在大肠埃希菌BL21（DE3）中实现高效表达,制备的融合蛋白纯度可达90%以上.建立ELISA法进行人血清抗-HCV检测显示：融合蛋白包被生物素化酶联板检测灵敏度与特异性明显高于普通酶联板.结论 构建的融合蛋白作为包被抗原,结合利用SA标签与生物素化酶联板,明显提高了抗-HCV检出的灵敏度与特异性,该策略为进一步提高抗-HCV检测试剂的质量打下了基础.     

Expression of immunoreactive forms of the hepatitis C NS5A protein in E. coli and their use for diagnostic assays

Summary.  In this study different forms of the hepatitis C virus (HCV) NS5A protein, including a nearly full-length, an amino-terminal and a carboxy-terminal truncated form were produced in E. coli as fusion proteins with the MBP or the GST protein. The chimeric proteins were tested for their reactivity with sera from HCV infected patients by immunoblot and ELISA assays. A panel of 110 sera specimens, including 39 HCV-positive sera, 27 sera from patients with non-HCV-associated liver disease and 44 healthy individuals were analyzed for the presence of antibodies to NS5A. Twenty four (61 %) out of the 39 HCV positive sera, showed reactivity against the nearly full length NS5A, 21 (54 %) against the amino-terminal part of NS5A and 20 (51 %) against the carboxy-terminal part of the NS5A protein in immunoblot assays, suggesting that immunoreactive epitopes are present both at the carboxy- and the amino- terminal part of the protein. None of the 71 HCV-negative serum samples showed any reactivity against the NS5A antigens. With the exception of one patient, similar data were obtained with an ELISA assay based on the use of the nearly full-length NS5A antigen. The data indicate that new forms of NS5A may be potentially valuable antigens for the development of serological assays for HCV. Received December 26, 2001; accepted April 15, 2002 Published online July 10, 2002     

Identification of B cell epitopes of hepatitis C virus RNA dependent RNA polymerase

The aim of this study was to identify the B cell epitopes of hepatitis C virus (HCV) NS5B RNA dependent RNA polymerase (RdRp). The truncated HCV NS5B protein NS5B-dc21 was expressed in Escherichia coli and its antigenicity was confirmed by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) using 130 HCV-positive human sera and 15 negative sera. Antibodies specific to NS5B-dc21 protein were purified by affinity chromatography using sepharose-4B coupled with the recombinant protein. A 12-mer phage displayed random peptide library was screened four rounds with the purified antibodies. Three epitopes were identified from the phage library, which correspond to amino acids 2444-2452, 2521-2528, and 2915-2925 of HCV RdRp. These epitopes were then expressed in E. coli as fusion proteins with phage M13 pIII protein. ELISA demonstrated that two of these epitopes (P4 and P34, corresponding to amino acids 2443-2452 and amino acids 2512-2528, respectively) have good reactivity and sensitivity. Mutagenesis study of P4 peptide showed that this epitope, which is derived from a phage displayed library, exhibited higher affinity with HCV serum than the corresponding original HCV sequences.     

Design of novel conformational and genotype-specific antigens for improving sensitivity of immunoassays for hepatitis C virus-specific antibodies

The current commercially licensed enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for hepatitis C virus (HCV) mainly use recombinant proteins containing linear epitopes. There is evidence, however, that conformational epitopes of HCV are more immunoreactive. Thus, we have designed an HCV antibody assay that employs a conformational protein, NS3NS4a PI (with functional protease and helicase activities), and a linear fusion protein, multiple-epitope fusion antigen 7.1 (MEFA 7.1) or MEFA 7.2. We have shown that NS3NS4a PI detects early-seroconversion conformation-sensitive antibodies better than c33c antigen. The correct conformation of NS3NS4a PI also cross-reacts with different genotype samples better than the c33c antigen. MEFA 7.1 and MEFA 7.2 incorporate all the major immunodominant and genotype-specific epitopes of HCV core, E1, E2 hypervariable region 1 (HVR1), E2 HVR1-plus-HVR2 consensus, NS3, NS4, and NS5. Since MEFA 7.1 is degraded by the active NS3NS4a PI protease, we designed a second MEFA 7.2 construct in which the six protease cleavage sites found in MEFA 7.1 were eliminated by amino acid mutation. We demonstrate here that MEFA 7.2 remains intact in the presence of NS3NS4a PI and preserves the epitopes present in MEFA 7.1. Compared to currently licensed assays, an ELISA incorporating a combination of the two antigens NS3NS4a PI and MEFA 7.1 or 7.2 demonstrates better serotype sensitivity and detects seroconversion earlier in many commercially available panels. We believe that an assay using NS3NS4a PI and MEFA 7.1 or 7.2 may have the potential to replace current HCV immunoassays for better sensitivity.     

结核分枝杆菌CFP-10／ESAT-6融合蛋白模拟抗原表位的筛选

目的探讨噬菌体展示随机肽库技术在结核分枝杆菌培养滤过蛋白10（CFP-10）／早期分泌抗原靶点6（ESAT-6）融合蛋白（CE融合蛋白）模拟抗原表位筛选中的应用。方法以抗CE融合蛋白多克隆抗体为靶分子，对随机噬菌体7肽库进行筛选，经3轮生物淘选后，随机选取18个单噬菌体进行测序分析。采用双抗体夹心和竞争ELISA方法对测序后噬菌体进行阳性克隆及其活性鉴定。采用间接ELISA方法，选取阳性单噬菌体与CE融合蛋白分别对20份活动性肺结核患者和10份有卡介苗接种史健康人的血清标本抗体进行检测。结果经过3轮生物淘选，能与靶分子特异性结合的噬菌体得到了明显富集。18个单噬菌体测序共获得9种序列，其中单噬菌体5、6、18的氨基酸序列均包含Trp-Asp-Ala-Thr（WDAT）保守序列，该序列与ESAT-6第58-61位氨基酸的序列一致。9种序列中各取1个单噬菌体经双抗体夹心和竞争ELISA检测，有7个单噬菌体（1、5、6、10、13、14、18，S／N值依次为9.2、9.7、9.4、8.9、9.6、9.9、9.0）确定为具有免疫活性的阳性克隆。选取含有WDAT保守序列的阳性单噬菌体5与CE融合蛋白分别对2种血清标本抗体进行间接ELISA检测结果显示，单噬菌体5对2种血清标本抗体检测的吸光度值均高于CE融合蛋白（分别为0．931±0．298 vs 0．317±0．157、0．496±0．073 vs 0．118±0．026，均P〈0．05）；单噬菌体5对活动性肺结核患者血清标本抗体的检出率（95％，19／20）明显高于CE融合蛋白（60％，12／20），而对有卡介苗接种史健康人血清标本抗体的检出率（9／10）低于CE融合蛋白（10／10）。结论利用噬菌体展示随机肽库技术成功筛选出7个CE融合蛋白的模拟抗原表位，并获得了定位于ESAT-6第58-61位氨基酸序列的CE融合蛋白的1个线性B细胞抗原表位，提高了ELISA检测的敏感性，为进一步研究CE融合蛋白的?