利用流式细胞仪检测人外周血NK细胞毒性方法的建立

目的利用流式细胞仪(FACS)技术检测人外周血NK细胞的毒性。方法首先将pEGFP-N1质粒转染人NK细胞的天然靶细胞K562,经过G418筛选后进一步单克隆化,得到稳定、均一表达绿色荧光蛋白的K562细胞。取对数期的K562-EGFP细胞与人外周血单个核细胞分别按5∶1、10∶1、20∶1、40∶1的比例混合,分别孵育0.5、1、2、4 h后用碘化丙啶(PI)标记,用流式细胞仪分析呈红、绿色荧光的细胞数,最后计算NK细胞的杀伤效率。结果0.5、1、2、4 h均能得到明显的杀伤效果,而且以2h的杀伤率最高。此时杀伤率与传统乳酸脱氢酶法(LDH)具有显著相关性(γ=0.997,P=0.003),而且显示出更强的敏感性。结论利用流式细胞仪检测NK细胞毒活性的方法可作为传统51Cr释放法、LDH法的一个补充,而且具有经济、快速和敏感的特点。     

基于CD107a标记流式细胞仪检测NK细胞毒性方法的建立

目的建立基于CD107a标记、利用流式细胞仪检测NK细胞毒性的方法。方法首先将外周血单个核细胞（PBMCs）与K562细胞以3：1比例混合,2h后加入莫能菌素,1．5h后加入CD107a和CD56标记抗体,流式细胞仪分析CD107a阳性细胞的频率。其次观察CD107a抗体孵育时间、不同效靶比例对CD107a阳性细胞检测的影响。最后观察该方法与传统LDH释放法检测NK细胞毒活性的一致性。结果NK细胞活化后可在其表面检测到高水平表达的CD107a分子,效靶细胞孵育结束后加入CD107a抗体可降低检测背景,低效靶比例同样具有检测敏感性。该方法与LDH释放法的检测结果一致。结论利用CD107a抗体标记检测NK细胞毒活性的方法具有快速、敏感、所需效应细胞少的优点。     

基于CD_(107a)标记流式细胞仪检测NK细胞毒性方法的建立

目的建立基于CD107a标记、利用流式细胞仪检测NK细胞毒性的方法。方法首先将外周血单个核细胞(PBM-Cs)与K562细胞以3∶1比例混合,2 h后加入莫能菌素,1.5 h后加入CD107a和CD56标记抗体,流式细胞仪分析CD107a阳性细胞的频率。其次观察CD107a抗体孵育时间、不同效靶比例对CD107a阳性细胞检测的影响。最后观察该方法与传统LDH释放法检测NK细胞毒活性的一致性。结果 NK细胞活化后可在其表面检测到高水平表达的CD107a分子,效靶细胞孵育结束后加入CD107a抗体可降低检测背景,低效靶比例同样具有检测敏感性。该方法与LDH释放法的检测结果一致。结论利用CD107a抗体标记检测NK细胞毒活性的方法具有快速、敏感、所需效应细胞少的优点。     

流式细胞仪检测外周血树突状细胞及临床应用

目的建立简便可靠的外周血树突状细胞DC1、DC2亚群检测方法,探讨DC1、DC2亚群在慢性乙型肝炎患者中改变的意义。方法用流式细胞仪检测27名健康人、29例慢性乙型肝炎患者及19例肝炎肝硬化患者外周血树突状细胞亚群。DC1不表达lin(CD19、CD20、CD56、CD14、CD3),但高表达HLA-DR及CD11c;DC2不表达lin(CD19、CD20、CD56、CD14、CD3),高表达HLA-DR及CD123。结果健康人组外周血DC1为(0.28±0.07)%,绝对计数为(18.6±5.3)×106/L,DC2为(0.22±0.09)%,绝对计数为(14.4±5.8)×106/L。慢性肝炎组DC1变化不明显(P>0.05),DC2百分比和绝对数显著下降(P<0.005),DC1/DC2升高(P<0.005)。肝炎肝硬化患者组DC1、DC2与对照组比较均明显减少(P<0.005)。结论流式细胞仪检测外周血树突状细胞亚群简便、可靠,适合于临床常规开展。DC1、DC2检测在慢性乙型肝炎和肝硬化患者的疾病进程及机体免疫状况评价方面具有重要的临床价值。     

利用流式细胞仪检测肾小球内皮细胞凋亡

利用流式细胞仪检测肾小球内皮细胞凋亡于力方王建中陈香美傅博本课题为国家自然科学基金资助项目作者单位：１００８５３北京，解放军总医院肾病科，解放军肾脏病中心和重点实验室对于细胞凋亡的检测，目前主要采用光镜、电镜以及ＤＮＡ电泳［１］等方法。本文利用流式细...     

再改良MTT法检测NK细胞活性

目的对MTT还原法检测NK细胞活性的方法进行改良.方法通过对NK细胞、K562细胞浓度的选择、效靶细胞共同孵育时间的选择,探讨MTT还原法检测NK细胞活性的最佳条件.结果通过实验确定NK细胞活性测定的最佳条件为NK细胞浓度为2×106/ml,效靶细胞比例为101,效靶细胞在37℃5%CO2饱和湿度的温箱内孵育5h后再加入MTT孵育5h,然后离心、比色、计算.应用本方法检测了25例正常献血员的NK细胞活性为32.5±5.6(%),与3H-TdR掺入抑制法结果相关性良好(r=0.912,P＜0.001).结论本改良法操作快速、简便,结果稳定、可靠,是一种有应用价值的测定NK细胞活性的方法.     

流式细胞术检测NK细胞活性在获得性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症诊断中的应用

本研究目的旨在建立一种准确、稳定的NK细胞杀伤活性检测方法,应用于获得性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症诊断。21例疑似患者及20例健康对照者纳入本研究。根据HLH-2004标准将疑似患者分为确诊组和排除组,将pEGFP—N1质粒转染人NK细胞的天然靶细胞K562,经过G418筛选后进一步单克隆,得到稳定、均一表达绿色荧光蛋白的EGFP—K562细胞,将EGFP—K562细胞与人外周血单个核细胞按10：1的比例混合孵育2小时后,用碘化丙啶（PI）标记,用流式细胞仪分析呈红、绿色荧光的细胞数,最后计算NK细胞的杀伤效率;同时采用LDH释放法测定外周血NK细胞对单纯K562细胞的杀伤活性,并进行比较。结果表明：获得了稳定表达绿色荧光蛋白的EGFP—K562细胞;流式细胞仪检测表明健康人NK细胞杀伤率与病人组之间存在明显差异,流式细胞仪技术检测NK细胞杀伤活性与传统LDH释放法检测NK细胞杀伤活性具有显著相关性。结论：EGFP—K562细胞株作为靶细胞用于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性,无需预先染色和标记靶细胞,操作简便、省时、稳定、重复性高,可应广泛应用于获得性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症诊断。     

晚孕蜕膜NK细胞与外周血NK细胞表型变化研究

目的通过比较晚孕蜕膜NK细胞(dNK细胞)与外周血NK细胞(pNK细胞)表型变化,探讨dNK细胞特异性标志与母胎界面免疫耐受的关系。方法分别收集晚孕蜕膜组织及外周血各20例,密度梯度离心法分离出淋巴细胞,流式细胞仪分别检测两组中NK细胞含量及其表面分子CD16、NKG2A、NKG2D表达水平。结果dNK细胞占蜕膜淋巴细胞39.1±3.9%,pNK细胞占外周血淋巴细胞10.3±3.2%;dNK细胞表面CD16的表达明显低于pNK细胞,两者分别(10.3±3.9)%与(95.6±2.6)%(P<0.05),NKG2A的表达明显高于pNK细胞,两者分别为(88.7±5.4)%与(24.9±7.8)%(P<0.05),NKG2D的表达两者相近,分别为(90.4±3.9)%与(93.2±3.5)%(P>0.05)。结论晚孕蜕膜中NK细胞的特殊表型可能是维持母胎界面免疫耐受的重要因素。     

流式细胞仪测定非霍奇金淋巴瘤患者外周血克隆性B细胞的临床意义

应用流式细胞仪及抗免疫球蛋白轻链κ／λ单克隆抗 体对４６例血象正常的非霍奇金淋巴瘤患者外周血单个细胞进行分析。克隆性Ｂ细胞检出率为３２．６％（１５／４６）。在初诊未治及复发患者中，克隆性Ｂ细胞检出率明显高于完全缓解期患者；在临床Ⅲ，Ⅳ期患者中，明显高于Ⅰ，Ⅱ期患者；而不同病理组织学类型患者之间克隆性Ｂ细胞检出率无明显差异。流式细胞克隆性Ｂ细胞检测对于进一步了解非霍奇金淋巴瘤患者肿胞播散程度具有一定     

流式细胞术检测乳腺癌患者血细胞中C-erbB-2表达水平及意义

目的探讨乳腺癌患者外周血中单个核细胞(PBMC)中C-erbB-2的表达水平及其与肿瘤组织中C-erbB-2、激素受体(ER、PR)表达状态及与病期的相关性。方法采用流式细胞术检测77例乳腺癌患者PBMC中C-erbB-2表达水平并与肿瘤组织中C-erbB-2、激素受体(ER、PR)表达状态及与病期进行比较。结果77例乳腺癌患者PBMC中C-erbB-2检测水平为(24.16±20.81)%。瘤组织中C-erbB-2阳性者的PBMC中的C-erbB-2值(30.69±21.70)%,高于瘤组织C-erbB-2阴性值(17.47±17.48)%,2者有显著性差异(P<0.01)。肿瘤组织中激素受体阴性与阳性者、临床分期Ⅲ~Ⅵ患者与Ⅰ~Ⅱ期患者PBMC的C-erbB-2均值无明显差别(P>0.05)。结论乳腺癌患者PBMC中C-erbB-2的表达水平与瘤组织中C-erbB-2的表达状态密切相关,与病期、瘤组织的激素受体表达状态无关。为进一步用FCM研究外周血中C-erbB-2对预后判断的影响及用于指导治疗提供依据。     

NK cell subsets and their role in allergy

Introduction: NK cells represent a distinct lymphocyte population with extensive cytolytic activity and a variety of other functions, including regulation of hemopoiesis, suppressor functions and immunoglobulin production. Recently, reports suggest that NK cells also display potent regulatory functions via secretion of cytokines or cell-contact-dependent mechanisms. Thus NK cells may regulate innate and adaptive immune responses and play a role in immune homeostasis.

Areas covered: NK cells play important roles in viral infections, autoimmunity, pregnancy, cancer and bone marrow transplantation. Although the role of NK cells in allergic diseases is poorly described, recent findings suggest their role in allergy.

Expert opinion: Recent developments in the study of NK cell subsets have support their role in allergic diseases that contribute to allergen-specific immune suppression, allergen-specific T_H1 cell generation as well as IgE and other Ig production.     

鞘内泵入吗啡对炎性疼痛大鼠T淋巴细胞亚群及NK细胞表型的影响

目的:观察鞘内泵入不同剂量的吗啡对福尔马林炎性疼痛大鼠免疫功能的影响.方法: 40 只雄性SD大鼠随机分为生理盐水对照组(NS组)、假手术组(F组)和吗啡组(M组),其中M组分为10μg*h-1(M1)、5μg*h-1(M2)、2.5μg*h-1(M3)三种不同剂量组,采用改良Yaksh法进行鞘内置管,Alzet泵持续泵入吗啡或生理盐水1天后,构建福尔马林炎性疼痛模型,根据疼痛加权评分(PIS)评价吗啡镇痛效应,持续泵入7天后分离脾脏单个核细胞进行培养,流式细胞仪检测脾脏T淋巴细胞亚群和NK细胞表型变化.结果: (1)与NS组比较,M1、M2、M3组在福尔马林炎性疼痛第一时相和第二时相的PIS有显著性差异(P<0.01),随着泵入剂量的增加,PIS逐渐下降,但三者间比较无显著性差异(P>0.05);(2) 与NS组比较,吗啡泵入7天后M1、M2、M3组可导致CD3 、 CD3 CD4 、 CD3 CD8 数量及百分率降低,CD4 / CD8 降低,CD161 数量及百分率降低,有显著性差异(P<0.05).结论: (1) 鞘内泵入吗啡( 2.5μg*h-1)对炎性疼痛大鼠具有明显的抗伤害作用;(2)鞘内泵入不同剂量吗啡(10μg*h-1、5μg*h-1、2.5μg*h-1)可剂量依赖性地抑制大鼠细胞免疫功能.     

反应性氧代谢物清除剂逆转ROM对NK细胞抗K562细胞系体外抑制作用

为了探讨新型反应性氧代谢物(reactiveoxygenmetabolites,ROM)清除剂在NK细胞抑制K562细胞时作为免疫佐剂的作用,采用IL-2及PHA活化单核(MO)细胞,使MO细胞的ROM产量增加,观察NK细胞活性和K562细胞抑制率(KIR)的相应变化,然后在不同比例的MO NK K562细胞培养体系中加入不同浓度的ROM清除剂(硫普罗宁),定期检测ROM产量及KIR(每种检测均做3个复孔),同时应用不同浓度的二氢氯组胺(DHT)作为阳性对照。结果表明:在K562细胞、NK细胞混合培养体系中,当E/T=10/1时,加入IL-2/PHA后ROM的产量从33.17±25.02U/ml增至223.59±59.41U/ml(P<0.05),KIR从65.56%升至85.89%(P<0.05);当按E/MO=10/2、10/5、10/10三种比例加入MO细胞后,ROM产量随着MO细胞数量的增加而增加(ROM产量分别为389.79±43.83U/ml,456.74±42.77U/ml,601.42±21.92U/ml),而KIR则相反(KIR分别为82.36%,81.36%,48.09%);而在K562 NK MO IL-2/PHA混合培养体系中加入硫普罗宁、DHT后,当E/MO=10/2时,ROM产量从389.79±43.83U/ml分别降至-1.20±60.70U/ml和50.21±22.4U/ml(P<0.05),KIR则从82.53%分别升至96.09%和94.64%(P<0.05)。随着硫普罗宁、DHT浓度的增加,ROM产量逐渐减少。ROM产量与KIR呈负相关(r=-0.518)。当E/MO为10/5或10/10时,各浓度硫普罗宁及高浓度的DHT可使ROM产量减少(P<0.05),但KIR提高不明显(P>0.05)。硫普罗宁在提高KIR的效应方面与DHT相似(P>0.05),而在清除ROM方面,硫普罗宁较DHT为优(P<0.05)。结论:①MO细胞是ROM产生的最主要来源,其产生的ROM可使NK细胞的抗瘤(抗K562)活性下降;②新型ROM清除剂(硫普罗宁)可有效清除ROM,在一定程度上逆转ROM对NK细胞抗K562细胞的抑制作用,且在逆转ROM方面优于DHT,在提高NK细胞对K562细胞的抑制率方面效应强度与DHT相似,但毒副作用较低,有望替代DHT作为免疫佐剂用于白血病的过继性免疫治疗中。     

残留冻存保护剂对慢性髓系白血病细胞株K562生存的影响

目的 研究冻存保护剂甘油、二甲亚砜(DMSO)、乙二醇和丙二醇对细胞生长的抑制作用.方法 常规进行细胞培养后,用台盼蓝拒染法、MTT法和流式细胞术检测不同浓度的冻存保护剂对慢性髓系血病K562细胞的生长抑制作用.结果 四种冻存保护剂终浓度为3%时,均会明显抑制K562细胞的生存;终浓度为1%的甘油和1%的DMSO对细胞的增殖无影响,其中甘油的安全性高于DMSO;而终浓度为0.5%的丙二醇会影响细胞的生存.结论 少量冻存保护剂残留可能影响K562细胞的生存,四种冻存保护剂中对细胞生长影响最小的是甘油.     

Changes in lymphocyte subset distribution aid in the differential diagnosis of renal allograft dysfunction

The distribution of selected lymphocyte subset populations in renal transplant patients was used to assist in the differential diagnosis of graft dysfunction. Patients experiencing dysfunction due to rejection showed consistent and significant decreases in relative numbers of CD 8 (cytotoxic/suppressor) lymphocytes. The ratio of CD 4 cells to CD 8 cells in this group of patients was generally greater than 2.00 due to decreases in CD 8 cells. Patients showing graft dysfunction due to viral infections showed consistent and significant increases in CD 8 cells which also bear the HNK-1 or the HLA-Dr determinants. Serial monitoring for these dual-marked lymphocytes on a weekly basis can be of considerable use in determining the etiology of graft dysfunction. Increases in other "activation" markers, including transferrin receptors, CD 38, and a T cell lineage specific activation antigen (TLiSA) were not specific for rejection; in fact, increases in CD38 were more often associated with viral infections. These studies indicated that lymphocyte subset determinations done on a regular basis can help distinguish graft dysfunction due to viral infections from other causes. The ability to distinguish rejection episodes from stable grafts is less obvious. Although the alterations in lymphocyte subset distribution are not entirely specific, they can distinguish viral infections from rejection.     

NEW HORIZONS ON STEM CELL CRYOPRESERVATION THROUGH THE ARTIFICIAL EYES OF CD 34+, USING MODERN FLOW CYTOMETRY TOOLS

Hematopoietic stem cell (HSC) cryopreservation is a critical step in autologous and cord blood transplantation (CBT). In most circumstances, cryopreservation is performed in a mixture containing dimethyl sulfoxide (DMSO), since DMSO is necessary to secure cell viability. Most centers use a controlled rate (slow) freezing before the long-term storage at vapor phase liquid nitrogen (LN₂) temperatures (≤ −160 °C). The primary objectives for laboratories supporting HSCT programs are to provide secure storage for leukapheresis and cord blood products, and to adequately characterize the functional properties of the grafts before their infusion. In the autologous setting, the large majority of the published results dealt with the assessment of the graft before cryopreservation. On the contrary, in CBT, before a CB unit is released, a sample obtained from a contiguous segment of that CB unit needs to be tested to verify HLA type and cell viability. The effects of graft handling, cryopreservation, storage and thawing on the recovery of CD34+ cells needs to be carefully analyzed and standardized on a global level. Some technical unresolved issues still limit the application of the ISHAGE derived single platform flow cytometry protocol for the assessment of the thawed material; based on these considerations, an adaptation of both the acquisition setting and the gating strategyis necessary for reliable measurement of CD34-expressing HSC in cryopreserved grafts. Artificial intelligence applied to “big data” may provide a new tool for improving advanced processing procedures and quality management guidelines in this area of investigation.     

心力衰竭患者自然杀伤细胞活性的变化

目的 探讨充血性心力衰竭（CHF）患者自然杀伤（NK）细胞活性的变化。方法 选择NYHAⅡ～Ⅳ级的CHF患者48例作为观察组，30例健康查体者作为对照组。采集清晨空腹静脉血，应用流式细胞仪测定全血NK细胞数目，应用改良MTT法测定NK细胞杀伤活性。结果 CHF患者循环NK细胞和NK细胞杀伤活性显著降低，并与心衰程度呈负相关（r=-0．873，-0．949，P均〈0．001）。结论 CHF患者NK数目和NK细胞活性显著降低，可能是CHF患者免疫功能异常的机制之一，调节细胞免疫功能治疗可能改善CHF患者预后。