日本血吸虫微管蛋白基因的分离和cDNA序列分析

目的 分离和鉴定日本血吸虫(Schistosoma japonicum，Sj)新基因，为防治日本血吸虫病提供药物靶标或候选疫苗。方法构建日本血吸虫成虫cDNA文库，随机挑取重组阳性克隆进行测序，对部分序列进行引物步移法测序，获取其全长cDNA序列；采用生物信息学等技术对该cDNA序列进行开放阅读框(ORF)的寻找、编码氨基酸的推导、核苷酸和氨基酸同源性比较以及蛋白质二级结构的初步预测。结果获得了1个日本血吸虫新基因—微管蛋白基因，全长1439bp，编码443个氨基酸，与肝片形吸虫微管蛋白基因具有79％的同源性。编码蛋白的理论分子量为7．2198KDa，等电点为9．12；抗原表位可能位于cDNA序列373～396处。结论 获得了日本血吸虫微管蛋白基因的全长cDNA序列，为该基因功能的实验性鉴定工作奠定基础。     

日本血吸虫乳酸脱氢酶基因的获得和序列分析

目的 从日本血吸虫(Schistosoma japonlcum，Sj)成虫cDNA文库中筛选日本血吸虫新基因，为日本血吸虫病的诊断或防治提供靶抗原。方法 筛选日本血吸虫成虫cDNA文库，随机挑取重组阳性克隆进行DNA测序，再对新基因序列进行步移法测序获取全长cDNA，并利用生物信息学技术对其进行分析。结果 获得了1个新基因，其cDNA全长1251bp(AY225190)，编码331个氨基酸，编码蛋白与人类或螈、蟾蜍、鸡、鼠及猪等其它生物的乳酸脱氢酶高度同源。结论 利用表达序列标签法、步移法测序和生物信息学技术三者相结合，成功获得了编码日本血吸虫乳酸脱氢酶基因的cDNA全长序列。     

三氧化二砷反式激活基因1的克隆化

目的 克隆三氧化二砷反式激活靶基因1（AsTP1）。方法 从构建的三氧化二砷差异表达的肝HepG2细胞、T淋巴细胞cDNA消减文库筛选，利用RT-PCR和生物信息学分析相结合的方法获得新基因AsTP1的编码序列，对其氨基酸序列进行分析比较，并对其进行克隆化研究。结果 AsTP1基因编码区为243个核苷酸（nt），编码产物为80个氨基酸残基（aa）。经核苷酸序列数据库（GenBank）和蛋白质一级结构序列数据库（SwissProt）同源序列的搜寻，与已知基因序列之间没有显著同源性，说明克隆的AsTP1基因属于未知功能新基因。结论 发现三氧化二砷反式激活靶基因AsTP1，为进一步研究三氧化二砷的反式激活作用和揭示慢性砷中毒的分子机制提供新线索。     

中华按蚊CYP6P5基因的生物信息学鉴定及特征分析

目的鉴定中华按蚊CYP6P5基因并分析其序列特征,为研究中华按蚊CYP6P5基因杀虫剂抗性机制提供理论依据。方法以催命按蚊基因CYP6P5为询问基因,基于中华按蚊转录组测序数据,采用双向Blast方法搜寻中华按蚊CYP6P5cDNA序列。利用生物信息学相关软件对该基因编码蛋白序列的一级结构、疏水区、跨膜区、结构域、3D结构等进行预测分析,并采用最大似然法（maximumlikelihood,ML）建立代表性蚊种的系统发育关系。结果搜索获得1条中华按蚊CYP6P5全长cDNA序列。该cDNA序列具备P450超家族和CYP6家族特征性的保守序列,命名为CYP6P5（GenBank登录号：KF358704）。该cDNA全长为1583bp,开放阅读框为1527bp,编码508个氨基酸,推测其相对分子质量为58．32×10-3,等电点为7．17。分析表明该基因编码的蛋白序列第5～21位氨基酸是疏水区,第5～22位氨基酸是跨膜区,第36～505位氨基酸是P450保守结构域,并具有多个酶活性位点。系统发育关系和相似性分析表明,中华按蚊CYP6P5与催命按蚊CYP6P5和冈比亚按蚊CYP6P5亲缘关系最近,形成一个单系,相似率分别为89．4％和89．0％。结论为进一步研究中华按蚊CYP6P5基因溴氰菊酯抗性的分子机制奠定了基础。     

牛带绦虫成虫钙调神经磷酸酶B基因生物信息学分析

目的从牛带绦虫(Teania saginata)成虫cDNA文库中克隆牛带绦虫钙调神经磷酸酶B(calcineurin B钙调神经磷酸酶B)基因,分析和预测其编码蛋白的结构和特性。方法构建牛带绦虫成虫cDNA质粒文库,从文库中识别钙调神经磷酸酶B基因并进行生物信息学分析。结果该基因全长510 bp,编码区为141～650,编码170个氨基酸,为全长基因。理论分子量、等电点分别为19119.3 Da和4.52;无跨膜区;三维结构建模图显示其线性表位的部位。结论应用生物信息方法从牛带绦虫成虫cDNA文库中筛选出钙调神经磷酸酶B基因的cDNA全长序列,并预测得到其结构与功能方面的信息。     

猪带绦虫腺苷酸激酶基因及蛋白结构特性分析

目的 分析和预测猪带绦虫腺苷酸激酶(ADK)基因及其编码的蛋白结构和特性.方法 利用各种在线生物信息网站及其它分析软件包,分析从猪带绦虫成虫cDNA质粒文库中识别的腺苷酸激酶基因的结构和编码区序列,分析、预测编码的蛋白质的理化特性、抗原表位、翻译后的修饰、功能域、亚细胞定位、拓扑结构、二级结构、三维空间构象等.结果 该基因全长864 bp,编码区为110～758,编码215个氨基酸,为全长基因.理论分子量、等电点分别为23771.4 Da和6.86;没有跨膜区;三维结构建模图显示其线性表位的部位.结论 应用生物信息方法 从猪带绦虫成虫cDNA文库中筛选出了腺苷酸激酶基因的cDNA全长序列并预测得到其结构与功能方面的信息.     

猬迭宫绦虫幼虫含重复序列的cDNA的分子克隆

目的 从分子水平研究猬迭宫绦虫幼虫－裂虫蚴的某些蛋白抗原的基因结构。方法 用鼠抗裂头蚴多克隆抗体筛选裂头蚴cDNA库，筛选出的阳性克隆，经亚克隆，测序后，分析其一级结构特点。以克隆出的cDNA作探针进行Northern杂交实验，检测mRNA的长度。结果 从cDNA库中筛选出两个克隆（长度分别是366bp和458bp）。两个克隆的5'端都没有起始密码，3'端都没有Poly(A)，但是其中一个克隆的poly（A）信号。两个克隆都有一个由123个核苷酸组成的重复单位，其中只有一个核苷酸不同。重复单位编码的41个氨基酸内有一个糖基位点，中性氨基酸占41．46％。Northern杂交结果显示，裂头蚴从1．5kb到4kb处有多个很强的杂交带，而成虫没有杂交带。结论 裂头蚴体内含有丰富的由重复单位的组成的分子量大小不同的抗原。     

埃及伊蚊电压依赖性钠离子通道3''端cDNA的克隆及序列分析

目的 扩增埃及伊蚊电压依赖性钠离子通道基因3'末端,并对其核苷酸序列进行分析.方法 提取埃及伊蚊雌蚊总RNA,以Trsa为反转录引物反转录成单链cDNA,继而设计阳性与阴性对照,采用巢式聚合酶链反应(PCR)和快速扩增cDNA 3'末端(3'RACE)技术,对埃及伊蚊电压依赖性钠离子通道基因3'末端进行PCR扩增、克隆与测序.结果 获得钠离子通道基因的3'端核苷酸序列共809 bp,包括编码区和非编码区poly(A)尾,编码区共编码208个氨基酸.相似性分析结果 显示编码区氨基酸序列与家蝇钠离子通道基因3'端氨基酸序列相似性为65%左右.结论 成功获得埃及伊蚊钠离子通道基因3'端,为进一步研究该基因的分子生物学特性奠定了基础.     

埃及伊蚊电压依赖性钠离子通道3′端cDNA的克隆及序列分析

目的扩增埃及伊蚊电压依赖性钠离子通道基因3′末端，并对其核苷酸序列进行分析。方法提取埃及伊蚊雌蚊总RNA，以Trsa为反转录引物反转录成单链cDNA，继而设计阳性与阴性对照，采用巢式聚合酶链反应（PCR）和快速扩增cDNA3′末端（3′RAcE）技术，对埃及伊蚊电压依赖性钠离子通道基因3′末端进行PCR扩增、克隆与测序。结果获得钠离子通道基因的3′端核苷酸序列共809bp，包括编码区和非编码区poly（A）尾，编码区共编码208个氨基酸。相似性分析结果显示编码区氨基酸序列与家蝇钠离子通道基因3′端氨基酸序列相似性为65％左右。结论成功获得埃及伊蚊钠离子通道基因3′端，为进一步研究该基因的分子生物学特性奠定了基础。     

日本血吸虫新基因精氨酸酶的扩增及序列分析

目的获取并真核克隆日本血吸虫新基因精氨酸酶全长cDNA.方法对本实验室曾获得精氨酸酶基因利用生物信息学进行分析,发现其5'端尚缺一段序列;根据已知序列设计引物,用5'端单巢式PCR从尾蚴文库中扩增,以获得精氨酸酶基因完整的阅读框(ORF);用生物信息学技术对获得的精氨酸酶编码基因进行结构与功能的分析;并将新基因的完整编码阅读框克隆入真核表达载体pCDNA3.1.结果用5'端单巢式PCR从尾蚴文库中获得了精氨酸酶5'端所缺序列,得到其完整的ORF,其ORF长1 095 bp,编码364个氨基酸.利用生物信息学技术鉴定其为日本血吸虫精氨酸酶的完整cDNA序列.重组质粒经双酶切DCR及测序鉴定证明日本血吸虫精氨酸酶真核表达质粒构建成功.结论成功获得、识别、扩增并克隆日本血吸虫精氨酸酶编码基因的全长cDNA.     

Identification of a protective antigen of Coccidioides immitis by expression library immunization

Coccidioides immitis is a fungal pathogen of humans and is classified as a Select Agent. We have identified a new potential vaccine candidate for this pathogen using cDNA expression library immunization (ELI). A C. immitis spherule-phase cDNA library containing 800-1000 genes was divided into 10 pools and each was tested for its protective capacity in BALB/c mice against intraperitoneal challenge with 2500 arthroconidia of this dimorphic fungus. The most protective pool, designated Pool 7, was fractionated into five sublibraries, each containing 60 genes, and of these, only Pool 7-3 induced a significant level of protection in mice. Fractionation of Pool 7-3 into six sublibraries, each with 10 genes, yielded a protective fraction, designated Pool 7-3-5. Subsequent fraction of the latter pool into 10 sublibraries, each with one clone, yielded a clone designated 7-3-5-5 that was highly protective. Clone 7-3-5-5 was sequenced and found to contain a 672bp ORF encoding a 224 amino acid protein having a 19 amino acid signal sequence on the N-terminus and a 15 amino acid C-terminal GPI anchor site. The 7-3-5-5 clone, designated ELI-Antigen 1 (ELI-Ag1), showed partial homology with a hypothetical protein from Neurospora crassa. This is the first study to identify a protective antigen from a fungus using ELI, and it is also the first report in which sequential fractionation of an expression library successfully identified a single protective gene.     

马尔尼菲青霉菌溶血磷脂酶基因的识别和序列分析及功能预测

目的 从马尔尼菲青霉菌(PM)酵母相全长cDNA文库中识别溶血磷脂酶基因,预测其结构和功能,为进一步实验研究提供理论依据.方法 利用NCBI在线分析工具对PM酵母相全长cDNA文库进行筛选,识别溶血磷脂酶基因;通过Vector NTI suite 8.0软件包,对其编码蛋白质的各种结构与功能特征进行预测,并构建种系分子进化树.结果 筛选得到的基因长1014 bp,Blastx分析该基因可能是编码PM溶血磷脂酶的全长基因,完整的开放读码框(ORF)共含729 bp,编码243个氨基酸;其编码蛋白的相对分子质量为26 800,预测等电点为5.49,疏水氨基酸占47.7%,亲水氨基酸占26.8%,酸性氨基酸占12.7%,碱性氨基酸占12.8%;该蛋白有潜在的2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、3个蛋白激酶C磷酸化位点和7个N-肉豆蔻酰位点.结论 该氨基酸序列属于溶血磷脂酶样功能域特征蛋白酶;与球孢子菌亲源关系最近.通过研究,一个PM溶血磷脂酶基因被成功发现,这为进一步探讨该基因的功能提供了条件.

Abstract：

Objective To identify the gene encoding lysophospholipase from the full length cDNA library of Penicllium marneffei (PM) in yeast phase and predict the structure and function of its deduced protein, to provide with theoretical evidences for further experiments. Methods The PM full-length cDNA library in yeast phase was screened to identify the gene encoding lysophospholipase with the help of NCBI on-line analytical tool. Then, by utilizing the software package of Vector NTI suite 8.0, the protein deduced by the gene was analyzed to predict its corresponding structure and functions, and its molecular cladogram was constructed. Results The gene was composed of 1014 base pairs in the length and was presumed to be the full-length gene encoding lysophospholipase by Blastx, with a complete open reading frame (ORF) comprised of 729 base pairs encoding 243 amino acids with relative molecular weight being 26 800 and the predicted isoelectric point being S.49. The deduced protein included 47.7% hydrophobic amino acids, 26.8% hydrophilic amino acids, 12.7% acid amino acids and 12.8% basic amino acids. The protein had 2 potential casein kinase Ⅱ phosphorylation site, 3 potential protein kinase C phosphorylation site and 7 N-myristoyl site. Conclusions The amino acid sequence belongs to this kind of protease with lysophospholipase-like domain. The protein is most close to Coccidioides posadasii in genetic relationship. A novel gene encoding lysophospholipase is successfully found and the work has made necessary preparations for further research on the gene's function.     

抗汉滩病毒McAb可变区基因克隆及序列分析

目的克隆和分析抗汉滩病毒单克隆抗体(McAb)H7可变区基因.方法根据鼠源抗体可变区(V)氨基酸序列,设计合成一组抗体重、轻链可变区(VH/VK)简并引物.采用一步法提取McAb H7细胞总RNA,通过RT-PCR扩增V基因,并进行核苷酸序列测定和分析.结果通过RT-PCR成功克隆了H7可变区重轻链基因,序列分析表明均为开放阅读框,符合小鼠抗体框架结构,含有明确的4个骨架区和3个抗原决定簇互补区,与抗体二硫键形成有关的两个特征性半胱氨酸亦高度保守.同源对比表明,H7-VK长357 bp,编码119个氨基酸,属JK4重排;H7-VH长360 bp,编码120个氨基酸,属JH4重排.经GenBank查询证实为新基因,登记号为AY245601和AY245602.结论 McAb H7可变区基因的获得,为有目的地开展HFRSV基因工程抗体的遗传改造及体外亲和力成熟等研究奠定了基础.     

cDNA cloning, characterization and vaccine effect analysis of Haemaphysalis longicornis tick saliva proteins.

Immunological control of ticks is currently the only sustainable and practical alternative method to the current use of acaricides which has serious limitations. The success of this method is dependent upon identification and cloning of potential tick vaccine antigens. We used a combination of immuno-screening of an adult tick cDNA library as well as the 3 and 5 rapid amplification of cDNA ends to clone two cDNAs, encoding tick saliva proteins from Haemaphysalis longicornis. The two cDNAs herein named HL 34 and 35 are 1000 bp each and encode polypeptides with 292 and 321 amino acid residues respectively. Northern blotting analysis of total RNA from ticks at different feeding stages revealed that expression of both HL 34 and HL35 mRNAs is induced during the slow feeding phase. We speculate that the functions of both genes are closely associated with blood feeding. Expression analysis by RT-PCR showed that both genes are expressed in other tick organs in addition to salivary glands. Recombinant HL 34 was successfully expressed in Escherichia coli and its suitability as a tick vaccine antigen was analyzed in rabbits. We propose that rHL34 could be a useful component of a cocktail tick vaccine.     

Expression and properties of human liver beta-ureidopropionase

A cDNA encoding beta-ureidopropionase (BUP) was isolated from a human liver cDNA library, expressed in E. coli, and purified from the culture extract. The 2,006 bp cDNA contained a 1,152 bp open reading frame encoding a protein of 384 amino acids with a molecular weight of 43,165 Da. The subunit molecular weight of the enzyme expressed was about 43,000 Da. The enzyme was inhibited by 1 mM propionate, but not by 10 mM beta-alanine. Chemical analysis of the purified human BUP showed 0.54 zinc atoms per subunit, and the sequence of BUP cDNA contained one putative zinc-binding site motif. The purified enzyme had a pI of 5.65, and exhibited positive cooperativity with N-carbamoyl-beta-alanine as the substrate with a Hill coefficient 2.0. These properties of human BUP, except the inhibition by beta-alanine, were similar to the rat liver purified enzyme. Beta-alanine inhibits rats BUP activity. The complex regulatory function and the negative cooperative mechanism of BUP by beta-alanine have been observed in rats. This kind of mechanism may not exist in humans, because beta-alanine did not inhibit human BUP.     

华支睾吸虫表膜相关抗原重组表达载体的构建

目的通过筛选cDNA文库识别华支睾吸虫新基因,并构建20.8?kDa华支睾吸虫表膜相关抗原(CSTA20.8)重组表达载体,为进一步研究其功能及其应用奠定基础.方法对华支睾吸虫cDNA文库进行筛选,通过NCBI和ExPasy网站的Blast程序进行序列比对,识别华支睾吸虫新基因,并应用Motifscan、NCBI Conserved Domain Search等程序对其进行结构域分析.将所发现的华支睾吸虫表膜相关抗原基因编码区定向克隆到原核及真核表达载体PGEX-4T-1和PcDNA3上,构建的PGEX-4T-1-CSTA20.8、PcDNA3-CSTA20.8重组表达质粒经PCR、双酶切及测序证实.结果发现华支睾吸虫表膜相关抗原基因,完整阅读框含555个碱基,编码184个氨基酸,理论分子量为20.8kDa,理论pI为4.33.序列分析表明,华支睾吸虫CSTA20.8编码氨基酸序列与其它物种有较高的同源性,CSTA20.8具有完整的钙结合蛋白保守功能域.所构建的重组原核和真核表达质粒经PCR、双酶切及测序证实与目标基因相符.结论发现华支睾吸虫表膜相关抗原基因,并成功构建原核和真核重组表达质粒.