构建干扰RhoA的短发夹RNA真核表达载体

目的利用pGenesil-1质粒构建针对RhoA的短发夹RNA(shRNA)表达载体。方法设计2个shRNA结构的互补DNA序列,经退火成双链,胶回收酶切pGenesil-1大片段,T4DNALigase连接酶切大片段和DNA序列,得到质粒pGenesil-1-RhoA1和pGenesil-1-RhoA2.转化感受态细胞DH5a,扩增,提取重组质粒进行酶切鉴定。结果成功构建靶向RhoA的shRNA重组质粒载体.酶切鉴定和测序分析重组质粒,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功。结论表达靶向RhoA的shRNA表达框成功构建在重组质粒载体上。     

EB病毒基因Z2A原核表达载体的构建及表达

目的 构建能分泌性表达EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)融合基因Z2A的BCG重组质粒并导入BCG.方法 分别以BCG和EBV融合基因cDNA为模板,通过PCR扩增得到139 bp的BCG-Ag85B信号肽序列和2291 bp的Z2A基因序列.将BCG-Ag85B信号肽序列与大肠杆菌-BCG穿梭表达载体pMV261重组,得到重组质粒pMVS.再将EBV融合基因序列Z2A亚克隆至pMVS中,得到重组质粒pMVZ2A,电转化导入BCG,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳对表达产物进行分析.结果 构建的重组质粒pMVZ2A经双酶切、PCR扩增及序列测定证实,克隆基因BCG-Ag85B信号肽和Z2A正确插入载体pMV261.重组质粒pMVZ2A电转化导入BCG后能在BCG中有效表达相应蛋白.结论 构建的重组质粒pMVZ2A能在BCG中表达相应蛋白.这一结果为改造BCG及发展新型抗EBV和结核杆菌的双价疫苗奠定了基础.     

EB病毒基因Z2A原核表达载体的构建及表达

目的 构建能分泌性表达EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)融合基因Z2A的BCG重组质粒并导入BCG.方法 分别以BCG和EBV融合基因cDNA为模板,通过PCR扩增得到139 bp的BCG-Ag85B信号肽序列和2291 bp的Z2A基因序列.将BCG-Ag85B信号肽序列与大肠杆菌-BCG穿梭表达载体pMV261重组,得到重组质粒pMVS.再将EBV融合基因序列Z2A亚克隆至pMVS中,得到重组质粒pMVZ2A,电转化导入BCG,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳对表达产物进行分析.结果 构建的重组质粒pMVZ2A经双酶切、PCR扩增及序列测定证实,克隆基因BCG-Ag85B信号肽和Z2A正确插入载体pMV261.重组质粒pMVZ2A电转化导入BCG后能在BCG中有效表达相应蛋白.结论 构建的重组质粒pMVZ2A能在BCG中表达相应蛋白.这一结果为改造BCG及发展新型抗EBV和结核杆菌的双价疫苗奠定了基础.     

人肠三叶因子毕赤酵母表达载体的构建与鉴定

目的构建人肠三叶因子(hITF)的毕赤酵母表达载体。方法从人结肠黏膜提取总RNA,经RT-PCR得到hITF cDNA,用PCR方法扩增hITF基因,并将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中,构建含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的重组表达质粒pPIC9/hITF。结果通过酶切和基因序列分析确定插入pPIC9中的片段为hITF基因片段。结论重组质粒pPIC9/hITF的成功构建,为在真核细胞中高效表达hITF。并制备其抗体的进一步研究提供基础。     

重组组蛋白去乙酰化酶2-pEGFP-C2质粒的构建及表达

目的将组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)基因克隆入pEGFP-C2载体,探讨构建的质粒转染进非洲绿猴肾成纤维细胞COS-7株相关蛋白和mRNA的表达及蛋白分布部位的情况。方法从人肝癌细胞(HepG2)中获得组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)的cDNA,采用Xho I和BamH I双酶切,用T4连接酶将该cDNA连接pEGFP-C2质粒,将构建成功的pEGFP-C2-HDAC2质粒经PCR、限制性内切酶酶切和测序鉴定后转染非洲绿猴肾成纤维细胞(COS-7),荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,RT-PCR和Western blot鉴定HDAC2的表达。结果双酶切鉴定可见HDAC2质粒片段,转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达,PCR结果可检测到HDAC2 mRNA表达,同时Western blot可检测HDAC2蛋白和GFP蛋白的表达。结论成功构建了重组pEGFP-C2-HDAC2表达质粒,HDAC2蛋白可与绿色荧光蛋白在COS-7细胞中融合表达。     

大肠杆菌碱性磷酸酶在E.coli BL21(DE3)中的胞内可溶性表达

目的 构建原核表达载体pEAP,在E.coil BL21(DE3)中实现大肠杆菌碱性磷酸酶(Escherichia coli alkaline phosphatase,EAP)的胞内可溶性表达,为进一步研究工程菌的大体积培养条件、提高其表达量提供理论基础.方法 以质粒pDAP2为模板扩增不含信号肽的EAP基因,克隆至pGreen-S质粒构建表达载体pEAP,以E.coli BL21(ED3)菌株表达EAP,采用SDS-PAGE及EAP酶活性测定对表达产物的可溶性及胞内定位进行分析;Ni2+亲和层析方式纯化目的蛋白并测定其比活力.结果 经PCR、双酶切及测序分析证实载体构建正确,所表达目的蛋白主要以可溶性形式存在于BL21(ED3)菌体细胞质,其相对分子量与理论值相符(47kD)且具有EAP催化活性;目的蛋白经His Trap亲和层析纯化后,其电泳纯度在90％以上,酶比活力可达358.6 U/mg.结论 成功构建pEAP质粒表达载体,目的蛋白在BL21(ED3)菌株胞内主要以可溶性形式表达,为进一步更经济、高效制备EAP奠定了一定的实验基础.     

人肥大细胞羧肽酶分泌型真核表达载体的构建

目的:构建人肥大细胞羧肽酶(hMC-CP)分泌型真核表达载体pcDNA3.1/CP.方法:用免疫球蛋白k链的信号肽序列置换hMC-CP自身的信号肽序列,设计并合成引物,以hMC-CP基因为模板,扩增带有分泌信号肽的hMC-CP基因,DNA测序鉴定正确后,将PCR扩增产物定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1,通过酶切和DNA测序进行鉴定.结果:琼脂糖凝胶电泳显示PCR扩增出一条特异条带,酶切鉴定和序列测定结果表明大小为1269bp的DNA片段插入表达载体.结论:成功构建了hMC-CP分泌型真核表达载体,为进一步制备真核表达的重组hMC-CP奠定了基础.     

转化生长因子-β_1siRNA表达载体的构建

目的构建人转化生长因子β1(TGF-β1)基因siRNA质粒载体,为放射性肺损伤以及其他TGF-β1高表达疾病的基因治疗提供新的方法。方法根据人TGF-β1mRNA序列为模板,设计合成相应的寡核苷酸序列,经退火形成双链DNA片段,克隆到线性pRNAT载体中,用酶切方法对重组体进行鉴定,最后将构建的TGF-β1特异性siRNA质粒载体转染人胚肺成纤维细胞HFL-I细胞,通过通过荧光定量PCR检测和ELISA检测TGF-β1mRNA和蛋白的表达水平,以及流式细胞仪检测细胞凋亡。结果酶切和测序证实目的寡核苷酸片段已被准确克隆到线性pRNAT载体质粒中,与对照组相比,TGF-β1mRNA水平及蛋白水平的表达量均受到明显抑制,人胚肺成纤维细胞凋亡明显增加,统计有显著性差异(P<0.05)。结论成功构建了人TGF-β1基因siRNA质粒载体,对于放射性肺损伤以及其他TGF-β1高表达疾病的基因治疗奠定了基础。     

ATX短发夹shRNA表达载体的构建和测序

目的 构建ATX基因重组表达载体,并进行测序鉴定,为下一步探索肿瘤基因治疗的途径打下基础.方法 设计有小发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至Psilencer2.1-U6 neo质粒载体中构建重组表达载体,转化DH5a菌株,提取质粒行酶切鉴定后,进行序列鉴定.结果 成功构建了ATXshRNA重组表达载体.结论 ATX shRNA质粒表达载体的成功构建为研究ATX靶向RNA干扰抗肿瘤的作用打下基础.     

骨桥蛋白反义基因重组质粒的构建

目的 构建反义骨桥蛋白(OPN)基因重组质粒，以用于肝癌基因治疗的研究。方法 通过设计含有特定酶切位点的引物，以含有全长骨桥蛋白基因的质粒(pBlueScript—OPN)为模板，将PCR产物反向克隆至pcDNA3．1( )真核表达载体上，并经酶切鉴定及测序分析。结果重组质粒经酶切后出现913bp长的片段。测序分析结果与献报道结果完全一致。结论 反义骨桥蛋白基因表达质粒克隆成功，为恶性肿瘤的基因治疗提供了一种有效手段。     

Immobilization of penicillin G acylase onto ion exchange and hydrophobic resins

Penicillin G acylase was immobilized on numerous cation exchange resins and hydrophobic adsorbents. Amberlite XAD-7 was the matrix of choice among the matrices studied for the immobilization of enzyme. Binding of 96.8% and expression of 82.6% of the penicillin G acylase was achieved on XAD-7. Penicillin G acylase immobilised on XAD-7 was used for 80 cycles for the production of 6-PA in a stirred tank reactor.     

Biosynthesis of benzylpenicillin acylase by Escherichia coli NCIM-2400

Fermentation parameters for the production of penicillin G acylase by Escherichia coli NCIM 2400 have been evaluated. The bacterium produced the enzyme intracellularly when grown in nutrient broth containing PAA. PAA stimulated the enzyme synthesis by 8-10 fold and reduced the lag period. The optimum concentration of PAA for induction was 20 mM and addition of PAA prior to inoculation gave maximum production of PGA. Glucose, lactose, sorbitol, acetate and lactate even at 0.1% concentration catabolically repressed the enzyme formation. Peptone was the best utilised 'N' source for the enzyme production. Phosphate and yeast extract were found to be essential for both the growth and for enzyme biosynthesis. Temperature between 22-24 degrees C was optimum and under ideal condition E. coli NCIM 2400 produced 0.45-0.55 U/ml of penicillin G acylase.     

吸附法纯化青霉素酰化酶

目的纯化发酵液中的青霉素酰化酶。方法采用吸附纯化法。结果按 1 2 % (W /V)的比例将皂土加到含青霉素酰化酶的发酵上清液中 ,可将 98%的酶吸附 ,而同时吸附的杂蛋白质仅占发酵上清液总蛋白质的 14 5 %左右。吸附过程受pH影响较大 ,在 pH 6 5～ 7 5时 ,吸附效果最佳。使用不同种类的缓冲液洗涤酶 -皂土复合物 ,发现缓冲液的种类对酶的洗涤影响不大。使用含5 0 %以上的PEG和 8 0 %的NaCl的磷酸缓冲液可以将酶全部洗脱。结论此法可在常温下操作 ,酶活力收率较高 ,具有潜在的工业应用价值     

固定化青霉素酰化酶反应器的研制和应用(英文)

目的研制一个全新的 2 0 0L不锈钢固定化青霉素酰化酶反应器并在中试中应用。方法在罐内壁上安装三个盛酶柱 ,每根酶柱装入湿纤维状固定化酶 1 5kg,酶活力 76 2IU·g-1(以湿品为基础计算 )。以HBO3 作缓冲液 ,底物青霉素G钾的质量浓度为 80 g·L-1。每批投料 12kg,每批裂解反应 90min。结果 15批之后 ,剩余酶活力 6 85IU·g-1(以湿品为基础计算 ) ,6 APA收率平均达 89 8%。结论 6 APA生产中使用新的固定化青霉素酰化酶反应器将提高 6 APA的收率 ,减少固定化青霉素酰化酶的损耗。     

青霉素G酰化酶的亚基重组

青霉素G酰化酶在半合成β-内酰胺类抗生素工业中催化关键反应。将来源于Esherichia coli的α亚基分别与Kluyvera citrophila,Providencia rettgeri,Alcaligenes faecalis的β亚基重组得到三种杂合酶,杂合酶表达量随野生型PGA同源性的减小而降低,E.coli和A.faecalis氨基酸序列的相同性低至41%,其杂合酶仍然具有水解3-苯乙酰胺-6-硝基苯甲酸的活力。     

青霉素酰化酶电极

用海藻酸钠-氯化钙包埋法制备青霉素酰化酶电极,电极涂液中海藻酸钠浓度为1％,酶量大于15U/100mg较好。经聚乙烯亚胺处理的电极的抗磷酸盐性能良好,测试在pH 7.05缓冲液中进行,加样搅拌平衡后,取停止搅拌5min后的pH读数,△pH-青霉素G浓度的线性范围为0～1.88mg/ml。温度和pH对pH响应值均有影响。     

一种新的固定化酶方法——微粒明胶吸附交联青霉酰化酶

微粒明胶有较强的吸附作用,且分子中含大量氨基,因此,可用戊二醛一类交联剂将酶和明胶载体进行交联,经交联后,不仅酶和明胶牢固地结合,且明胶本身失去了水溶性,从而得到理想的固定化.采用0.18～0.32mm细度的明胶,按明胶:酶液1:0.5(w/v)吸附后,以适量的25%戊二醛交联30分钟后即可得到分散性良好的微粒明胶固定化酶.活力回收率为20～30%.采用此种固定化酶,裂解10%青霉素,6-APA收率可达84%以上.固定化酶在缓冲液中低温存放一年后,活力仍保留90%以上,在柱和搅拌罐两种反应器中,酶的半寿期分别为730小时和248小时.     

胞外青霉素酰化酶产生菌的筛选及产酶条件

采用青霉素梯度琼脂平皿法，从土壤中快速筛选出３５株产胞外青霉素酰化酶的菌株，经复筛有５株酶活力较高，经鉴定均为芽胞杆菌，Ｂ３５－１７菌株酶活力最高．研究了Ｂ３５－１７菌株的胞外青霉素酰化酶产生条件，该菌株在最适产酶条件下，酶活力达２．６７ｕ／ｍＬ．在发酵培养基中添加０．２％的玉米浆能降低Ｆｅ２＋对酶合成的抑制作用．     

青霉素酰化酶提取及其与固定化酶的动力学参数测定和比较

采用冻融-溶媒法从大肠杆菌中提取青霉素酰化酶(经硫酸铵沉淀、透析、冷冻干燥),制得酶粉,活力为1100.37u/g,经六批提取试验,平均提取收率47.93％。分别测定游离酶及其固定化酶米氏常数Km值。游离酶的Km值为2.39mM,固定化酶按其颗粒大小不同,Km值分别为5.62、8.46、8.42mM。 在对pH稳定性测定中,游离酶最适pH为7～8,而固定化后在pH5～9之间都较稳定。对温度的稳定性测定中,游离酶与固定化酶在40℃以下都较稳定,但在45℃保温一小时后,游离酶只存留活力39.51％,而固定化酶却存留活力86.92％,二者有显著差异、温度再高相差更大。因此酶经固定化后,对pH和温度的稳定性都有明显提高。金属离子对青霉素酰化酶的活力有所影响。特别是铁离子和铜离子影响较大,故酶反应容器不能采用铁和铜的材料。     

青霉素G酰化酶工程菌培养条件的研究

以产生青霉素G酰化酶的工程菌株LRN075为研究对象,通过正交试验优化了培养条件,研究了不同比例的培养基成分对酶产量的影响.结果显示在最优条件下,进行了2000L发酵罐的发酵试验,该菌株在培养36h酶活最高达到2.28×104U·L-1.细胞破碎实验表明,高压均质法效果最佳,可以使酶达到最大程度的释放.