卡氏肺孢子菌55kDa抗原的原核表达与纯化

目的体外扩增卡氏肺孢子菌(Pneumocystis carinii,Pc)55kDa抗原(p55)570bp的基因片段,构建原核表达载体pGEX-570,诱导表达并纯化重组蛋白。方法以卡氏肺孢子菌DNA为模板,扩增其基因片段,连接至pGEM-T载体,随后构建pGEX-570重组表达质粒,经双酶切、PCR及测序鉴定后将其转化入BL21大肠杆菌中,经IPTG诱导表达融合蛋白。采用透析袋电泳法纯化融合蛋白。结果重组表达质粒pGEX-570经酶切,PCR鉴定及测序结果表明构建成功。IPTG诱导表达融合蛋白GST-p55/570,分子量约为47kDa。用透析袋电泳法纯化重组蛋白,经SDS-PAGE确认正确。结论本研究成功构建了pGEX-570原核表达载体,诱导表达并纯化GST-p55/570融合蛋白。为进一步开展肺孢子菌55kDa抗原的研究奠定了基础。     

旋毛虫新生幼虫p46000抗原基因的表达与抗原性分析

目的　对旋毛虫新生幼虫p46000抗原基因进行原核表达并检测重组抗原的抗原性。　方法　利用聚合酶链反应 (PCR)扩增目的基因 ,克隆到原核表达载体 pET-28a ,构建重组表达质粒 ,经酶切及测序鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3 ),以异丙基-β-D 硫代半乳糖苷诱导表达。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)、酶联免疫吸附测定 (ELISA)和蛋白质印迹法 (Western blotting)分析表达产物。　结果　 SDS-PAGE结果显示表达产物的分子量约为Mr 48000 ,与理论值相符。ELISA和Western blotting结果表明 ,重组蛋白可被旋毛虫感染的猪血清和兔抗重组蛋白血清识别 ;兔抗重组蛋白血清可识别旋毛虫新生幼虫抗原Mr 46000蛋白。　结论　成功表达了旋毛虫新生幼虫p46000抗原基因 ,重组抗原具有良好的抗原性。     

霍乱弧菌肠毒素B亚单位基因在大肠杆菌和双歧杆菌的表达

目的构建霍乱弧菌肠毒素B亚单位(Cholera toxin B subunit,CTB)基因的大肠杆菌表达重组质粒,并观察其在大肠杆菌和双歧杆菌中的表达。方法从pBI121质粒PCR扩增获得CTB基因片断,克隆到大肠杆菌载体pGEX-4T-1上,构建重组质粒,然后转化大肠杆菌DH5α和双歧杆菌。转化菌经IPTG诱导,然后用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定表达的重组蛋白。结果构建了重组质粒pGEX-4T-CTB,CTB基因片段分子量约为376bp;在大肠杆菌中表达出35kD的霍乱弧菌B亚单位融合蛋白,经SDS-PAGE分析,相对分子量与文献相符,表达的蛋白约占细菌总蛋白的10%;在双岐杆菌中也能得到正确表达,表达量较大肠杆菌低,占细菌总蛋白约5%。Western blotting结果确认了该条带为CTB基因的产物。结论构建的重组质粒pGEX-4T-CTB能够在大肠杆菌及双歧杆菌中获得表达。     

肺孢子虫（菌）p55抗原嵌合基因的克隆及表达产物分析

目的构建肺孢子虫（菌）p55蛋白嵌合基因的原核表达载体,分析、鉴定及纯化表达产物。方法自NCBI网站的蛋白数据库中获取p55抗原及4个变异体信息,运用生物信息学方法预测可能的抗原表位,设计包含多个可能抗原表位的多肽,根据遗传中心法则及大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化,将氨基酸序列转化为核苷酸序列,将人工合成的嵌合基因（CAG）片段连接到质粒pGEX-6p-1（含GST标签）上,构建原核表达载体pGEX-6p-1/CAG,酶切、测序鉴定。pGEX-6p-1/CAG转化大肠杆菌,异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组融合蛋白CAG-GST。表达产物用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及Western-blotting分析鉴定。结果双酶切及测序结果显示重组质粒pGEX-6p-1/CAG构建成功。SDS-PAGE显示重组融合蛋白相对分子量约为69 000。Western-blotting结果显示,表达的融合蛋白为CAG-GST。结论成功构建表达p55蛋白嵌合基因的原核表达载体pGEX-6p-1/CAG,建立表达重组蛋白的原核表达系统。     

大鼠源肺孢子菌p55基因片段真核表达质粒的构建及表达

目的构建大鼠源肺孢子菌抗原p55基因片段真核表达质粒,并研究该质粒在真核细胞COS-7中的有效表达。方法以含有p55全长基因的质粒为模板,通过PCR扩增p55基因片段,克隆至pGEM-T载体中,经酶切后再将p55基因重组至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-582,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,应用脂质体转染技术转染入COS-7细胞,RT-PCR检测其基因转录情况,SDS-PAGE鉴定其表达相应的目的蛋白质情况。结果成功扩增了p55基因片段,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-582,RT-PCR和SDS-PAGE方法证实该片段能在COS-7细胞中有效表达目的蛋白质。结论成功构建了大鼠源肺孢子菌p55基因片段的真核表达质粒载体,并在COS-7细胞中表达,为进一步进行核酸疫苗的研究奠定了基础。     

弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA4基因的克隆与表达

目的 克隆和表达弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA4基因。方法 根据GRA4基因序列,设计合成一对引物,用聚合酶链式反应(PCR)方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA4基因片段,插入pMD18-T载体,并转化大肠杆菌JM109,经PCR、双酶切、测序验证后,将GRA4基因片段定向亚克隆到载体pGEX-4T-2中构建原核表达重组质粒pGEX-4T-2.GRA4,重组子在E.coli BL21中经IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE及Westem blot分析。结果 从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出GRA4基因片段并诱导表达出能被兔抗弓形虫血清识别的重组GRA4蛋白。结论 成功构建和表达了弓形虫pGEX-4T-2-GRA4重组质粒,为弓形虫病诊断抗原和疫苗的研究奠定了基础。     

间日疟原虫MSP1 C端基因亚克隆及在大肠埃希菌中的融合表达

目的 在大肠埃希菌中融合表达间日疟原虫MSP1 C端编码基因，以获得能作为检测抗原的重组蛋白GSTPvMSP1 C。方法 以限制性内切酶BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切质粒pMD／PvMSP1C，获得间日疟原虫MSP1 C端编码基因片段．柱纯化后，插入表达质粒载体的多克隆位点，构建重组体pGEX-4T-2／PvMSP1C，并转化大肠埃希菌BL21(DE3)，阳性克隆以限制性酶切分析鉴定后，以IPTG进行诱导表达，表达产物以SDS-PAGE电泳与免疫印迹分析。结果 双酶切质粒pMD／PvMSP1C，获得1 119bp的PvMSP1 C编码基因片段，与预期片段大小相符；所构建的pGEX-4T-2／PvMSP1C重组体阳性克隆经双酶切鉴定与预期结果一致；SDS-PAGE电泳显示，GST-PvMSP1C融合表达蛋白的大小约63 ku，且能够分别被GST抗体与间日疟患者的血清所识别。结论 成功亚克隆并构建了间日疟原虫MSP1 C端编码基因pGEX-4T-2／PvMsP1C表达质粒，诱导表达了GST-PvMSP1C融合蛋白，表达蛋白具有一定免疫活性。     

弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核表达质粒的构建

目的 构建弓形虫RH株致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒。方法 参照GRA8序列分别设计引物。采用PCR从弓形虫RH株基因组DNA中分别扩增出编码GRA8的基因片段，克隆至pMD18-T载体；菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析；各组阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达质粒pGEX-4T-2和真核表达载体pVAXl，分别转化大肠杆菌BL21和JM109,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列；将构建的原核表达菌株经IPTG诱导，SDS—PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达；将构建的真核重组表达质粒免疫小鼠，观察其诱导的抗体应答。结果 PCR扩增出GRA8基因的特异片段。各组阳性克隆的序列正确，并分别被亚克隆到原核表达质粒pGEX-4T-2和真核表达载体pVAXl上，构建了弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒；原核表达质粒在大肠杆菌中表达了GRA8的融合蛋白；真核重组表达质粒诱导小鼠产生了抗弓形虫抗原的抗体。结论以pGEX-4T-2和pVAX1为载体，分别成功构建了GRA8的原核和真核重组表达质粒     

金葡菌野生株SEB基因的亚克隆及其原核表达

目的亚克隆金葡菌野生株S407030肠毒素B(SEB)基因,并在大肠埃希菌(E.coli)中表达,以获得重组SEB(rSEB)蛋白。方法将含有SEB基因的质粒pMD-18T/SEB双酶切获得目的片段,插入表达载体pGEX-4T-2中构建重组子pGEX-4T-2/SEB,并转化E.coliJM109感受态菌,阳性克隆以双酶切和PCR法鉴定;含重组质粒的工程菌以IPTG诱导表达rSEB蛋白;表达产物进行SDS-PAGE分析,并采用B-PER GST融合蛋白试剂盒纯化重组rSEB,West-ern blot鉴定其免疫反应性。结果重组质粒经双酶切和PCR扩增鉴定均获得约705 bp的基因片段,与预期结果相一致;诱导表达的含GST的融合重组rSEB蛋白分子质量单位约为53 ku,纯化后作SDS-PAGE电泳显示一条蛋白带,Western blot显示rSEB能够被兔抗SEB抗体识别。结论金葡菌野生株SEB在大肠埃希氏菌中得到有效表达,并获得电泳级纯度的重组rSEB,重组蛋白具有一定的免疫活性,为进一步研究其生物毒性与开发诊断试剂提供了生物材料。     

间日疟原虫MSP1C端基因亚克隆及在肠埃希菌中的融合表达

目的　在大肠埃希菌中融合表达间日疟原虫MSP1C端编码基因 ,以获得能作为检测抗原的重组蛋白GST PvMSP1C。　方法　以限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ双酶切质粒pMD/PvMSP1C ,获得间日疟原虫MSP1C端编码基因片段 ,柱纯化后 ,插入表达质粒载体的多克隆位点 ,构建重组体 pGEX 4T 2 /PvMSP1C ,并转化大肠埃希菌BL2 1(DE3 ) ,阳性克隆以限制性酶切分析鉴定后 ,以IPTG进行诱导表达 ,表达产物以SDS PAGE电泳与免疫印迹分析。　结果　双酶切质粒pMD/PvMSP1C ,获得 1119bp的PvMSP1C编码基因片段 ,与预期片段大小相符 ;所构建的 pGEX 4T 2 /PvMSP1C重组体阳性克隆经双酶切鉴定与预期结果一致 ;SDS PAGE电泳显示 ,GST PvMSP1C融合表达蛋白的大小约 63ku ,且能够分别被GST抗体与间日疟患者的血清所识别。　结论　成功亚克隆并构建了间日疟原虫MSP1C端编码基因 pGEX 4T 2 /PvMSP1C表达质粒 ,诱导表达了GST PvMSP1C融合蛋白 ,表达蛋白具有一定免疫活性。     

GST—FHL2融合蛋白的表达及纯化

目的高效表达和纯化可溶性GST—FHL2融合蛋白。方法（1）PCR法扩增FHL2（Four and a half LIM domains2）基因的编码片段，分别在5′端和3′端加上EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点，并克隆进入原核表达载体pGEX-4T-1；（2）利用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导重组质粒pGEX4T-1-FHL2在大肠杆菌B121（DE3）中表达同时带有谷胱甘肽-S-转移酶（GST）标签的融合蛋白；（3）超声法裂解大肠杆菌，应用谷胱苷肽琼脂糖树脂纯化可溶的GST—FHL2融合蛋白；（4）通过SDS—PAGE和Western blot验证GST—FHL2的表达。结果（1）成功构建pGEX-4T-1-FHL2重组质粒，测序结果证明FHL2与载体的GST在同一读框；（2）0．1mmol／L的IPTG在23℃的条件下能诱导可溶性GST—FHL2融合蛋白高效表达；（3）在Western blot分析中，GST—FHL2能被鼠抗GST单克隆抗体特异性识别，条带所在位置和GST-FHL2的分子量相符。结论正确构建pGEX-4T-1-FHL2重组质粒，在大肠杆菌BL21中高效表达GST—FHL2融合蛋白，经谷胱苷肽琼脂糖树脂纯化得到高纯度的可溶性GST-FHL2融合蛋白。     

弓形虫不同分离株致密颗粒蛋白基因的序列分析及其在大肠埃希菌中的表达

目的?摇分析弓形虫不同分离株致密颗粒蛋白7（dense granule protein,GRA7)基因的异同及在大肠埃希菌中表达致密颗粒蛋白。 方法 从弓形虫不同分离株（RH株、ZS2株和GT株）的基因组中特异地扩增出GRA7基因，将目的基因定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1，转化大肠埃希菌JM109并测序。利用互联网上的在线工具CLUSTALW进行序列分析。异丙基-B-D-硫代半乳糖苷（IPTG）体外诱导pGEX-4T-1/GRA7重组质粒菌的表达，对表达的目的蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），分别以抗抗谷胱甘肽巯基转移酶（GST）抗体、人抗弓形虫阳性血清为一抗进行Western blotting分析。以纯化的重组蛋白作为包被抗原，ELISA 法检测抗弓形虫阴性、阳性血清。 结果 弓形虫不同分离株GRA7的基因序列相同；pGEX-4T-1/GRA7重组质粒在大肠埃希菌中表达了目的蛋白，Western blotting分析表明该蛋白为GST融合蛋白，且能被人抗弓形虫阳性血清所识别；ELISA结果表明该蛋白能与人抗弓形虫阳性血清、兔抗弓形虫阳性血清特异结合，而与抗弓形虫阴性血清无反应。 结论 弓形虫不同分离株GRA7基因具有高度保守性；GRA7基因在大肠埃希菌中以GST融合蛋白的形式得到表达，且该重组蛋白具有一定免疫反应性。     

日本血吸虫虫卵中毛蚴抗原的融合表达及抗原性分析

目的 重组表达制备日本血吸虫虫卵中毛蚴抗原（SjMP10）。 方法 根据日本血吸虫虫卵中毛蚴抗原SjMP10分子的读框序列设计合成1对引物，扩增SjMP10 DNA片段并克隆到表达载体pGEX-4T-3中。转化BL21(DE3)后，诱导表达谷胱甘肽转移酶-虫卵中毛蚴抗原10（GST-SjMP10）融合蛋白。采用洗脱法制备GST-SjMP10融合蛋白，应用免疫印迹法（Western blotting)和淋巴细胞增殖试验进行重组蛋白的抗原性分析。 结果 SjMP10基因克隆到表达质粒pGEX-4T-3后，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导能表达出Mr 39 000的GST-SjMP10融合蛋白，经电洗脱法纯化的上述重组融合蛋白可被血吸虫感染兔血清所识别，并能刺激血吸虫感染鼠脾淋巴细胞增殖。 结论 日本血吸虫虫卵中毛蚴抗原SjMP10融合表达获得成功。     

弓形虫致密颗粒蛋白基因的表达及其重组蛋白免疫反应性的评价

目的 将克隆入pGEX-4T-1的致密颗粒蛋白基因进行表达并对表达产物的免疫反应性进行评价。方法 将重组表达质粒pGEX-4T-1／GRA7转入大肠埃希菌BL21，经IPTG诱导进行SDS变性蛋白质电泳，分别以Anti-GSTAn-tibody、免抗弓形虫阳性血清和人抗弓形虫阳性血清为一抗进行Western Blot分析。用GSTrap FF HiTrap affinity columns纯化重组蛋白，以此蛋白作为包被抗原，BLISA法检测抗弓形虫阴性、阳性血清。结果 SDS变性蛋白质电泳显示在43KDa～66KDa蛋白条带之间有特异蛋白的表达，蛋白分子量大小与理论值相符。Western Blot分析表明该重组蛋白为GST融合蛋白，且该蛋白能被人抗弓形虫阳性血清、免抗弓形虫阳性血清所识别。ELISA结果表明该蛋白能与人抗弓形虫阳性血清、免抗弓形虫阳性血清特异结合，而与抗弓形虫阴性血清无反应。结论 弓形虫致密颗粒蛋白基因在大肠埃希菌中得到表达；该重组蛋白具有良好的免疫反应性。     

融合基因IFN-α1b/CSPⅡ原核表达载体的构建及在大肠埃希菌中的表达

目的　构建融合基因IFN α1b/CSPⅡ的原核表达载体并予以表达。　方法　采用聚合酶链反应(PCR)从人基因组DNA中扩增出IFN α1b基因 ,克隆入原核表达载体 pGEX 4T 1,构建原核表达载体 pGEX 4T 1/IFN α1b。利用PCR法从恶性疟原虫基因组DNA中扩增出环子孢子蛋白Ⅱ区 (CSPⅡ )基因 ,克隆入原核表达载体 pGEX 4T 1,构建原核表达载体pGEX 4T 1/CSPⅡ 。用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ将IFN α1b从原核重组质粒 pGEX 4T 1/IFN α1b中切下 ,克隆入经相同酶切的原核重组质粒pGEX 4T 1/CSPⅡ 中 ,构建融合基因的原核表达载体 pGEX 4T 1/IFN α1b/CSPⅡ。融合基因IFN α1b/CSPⅡ经异丙基 β D硫代半乳糖苷 (IPTG )诱导 ,在大肠埃希菌中进行初步表达。结果　构建的原核表达载体 pGEX 4T 1/IFN α1b、pGEX 4T 1/CSPⅡ和 pGEX 4T 1/IFN α1b/CSPⅡ经PCR和酶切鉴定与预期结果一致。证实融合基因IFN α1b/CSPⅡ拼接成功并正确地克隆入原核表达载体。在大肠埃希菌中表达出融合蛋白IFN α1b/CSPⅡ ,该融合蛋白经十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)分析与理论预测值相符。经蛋白质印迹法 (Westernblotting)鉴定具有免疫原性。　结论　构建了融合基因IFN α1b/CSPⅡ的原核表达载体 ,并在大肠埃希菌中表达了。     

SARS冠状病毒S蛋白部分序列1的克隆与表达

目的　构建SARS冠状病毒S蛋白部分序列 1(S1)的原核重组表达质粒 ,并分析其在大肠杆菌中的表达状况。方法　采用逆转录 -多聚酶链反应 (RT -PCR)技术从SARS冠状病毒RNA中扩增出编码S1蛋白的基因片段 ,并克隆至pMD18-T载体上 ;菌落PCR鉴定阳性克隆并测序列分析 ;将阳性克隆的插入片段亚克隆至表达载体pGEX - 4T - 2 ,转化大肠杆菌JM10 9,PCR和双酶切鉴定转化菌落 ;将阳性菌株经IPTG诱导 ,SDS -PAGE和免疫印迹分析截短型S蛋白的表达。结果　RTPCR扩增出S1蛋白的特异片段 ,其阳性克隆的序列存在 2处碱基突变第 36位G变为A ;第 333位由C变为T) ,其中第 36位为有义突变 ,第 333位为同义突变 ;阳性克隆中截短型S1蛋白的基因片段被亚克隆到表达载体pGEX - 4T - 2而构建成重组表达质粒 ,并在JM 10 9中表达了S1蛋白的融合蛋白 ,表达的蛋白能与GST免疫血清和SARS病人血清反应。结论　成功构建了SARS冠状病毒S1蛋白的重组表达质粒 ,该质粒在大肠杆菌中表达了截短型S蛋白的融合蛋白。