小鼠卵黄囊间质干细胞的分离纯化及多向分化潜能的研究

目的：分离、纯化小鼠卵黄素间质干细胞，并观察其定向分化成骨、成软骨及成脂的潜能。方法：分离、纯化孕8.5d的小鼠卵黄囊间质干细胞，传代4次后进行成骨、成软骨及成脂诱导。观察细胞形态，检测AKP，Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型胶原及BMP－1和BMP－2的表达，并进行组化染色，检测成骨、成软骨及成脂情况。结果：体外可获得纯化的卵黄囊间质干细胞，大小形态均一，呈梭形。成骨诱导后细胞向星形转化，AKP、Ⅰ型胶原、BMP－2及Von Kossa′s染色阳性，Ⅲ型胶原阴性。成软骨诱导后，细胞向多角形和圆形转化，AKP、Ⅱ型胶原、BMP－1及Alcian blue染色阳性，Ⅰ型胶原阴性。成脂诱导后细胞肥大，油红O染色阳性。结论：体外纯化的卵黄囊间质干细胞可诱导成骨、成软骨及成脂，具有多向分化潜能。     

卵黄囊干细胞向粒-单系造血祖细胞的定向诱导分化

目的：观察卵黄囊干细胞向粒-单系造血祖细胞（CFU-GM）的定向诱导分化,稳定和优化检测卵黄囊CFU-GM的方法。方法：应用体外琼脂培养法,观察多种因素对小鼠卵黄囊干细胞形成粒-单系造血祖细胞集落形成单位的影响;应用染色压片法对所生成的集落性质作鉴定。结果：植入不同数量的E7.5~8.5 d的卵黄囊干细胞与CFU-GM生成数量之间呈高度正相关;在接种相同数量的卵黄囊细胞数的情况下,DMEM培养体系生成的CFU-GM数明显多于IMDM培养体系生成的集落数（P<0.01）;马血清（HS）组优于胎牛血清（FBS）组（P<0.01）;与GM-CSF相比,WEHI-3条件培养液（W3-CM）能明显促进卵黄囊CFU-GM的生成（P<0.01）。采用完整琼脂凝块压片法对卵黄囊细胞所形成的集落进行鉴定表明为粒-单系细胞集落。结论：卵黄囊干细胞具有向CFU-GM分化的能力;卵黄囊干细胞CFU-GM诱导体系中各组分变化均可影响CFU-GM的集落生成率;以DMEM,GM-CSF或W3-CM,HS为组分的体系可稳定地检测卵黄囊细胞CFU-GM的集落生成率。     

大鼠骨髓间质干细胞体外分化为成骨细胞的实验研究

目的：建立大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)体外诱导分化为成骨细胞的模型。方法：分离大鼠骨髓间质干细胞进行体外培养，观察其生物学特性。并选用一定的诱导剂诱导成骨细胞，通过形态学变化、碱性磷酸酶染色及钙沉积对成骨细胞进行鉴定。结果：大鼠MSCs细胞形态呈长梭形，成骨细胞诱导后MSC细胞形态由长梭形向多边形转变，ALP染色阳性，Von Kossa染色阳性，呈现典型的成骨细胞形态和生物学特征。结论：大鼠骨髓MSCs体外能被诱导分化为成骨细胞，为骨组织工程研究的优良种子细胞。     

人卵黄囊间质干细胞多向分化潜能的实验研究

[目的]分离纯化及体外观察人卵黄囊间质干细胞(hYS-MSC)的多向分化潜能.[方法]卵黄囊单细胞悬液经贴壁培养、传代纯化得到hYS-MSC,并从细胞表型及生物学特性等方面对其进行鉴定;采用地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C作成骨诱导剂、β-巯基乙醇或复方丹参注射液作为神经诱导剂、地塞米松、消炎痛、胰岛素作为成脂诱导剂诱导hYS-MSC向成骨细胞、神经细胞及脂肪细胞定向分化.组织化学方法作成骨检测;免疫组化方法检测NSE、NF及GFAP在经神经诱导hYS-MSC中的表达;油红O染色检测中性脂肪.[结果]hYS-MSC易于纯化,在培养过程中保持正常核型,具有较大增殖能力.hYS-MSC CD29、CD44、CD166及CD105表达阳性,CD34、CD45和CD86为阴性;AKP弱阳性.hYS-MSC经成骨诱导AKP强阳性,诱导两周后形成钙盐沉积形成的矿化区.hYS-MSC经神经诱导可见NSE、NF或GFAP阳性细胞,符合神经元及胶质细胞的生物学特征.hYS-MSC经成脂诱导转化为大小不等的园形或椭圆形细胞,胞浆内可见脂滴形成,胞核被挤于细胞的一侧,经油O染色脂滴染橘红色,符合脂肪细胞的生物学特征.[结论]hYS-MSC与成体MSC表型一致,具有较大增殖及多向分化潜能,在体外可以诱导分化为成骨细胞、神经元、胶质细胞及脂肪细胞.     

胚胎干细胞向成骨细胞定向分化的研究进展

目的对胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)体外诱导定向分化为成骨细胞的研究现状及所存在的问题作一综述。方法广泛查阅近年来关于ESCs体外诱导分化为成骨细胞的文献,并进行总结和分析。结果 ESCs可以作为理想的骨组织工程种子细胞来源。结论体外诱导ESCs定向分化得到成骨细胞,在骨组织工程中具有巨大的潜力,不但提供了分析成骨细胞发生的分子机制模型,也奠定了其在骨组织修复中的基础。     

成人骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向诱导分化的实验研究

目的 研究体外培养的成人骨髓间充质干细胞(MSC)在特定的条件下定向诱导分化为成骨细胞,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性和应用价值。方法 抽取健康成年志愿者骨髓,在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中采用全骨髓培养法,培养传代后改用含地塞米松(1×10^-8 mol/L)、β-甘油磷酸钠(10 mmol/L)和维生素C(50 mg/L)的条件培养基培养,在相差显微镜和电镜下观察细胞形态,免疫组化检测Ⅰ型胶原,Gomori钙钴法进行碱性磷酸酶(AP)染色、von Kossa法进行钙结节染色,同时测定细胞内AP(碱性磷酸酶)含量变化,并进行统计学分析。结果 原代和传代培养的细胞具有活跃的增殖能力,诱导培养2~3周后,透射电镜下观察见大量扩张的粗面内质网、高尔基体和线粒体,细胞核较为幼稚。Ⅰ型胶原染色、AP及钙结节染色等均为强阳性;AP活性明显增强(P<0.05)。结论 MSC取材安全方便,易于诱导分化为成骨细胞,有望成为理想的骨组织工程种子细胞来源,本实验方法可作为骨组织工程种子细胞培养的常规方法之一。     

骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向诱导分化的相关研究

骨髓由非贴壁的造血细胞和贴壁的基质细胞部分组成。这些贴壁的基质细胞部分包括多能间充质干细胞和分化的骨髓间充质基质细胞。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)系统依靠增殖来自我更新,但是能够保持其干细胞的表型而引起成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、成纤维细胞的分化[1]。如何定向诱导其成骨分化可为研究骨组织工程、骨折修复和骨质疏松等难题提供理论基础,具有重要的意义。本综述讨论了骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向诱导分化的相关研究。     

脉冲电磁场诱导小鼠胚胎干细胞向成骨细胞分化

目的 观察脉冲电磁场对小鼠胚胎干细胞向成骨细胞分化的影响.方法 将小鼠4 d龄胚胎干细胞(embry-onic stem cells,ESCs)衍生的胚胎体单细胞按5×104ml-1接种到细胞培养板,在DMEM基础培养液中使胚胎体单细胞贴壁培养.于第14～21天时,分别给予脉冲电磁场、化学诱导剂以及联合刺激.采用茜素红染色、骨钙素免疫组织化学染色、成骨分化关键因子Osterix和Cbfa-1/Runx-2的相对定量RT-PCR检测等方法观测成骨分化情况.结果 茜素红染色和RT-PCR结果均显示:脉冲电磁场组、化学诱导组以及联合培养组的成骨诱导效果均比空白对照组显著增加,其中又以联合培养组成骨诱导效果最明显.骨钙素免疫组化染色也显示:联合培养组中骨钙素分泌最多.结论 脉冲电磁场可以促进小鼠胚胎干细胞向成骨细胞分化,而且脉冲电磁场和常规化学诱导剂联合应用会产生协同效应,其成骨诱导效果优于两者单独应用.     

人骨髓间质干细胞向成骨细胞诱导分化条件的建立

目的:探讨体外诱导培养人骨髓间质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化的方法和技术,为骨组织工程研究提供理想的种子细胞.方法:抽取无系统疾病自愿捐献骨髓患者的骨髓,体外分离诱导培养BMSCs,按照诱导条件加入时间的先后次序分为早期诱导组(A组)和延迟诱导组(B组),镜下观察2组细胞形态学变化,计算倍增时间,并测定2组骨钙素的含量和Ⅰ型胶原的表达,研究该细胞生物学特性及其体外成骨能力.结果:(1)镜下观察:A组细胞贴壁,呈菱形,5～7 d融合,成纤维细胞集落样生长;B组细胞贴壁,呈梭形,3～5 d融合,呈指纹状生长方式.(2)倍增时间:A组第1、2、3、4代倍增时间分别为18.86、17.45、18.71、20.99 h;B组第1、2、3代倍增时间分别为17.54、19.59、25.46 h,第4代停止生长,2组各代倍增时间差异均有统计学意义(P＜0.05).(3)骨钙素:A组各代均可检测到骨钙素,Ⅰ型胶原自原代就有阳性表达,第3、4代细胞达到最强;B组原代、第1代细胞中未检测到骨钙素,诱导后才分泌骨钙素,Ⅰ型胶原各代均有阳性表达,但不均匀,第4代细胞停止增殖,无阳性表达.结论:应用成骨细胞条件培养液在体外能够促进人BMSCs向成骨细胞分化,验证了BMSCs是一种比较理想的骨组织工程种子细胞.早期诱导是较为完善的体外诱导培养条件和方法.     

人间充质干细胞体外成骨诱导培养及其生物学特性变化

目的　确定人间充质干细胞 (MSCS)体外扩增培养、向成骨细胞表型转化的方法 ,了解其生物学特性变化。方法　分离人骨髓细胞 ,按不同种植密度、首次换液时间进行原代培养 ,对传代培养细胞用化学药物或生长因子进行成骨诱导培养 ,并检测成骨细胞表型、生长曲线、贴壁率。结果　人MSCS 原代培养种植细胞密度为 1× 10 5～ 3× 10 5/cm2 ,48h后半量换液 ,以后每 3d全量换液的方法较合理。经化学药物 (如地塞米松、β 甘油磷酸、维生素C)或生长因子 (rh BMP2 、BMPS)作用后 ,MSCS 表达碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和骨钙素 ,细胞增殖速度减慢 ,贴壁率略降低。未诱导MSCS 形成细胞团后 ,可自动分化表达碱性磷酸酶活性。结论　合理的人MSCS 培养方法及可靠的诱导条件 ,可为体外构建组织工程化骨提供自体种子细胞。     

5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的:研究体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(mensenchymal stem cells,MSCs) 经5-氮胞苷(5-aza) 诱导定向分化为心肌样细胞形态学及分子生物学特征?方法:SD大鼠股骨骨髓经密度梯度离心及贴壁分离培养传代MSCs,体外用5-aza定向诱导向心肌样细胞分化?相差显微镜观察心肌样细胞形态学变化?免疫组化检测肌钙蛋白T(cTnT)?α-肌动蛋白和缝隙连接蛋白Cx43表达?结果:密度梯度离心及贴壁法分离培养的MSCs生长稳定,增殖快?5-aza诱导后,部分细胞形态发生变化,有肌管样结构形成?随诱导后培养时间延长MSCs中cTnT?α-肌动蛋白和缝隙连接蛋白Cx43表达逐渐增强?结论:密度梯度离心及贴壁分离培养可获得大量纯度较高的骨髓间充质干细胞?经5-aza诱导骨髓间充质干细胞体外可分化为心肌样细胞?     

富血小板血浆对骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化的影响

目的 观察富血小板血浆（platelet-rich plasma,PRP）对兔源骨髓间充质于细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）定向分化为成骨细胞的作用及机制. 方法 离心法分离兔骨髓后,体外培养BMSCs,体积分数5％和10％的PRP与BMSCs共培养,观察BMSCs诱导分化过程中茜素红染色阳性率,应用酶标仪检测碱性磷酸酶（alkaliphosphatase,ALP）活性,应用ELISA法检测BMSCs诱导分化过程中骨钙素（osteocalcin,OCN）及结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）的含量,应用real time-PCR检测成骨相关基因CTGF、ALP、成骨细胞核心结合因子α1（core-binding factor alpha 1,Cbf-α1）、兔Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）和OCN的表达. 结果 BMSCs诱导分化后细胞茜素红染色阳性率、ALP活性、OCN及CTGF含量升高,CT-GF、ALP、Cbf-α1、Col-Ⅰ和OCN的mRNA表达增加. 结论 PRP可促进BMSCs向成骨细胞分化,可能与PRP促进BMSCs中CTGF、ALP、Cbf-α1、Col-Ⅰ和OCN表达有关.     

microRNA调控间充质干细胞成骨分化的研究进展

间充质干细胞是一类体内广泛存在的多能干细胞,具有多向分化潜能,为多种组织器官提供保护及损伤修复。近年来,间充质干细胞向成骨细胞诱导分化用于治疗骨代谢等相关性疾病已成为热点。microRNA（miRNA）作为生物体内重要的小分子非编码RNA,通过转录后调控影响基因表达,参与各种生命过程。研究显示,多种不同的miRNA在间充质干细胞向成骨分化过程中起着核心调节作用。本文结合相关文献,对miRNA调控间充质干细胞成骨分化的作用及机制归纳总结,以帮助全面了解靶向miRNA治疗骨代谢性相关疾病的潜能。     

褪黑激素体外定向诱导骨髓间充质干细胞的研究

目的:探讨褪黑激素(melatonin,MT)体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)不同时段向神经细胞分化的情况。方法:采用细胞培养技术分离培养和纯化大鼠MSCs,以MT为诱导剂诱导大鼠MSCs向神经细胞分化。分别在诱导后3,7,10,14 d以免疫荧光法测定神经干细胞特异性标志(nestin)、神经元细胞特异性标志(neurofilament,NF)和星形胶质细胞特异性标志(GFAP)的表达。结果:MT诱导分化3 d,部分细胞胞体收缩成三角形,有些成为简单的双极或多极细胞。诱导3 d细胞开始表达nestin,7~14 d表达nestin和NF,细胞不表达GFAP。结论:MT可诱导大鼠MSCs分化为神经细胞。     

小寡核苷酸对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的：筛选具有促进大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化作用的小寡核苷酸（ODN）,探讨ODN对BMSCs向成骨细胞分化的影响。方法：取第3代BMSCs孵育24 h后进行成骨诱导,双盲法加入12条不同的ODN,PBS作为溶媒对照组,应用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测ODN于不同工作浓度（4.0、 2.0、 1.0和 0.5 mg/L）、不同时间点（24、72和120 h）刺激经成骨诱导后的BMSCs内ALP的表达水平,筛选出具有促成骨分化作用的ODN。结果：与PBS溶媒对照组比较,ODN工作浓度为4.0和0.5 mg/L时,实验组与对照组ALP表达水平差异无显著性(P>0.05),ODN工作浓度为2.0和1.0 mg/L时,有2条ODN在不同时间点（24、72和120 h）均可促进BMSCs内ALP的表达（P<0.01）。结论：在12条不同的ODN中共筛选出2条具有促进BMSCs成骨分化作用的ODN,表明特定序列的ODN能够影响大鼠BMSCs向成骨细胞的分化。     

Electromagnetic Field Change the Expression of Osteogenesis Genes in Murine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

In order to identify the differentially expressing gene of bone marrow mesenchymal stem cells （MSCs） stimulated by electromagnetic field （EMF） with osteogenesis microarray analysis, the bone marrow MSCs of SD rats were isolated and cultured in vitro. The third-passage cells were stimulated by EMFs and total RNA was extracted, purified and then used for the synthesis of cDNA and cRNA. The cRNA of stimulated group and the control group was hybridized with the rat oligo osteogenesis microarray respectively. The hybridization signals were acquired by using X-ray film after chemiluminescent detection and the data obtained were analyzed by employing the web-based completely integrated GEArray Expression Analysis Suite. RT-PCR was used to identify the target genes： Bmp1, Bmp7, Egf and Egfr. The results showed that 19 differentially expressing genes were found between the stimulated group and the control group. There were 6 up-regulated genes and 13 down-regulated genes in the stimulated group. Semi-quantitative RT-PCR confirmed that the expressions of Bmpl, Bmp7 mRNA of the stimulated group were up-regulated （P〈0.05） and those of Egf, Egfr were down-regulated （P〈0.05）. It was suggested that the gene expression profiles of osteogenesis of the bone marrow MSCs were changed after EMF treatment. It is concluded that the genes are involved in skeletal development, bone mineral metabolism, cell growth and differentiation, cell adhesion etc.     

人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞诱导分化的实验研究

目的：探讨人骨髓间充质干细胞（hMSCs）向血管内皮细胞（ECs）诱导分化的可行性。方法：用贴壁法从成人骨髓中分离出间充质干细胞,培养扩增后,加入10ng／ml的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和人血管内皮生长因子（hVEGF）向ECs诱导分化,分别于0、24d流式细胞术检测细胞表型及荧光染色鉴定细胞。结果：hMSCs向ECs诱导分化24d,细胞CD34、KDR转为阳性,CD54、CD106、vWF表达增加。可摄取ac—LDL,并可结合UEA。结论：hMSCs经bFGF和VEGF作用,分化为具有ECs的表型和部分功能的细胞。