高选择性RNA干扰抑制survivin基因对在体结肠癌的治疗作用

目的探讨肿瘤增殖型腺病毒Ad-delE1b55KD-shRNA/survivin-EGFP介导的针对survivin的高选择性RNA干扰对在体结肠癌细胞HT-29增殖和凋亡的影响。方法用携带针对人survivin的shRNA的肿瘤增殖型腺病毒Ad-delE1b55KDshRNA/survivin-EGFP转染结肠癌细胞HT-29裸鼠移植瘤模型,以携带相同shRNA的复制缺陷型腺病毒和脂质体载体为对照,检测移植瘤体变化,以及TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡率。结果 Ad-delE1b55KD-shRNA/survivin-EGFP介导的高选择性RNA干扰使结肠癌裸鼠移植瘤的瘤体减小、移植瘤细胞凋亡率显著增加,且高于目前常用的复制缺陷型腺病毒载体和脂质体载体(P<0.05)。结论 Ad-delE1b55KD-shRNA/survivin-EGFP介导的高选择性RNA干扰能高效地诱导结肠癌细胞凋亡并抑制其增殖。     

肝素酶特异性RNAi对人食管癌移植瘤组织中Hpa基因表达的影响

目的:应用RNAi技术沉默肝素酶(heparanase,Hpa)基因,探讨其对人食管癌裸鼠移植瘤组织中Hpa基因表达的影响.方法:①先转染后成瘤:采用浓度为15 μmol/L体外合成的Hpa小分子干扰RNA(siRNA)转染EC9706细胞72 h,另设无关序列组及空白对照组.然后将转染后的EC9706细胞种植于裸鼠皮下构建裸鼠食管癌移植瘤,待瘤体长至足够大时,取瘤组织;②先成瘤后转染:构建裸鼠食管癌移植瘤模型,待肿瘤长出1周后,依每次3 μg/只腹腔注射siRNA及无关序列,连续3 d,另1组仅注射PBS作空白对照,然后取瘤组织.采用免疫组化及原位杂交技术观察各组瘤组织中肝素酶蛋白及mRNA的表达.结果:无论是先转染后成瘤组还是先成瘤后转染组siRNA均可下调裸鼠食管癌移植瘤组织中Hpa蛋白及mRNA的表达,与无关序列组及空白对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:应用RNAi技术沉默Hpa基因可以有效下调裸鼠食管癌移植瘤组织中Hpa蛋白及mRNA的表达,为临床防治食管癌浸润转移奠定了一定的理论基础.     

GRβ shRNA稳定表达胶质瘤细胞株的构建及功能初探

目的:构建并鉴定糖皮质激素受体β(GRβ)RNA干扰稳定表达胶质瘤细胞株,研究GRβ对胶质瘤细胞周期及增殖的影响?方法:根据GRβ mRNA 序列设计特异性小干扰RNA(siRNA),以LipofectamineTM 2000转染人胶质瘤细胞,RT-PCR及Western blot鉴定其有效性;体外合成该siRNA插入序列小发卡RNA(shRNA)并定向克隆至真核表达载体pGPH1/GFP/Neo,转染后,通过G418筛选稳定表达细胞株(G0306),Western blot 检测GRβ表达?MTS和流式细胞术检测GRβ干扰对胶质瘤细胞增殖及细胞周期的影响?结果:GRβ siRNA能有效抑制GRβ的表达,DNA测序证实合成并克隆入真核表达载体pGPH1/GFP/Neo的shRNA序列完全正确;GRβ shRNA稳定表达人胶质瘤细胞株阻滞于G1期?细胞增殖能力显著下降?结论:成功构建人GRβ shRNA稳定表达胶质瘤细胞株 (G0306),初步表明GRβ影响胶质瘤细胞的增殖,为后期研究GRβ在中枢神经系统肿瘤中的作用及机制奠定了基础?     

RNA干扰survivin基因对Eca-109细胞体内增殖的影响

目的利用RNA干扰抑制Eca-109细胞survivin基因表达,观察survivin沉默后对食管癌细胞Eca-109体内增殖的影响。方法构建靶向survivin基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,利用LipofectamineTM2000脂质体转染Eca-109细胞,建立稳定转染干扰组细胞Eca-109/si-survivin;同法建立阴性对照组细胞Eca-109/si-control,并以Eca-109为空白对照组细胞;通过Western blot检测survivin基因沉默效果;借助裸鼠移植瘤模型分析survivin干扰前后裸鼠成瘤时间及瘤结节质量的改变,比较各组Eca-109细胞的体内增殖速度;通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记技术法检测移植瘤细胞凋亡的变化。结果干扰组细胞survivin蛋白表达显著低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),而阴性对照组细胞survivin蛋白表达与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。干扰组裸鼠平均瘤结节质量显著低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),而阴性对照组与空白对照组裸鼠的平均瘤结节质量差异均无统计学意义(P>0.05)。干扰组裸鼠移植瘤细胞凋亡指数明显高于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),而阴性对照组与空白对照组裸鼠移植瘤细胞凋亡指数比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论靶向survivin的siRNA能特异性沉默survivin基因表达,诱导细胞凋亡,进而抑制人食管癌Eca-109细胞的体内增殖。     

yrdC靶向RNA干扰抑制BGC-823细胞裸鼠体内成瘤的实验研究

目的检测胃癌组织及癌旁正常组织中的yrdC的mRNA、蛋白表达。构建表达yrdC靶向RNA干扰的重组腺病毒,转染人胃癌细胞株BGC-823,检测干扰后BGC-823细胞yrdC蛋白水平变化,转染后细胞移植裸鼠体内成瘤,观察yrdC沉默后移植瘤生长的变化。方法采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot法,检测7例胃癌组织及癌旁正常组织中的yrdC的mRNA、蛋白表达。构建表达针对人yrdC的si RNA的重组腺病毒,重组腺病毒Ad-shyrdC转染BGC-823细胞,Western blot检测干扰后BGC-823细胞yrdC蛋白水平变化。裸鼠分3组,分别皮下移植转染Ad-shyrdC、空病毒Ad-Null及未转染的BGC-823细胞（1&#215;107/只）,5周后检测裸鼠肿瘤的体积及质量,肿瘤HE染色及yrdC、PCNA、TUNEL免疫组化染色,观察各组yrdC蛋白表达、细胞增殖能力及细胞凋亡的变化。结果胃癌组织中yrdC mRNA及蛋白表达量均比癌旁组织增高。成功构建表达抑制yrdC基因的重组腺病毒Ad-shyrdC,腺病毒介导的yrdC靶向RNA干扰能特异性抑制BGC-823中yrdC蛋白的表达,Ad-shyrdC组肿瘤细胞yrdC蛋白水平明显下降。转染BGC-823细胞后移植裸鼠体内,5周后成瘤体积及质量较Ad-Null组及PBS对照组明显减小（P〈0.05）;yrdC蛋白表达减少,PCNA染色提示肿瘤细胞增殖活性受抑,TUNEL染色显示凋亡明显增多（P〈0.01）。结论腺病毒介导的RNA干扰能有效抑制BGC-823细胞裸鼠体内成瘤,yrdC基因有可能成为胃癌基因治疗的靶点。     

HMGA2基因沉默对结肠癌LS 174T细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨利用小发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）干扰技术沉默高迁移率族蛋白A2（high mobility group protein AT-hook 2,HMGA2）基因,观察对结肠癌LS 174T细胞增殖和侵袭的影响。方法构建HMGA2基因特异性shRNA慢病毒载体,干扰结肠癌LS 174T细胞,设立空白对照组（MOCK）、阴性对照组（Scramble shRNA）和HMGA2 shRNA三组,利用Real-time PCR和Western blot方法分别从基因和蛋白水平检测shRNA对HMGA2基因的干扰效果;MTT法检测抑制HMGA2基因表达后LS 174T细胞增殖情况;Transwell侵袭实验检测HMGA2基因沉默后LS 174T细胞侵袭能力的变化。结果转染shHMGA2慢病毒后,结肠癌LS 174T细胞中HMGA2 mRNA和蛋白表达均明显受到抑制（P〈0.01）;MTT法检测各组细胞的增殖能力,shHMGA2组细胞增殖水平明显低于空白对照组和阴性对照组（P〈0.05）;敲除HMGA2基因可明显降低LS 174T细胞的侵袭能力,空白对照组和阴性对照组平均穿膜细胞数分别为（124.28±65）/视野和（118.52±15）/视野,shHMGA2组平均穿膜细胞数为（53.35±8.45）/视野（P〈0.05）。结论 shHMGA2慢病毒能明显下调HMGA2基因的表达,在体外可有效抑制结肠癌LS 174T细胞的增殖和侵袭。     

PHF8基因对食管鳞状细胞癌裸鼠移植瘤生长的影响

目的 利用慢病毒(lentivirus)介导的短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)建立人食管鳞状细胞癌(esophageal squamous-cell carcinoma,ESCC,以下简称食管鳞癌)裸鼠移植瘤模型,观察锌指蛋白8(plant homeodomain finger protein 8,PHF8)对移植瘤生长的影响。方法 分别将未感染慢病毒(空白对照组)、感染Nonsilencing-shRNA慢病毒(阴性对照shRNA组)和PHF8 shRNA慢病毒(PHF8 shRNA组)的人食管鳞癌细胞系TE-1接种于裸鼠背部皮下,建立食管鳞癌裸鼠移植瘤模型。定期测量肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。4周后处死裸鼠,定量PCR及Western blotting法检测肿瘤组织中PHF8的表达。结果 PHF8 shRNA组较阴性对照shRNA组、空白对照组的裸鼠致瘤能力明显减弱,PHF8 mRNA和蛋白的表达水平显著降低。结论 慢病毒介导的shRNA干扰能有效减少食管鳞癌裸鼠移植瘤中PHF8的表达,而降低PHF8的表达能抑制食管鳞癌移植瘤的生长。     

靶向EZH2的shRNA表达对SW480细胞的抑制作用及5-Fu对其影响的研究

目的 研究EZH2特异性shRNA对人结肠癌细胞株SW480细胞的抑制作用和化疗药物5-FU对其干预作用的影响。方法 体外将EZH2特异性shRNA表达载体转染SW480细胞,RT-PCR和Western blotting检测细胞EZH2 mRNA及蛋白的表达,M TT法检测细胞增殖活性;将靶向EZH2的shRNA表达的SW480细胞接种于裸鼠,5-FU对其进行干预,RT-PCR检测瘤组织EZH2 mRNA的表达。结果 与阴性对照组相比,基因沉默组EZH2 mRNA表达明显降低(P<0.01),EZH2蛋白表达明显降低(P<0.05);与空白对照组相比,基因沉默组细胞生长受到明显抑制(P<0.05);接种于裸鼠后,与正常组相比,5-FU基因沉默组与基因沉默组瘤组织体积、质量、EZH2 mRNA的表达均明显降低(P<0.01),与基因沉默组相比,5-FU基因沉默组EZH2 mRNA的表达明显降低(P<0.05)。结论 靶向EZH2的shRNA表达在体外及体内均可显著抑制SW480细胞EZH2 mRNA和蛋白表达及细胞生长;5-FU能显著抑制体内EZH2基因沉默的SW480细胞EZH2 mRNA的表达。     

shRNA干扰COPS3基因对人成骨肉瘤细胞的影响

目的:探究shRNA干扰COPS3基因对人成骨肉瘤细胞基因水平、蛋白水平、增殖能力等方面的影响。方法:选择人成骨肉瘤Saos-2细胞,感染pLKO.1-COPS3shRNA病毒质粒作为Saos-2siCOPS3细胞(实验组),感染pLKO.1-TRC control病毒质粒作为Saos-2CON细胞(对照组),感染成功后进行细胞培养,收集细胞用RT-PCR测定COPS3基因mRNA表达量,Western blot检测蛋白表达水平,MMT测定细胞增殖能力,对裸鼠接种细胞悬液进行裸鼠成瘤试验。结果:Saos-2siCOPS3细胞中,COPS3基因mRNA表达水平与对照组相比下降(P<0.05),蛋白表达水平、细胞增殖能力与对照组相比下降(P<0.05),干扰COPS3基因与对照组相比抑制肿瘤体积、重量增加(P<0.05)。结论:COPS3调控骨肉瘤细胞的增殖与骨肉瘤的发生、发展密切相关。     

RNAi沉默c-Met基因对人脑胶质瘤U251细胞增殖及侵袭能力的影响

目的  探讨RNAi沉默c-Met基因对人脑胶质瘤U251细胞增殖及侵袭能力的影响。方法  分别构建3种靶向c-Met基因的短发卡RNA（shRNA）序列,以脂质体转染的方式导入人脑胶质瘤U251细胞,并筛选出稳定表达的细胞株。采用PCR和Western blot检测c-Met-shRNA转染后U251细胞c-Met的表达情况,以筛选出可有效沉默c-Met基因的shRNA。c-Met基因沉默后,采用MTT法和流式细胞术检测U521细胞增殖情况,采用Transwell法和细胞划痕实验检测U251细胞侵袭和迁移情况,采用裸鼠荷瘤实验研究U251细胞体内成瘤性。结果  成功构建可有效沉默c-Met基因的c-Met-shRNA1。沉默c-Met后,c-Met mRNA以及蛋白的表达均显著下降,差异有统计学意义（P <0.05）;而且可明显抑制U251细胞的增殖、侵袭、迁移以及体内成瘤能力,差异有统计学意义（P <0.05）。结论  RNAi沉默c-Met基因可有效抑制人脑胶质瘤U251细胞的增殖、侵袭、迁移以及体内成瘤能力。

     

STAT3小干扰RNA的构建及其对人结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响

目的：构建以STAT3为靶基因的短发夹状小干扰RNA表达载体,并探讨STAT3小干扰RNA表达载体对人结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响。方法：以pGPU6／GFP／STAT3质粒为载体,构建STAT3的小干扰RNA表达载体,使用脂质体法转染人结肠癌HCT116细胞系,用M1Tr法检测空白对照组、小干扰RNA组、阴性对照组与脂质体对照组的增殖活性,48h后流式细胞仪分析4组细胞周期分布与凋亡的变化,并且通过RT—PCR和Westernblot检测结肠癌HCTll6细胞STAT3基因mRNA和蛋白表达水平。结果：酶切鉴定和测序分析表明靶向STAT3的RNA干扰重组体构建成功;重组体转染HCT116后,STAT3的mRNA和蛋白水平较空载体转染组显著下降;小干扰RNA组与3对照组相比细胞增殖活性明显受到抑制（P〈0．01）;细胞生长明显减缓,G0／G1期细胞比例增加（P〈0．01）。结论：沉默STAT3基因可有效控制结肠癌细胞的增殖,使癌细胞阻滞于G0／G1期并诱导其凋亡,可望成为结肠癌治疗的新方法。     

NK-92细胞联合靶向Her2基因的siRNA治疗卵巢癌的体外及动物实验

目的：探讨NK-92细胞对抑制Her2基因表达的卵巢癌细胞株SKOV-3细胞在体外及体内的杀伤活性。方法：靶向Her2的siRNA转染SKOV-3,筛选得到能稳定抑制Her2基因表达的细胞株SKOV-3/siRNA,并通过RT-PCR和免疫组织化学方法检测Her2基因抑制效果。应用LDH法检测NK-92细胞对SKOV-3、SKOV-3/siRNA的杀伤活性。将SKOV-3、SKOV-3/siRNA细胞接种到裸鼠皮下检测荷瘤情况,并比较NK-92细胞在各组治疗效果。结果：建立了稳定抑制Her2基因表达的细胞株SKOV-3/siRNA,Her2基因表达受到较强抑制。NK-92在效靶比1∶20时对SKOV-3、SKOV-3/siRNA细胞杀伤率分别为（21.1±6.8）%和（45.5±8.9）%,差异有统计学意义（P〈0.01）。接种SKOV-3/siRNA细胞实验组各时间点瘤体积均明显小于SKOV-3对照组（P〈0.05~P〈0.01）。SKOV3/siRNA＋NK-92治疗组肿瘤质量均小于其他各组（P〈0.05~P〈0.01）。结论：NK-92细胞联合靶向Her2基因的siRNA可以抑制卵巢癌细胞株SKOV-3在体外和体内增殖,有望成为卵巢肿瘤治疗的新途径。     

结直肠癌LoVo细胞株EMT逆转前后耐药相关ABC转运蛋白基因的变化

目的：观察结直肠癌LoVo细胞株发生上皮细胞间质转型（EMT）逆转前后3种耐药相关ABC转运蛋白基因的表达.方法：运用荧光定量PCR的方法,比较发生EMT的细胞株LoVo GnT-V/NC和EMT逆转之后的细胞株LoVo GnT-V/1564中 ABCB1、ABCC3、ABCB6基因表达量.结果：LoVo GnT-V/NC细胞中ABCB1基因表达量是LoVo GnT-V/1564的7.67倍;LoVo GnT-V/NC和LoVo GnT-V/1564细胞中ABCC3、ABCB6基因表达量差异均无统计学意义（P〉0.05）.结论：LoVo细胞株EMT发生后肿瘤细胞的耐药相关基因ABCB1的表达量也发生了改变,EMT可能与肿瘤的多药耐药相关.     

靶向血管内皮生长因子受体3基因的小干扰RNA表达载体构建及其生物学效应

目的构建靶向血管内皮生长因子受体3（VEGFR-3）基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体（psiRNA-VEGFR-3）,并观察其抑制人结肠癌细胞株LoVo细胞中VEGFR-3基因表达的效果及生物学效应。方法设计并合成1对VEGFR-3编码基因的反向重复序列,定向克隆至载体pSUPER,构建siRNA真核表达载体,利用脂质体2000将构建的psiRNA-VEGFR-3载体转入LoVo细胞中,应用半定量RT-PCR检测基因转染前后VEGFR-3mRNA表达水平的变化,四甲基偶氮唑蓝法观察细胞生长变化、凋亡率及细胞周期的变化。结果成功构建针对VEGFR-3基因的siRNA表达载体。psiRNA-VEGFR-3可显著抑制LoVo细胞中VEGFR-3基因的表达（P〈0．01）;转染psiRNA-VEGFR-3后能够诱导LoVo细胞发生明显凋亡。结论psiRNA-VEGFR-3载体能够在LoVo细胞中引发RNA干扰效应,通过下调VEGFR-3基因表达可以抑制细胞增殖,诱导LoVo细胞发生明显凋亡。     

RNA干扰survivin对卵巢癌HO-8910PM细胞周期的影响

目的 探讨RNA干扰survivin基因对卵巢癌HO-8910PM细胞周期的影响.方法 实验分3个组：siR-NA组,采用脂质体法将靶向survivin siRNA荧光真核表达质粒载体pGPU6-GFP-survivin-shRNA转染卵巢癌HO-8910PM细胞;空白对照组,单纯细胞培养;阴性对照组,用表达与survivin序列无同源性的siRNA片段质粒pGPU6-GFP-NC转染细胞.于转染后48 h和72 h,用PI单染法流式细胞术检测各组HO-8910PM细胞周期的变化以及Western blot检测survivin蛋白的表达情况.结果 PI单染流式细胞仪检测细胞周期结果表明,与空白对照组和阴性对照组相比较,2个时间点siRNA组转染后的G0/G1期细胞比例明显增加,而G2/M期细胞比例均下降（P＜ 0.05）;Western blot结果证实,siRNA组的HO-8910PM细胞survivin蛋白的表达量明显下调.结论 导入survivin基因特异性的siRNA可导致卵巢癌HO-8910PM细胞周期阻滞于G0/G1期,细胞增殖受阻,且细胞sur-vivin蛋白表达量下降.     

HDAC2 siRNA转染对人胰腺癌细胞增殖及凋亡的影响

［摘要］目的: 探讨RNA干扰沉默组蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase 2,HDAC2)基因表达对人胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法: 培养人胰腺癌PaTu8988细胞株,并将其随机分为5组:空白对照组,20 nmol／L HDAC2 siRNA阴性组,40 nmol／L HDAC2 siRNA阴性组,20 nmol／L HDAC2 siRNA组,40 nmol／L HDAC2 siRNA组。合成针对HDAC2基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),利用阳离子脂质体将HDAC2 siRNA瞬时转染人胰腺癌PaTu8988细胞,分别采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹法检测HDAC2基因及蛋白的表达;MTT比色法检测细胞的增殖率;流式细胞术测定细胞凋亡率。结果: 与空白对照组和阴性siRNA 组对比,HDAC2 siRNA组的HDAC2基因和蛋白的表达水平均明显下降(P均<0.05),细胞增殖率减慢(P<0.01),凋亡率明显升高(P<0.01)。结论: 采用RNA干扰沉默人胰腺癌细胞HDAC2基因表达,可抑制癌细胞增殖和诱导其凋亡。     

靶向4-1BBL基因siRNA抑制HL-60B细胞生长的体外研究

目的：观察4-1BBL基因小分子干扰RNA（siRNA）对HL-60细胞生长及诱导其凋亡作用的影响。方法：化学合成法合成靶向人4-1BBL基因siRNA,脂质体转染法转染HL-60B细胞;半定量PCR和流式细胞术检测转染前后HL-60B细胞4-1BBL的表达水平,MTT法检测HL-60B细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡。结果：靶向4-1BBL基因siRNA转染HL-60B细胞后,4-1BBLmRNA和蛋白的表达明显降低;细胞增殖被抑制,其抑制作用在转染后48h最明显,增生抑制率达到（22.1±2.3）%;细胞凋亡率增加,由（9.8±2.5）%上升到（32.5±5.1）%。结论：化学合成的siRNA在体外能成功抑制靶基因4-1BBL的表达和HL-60B细胞的增殖,并有助于细胞趋向凋亡。     

CBP基因沉默抑制血管平滑肌细胞增殖的研究

目的:探讨RNA干扰大鼠CREB结合蛋白(rCBP)基因对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响.方法:根据CBP cDNA序列构建可同时表达4条针对rCBP mRNA特异的短发夹RNA(shR-NA)、携带绿色荧光蛋白的腺病毒(CBP-shRNA/Ad).以空腺病毒为转染对照组、含非特异性shRNA编码序列的腺病...     

小分子干扰RNA下调星形细胞上调基因1的表达对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨小分子干扰RNA(siRNA)下调星形细胞上调基因1(AEG-1)表达对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响。方法卵巢癌细胞株SKOV3分为3组:空白对照组(不做任何处理)、阴性对照组(对照siRNA转染)和观察组(AEG-1 siRNA转染)。用反转录聚合酶链反应观察AEG-1 siRNA对AEG-1基因表达的影响;甲基噻唑基四唑法观察AEG-1 siRNA对卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测AEG-1 siRNA对卵巢癌SKOV3细胞凋亡和细胞周期的影响。结果空白对照组和阴性对照组AEG-1 mRNA表达、SKOV3细胞增殖、细胞凋亡率及在DNA合成前期(G0/G1期)、合成期(S期)、合成后期(G2/M期)的细胞比例差异均无统计学意义(P>0.05)。观察组SKOV3细胞AEG-1 mRNA表达显著低于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。观察组SKOV3细胞增殖在24、48、72 h较空白对照组和阴性对照组均显著减慢,差异有统计学意义(P<0.01)。观察组SKOV3细胞凋亡率显著高于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.01);观察组SKOV3细胞在DNA合成前期(G0/G1期)细胞比例显著高于空白对照组和阴性对照组(P<0.01),而合成期(S期)、合成后期(G2/M期)的细胞比例均显著低于空白对照组和阴性对照组(P<0.01),差异均有统计学意义。结论 siRNA可通过下调卵巢癌SKOV3细胞AEG-1基因的表达,抑制其增殖,促进其凋亡。     

5'-氮杂-2'-脱氧胞苷对结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中MLH-1基因甲基化状态、mRNA及蛋白表达的影响

目的:探讨甲基化酶抑制剂5'-氮杂-2'-脱氧胞苷(5'-Aza-2'-deoxycytidine)对结直肠癌细胞株HT-29和Lo Vo中MLH-1基因甲基化水平、mRNA及蛋白表达的影响。方法:用不同浓度5'-氮杂-2'-脱氧胞苷处理结直肠癌细胞株HT-29和Lo Vo。应用Taq Man探针为基础的实时定量PCR(Methylight)方法、SYBR Green PCR方法及蛋白印迹实验(Western blot)检测药物处理前后HT-29和Lo Vo细胞中MLH-1基因的甲基化状态、mRNA和蛋白表达。结果:Methylight检测HT-29细胞株中MLH-1蛋白在药物作用后异常甲基化得到逆转;实时荧光定量PCR和Western Blot检测到0.5、1.0、1.5μmol/L 5'-氮杂-2'-脱氧胞苷处理后MLH-1基因mRNA和蛋白表达上调,实时荧光定量PCR检测对照组和不同浓度实验组在HT-29细胞株相对表达量分别为1.000±0.000、1.171±0.126、1.356±0.085和1.422±0.090;在Lo Vo细胞株相对表达量分别为1.000±0.000、1.117±0.094、1.273±0.062和1.285±0.070。Western blot检测MLH-1蛋白对照组和不同浓度实验组在HT-29细胞株相对表达量分别为0.114±0.033、0.365±0.040、0.831±0.041和0.849±0.051;Lo Vo细胞株相对表达量分别为0.602±0.020、0.621±0.028、0.934±0.029和1.057±0.045。以上作用均呈时间、剂量依赖性,MLH-1基因mRNA在HT-29细胞株表达(F=8.918,P=0.010)和Lo Vo细胞株表达(F=8.351,P=0.011)具有统计学意义。MLH-1蛋白表达在HT-29细胞株表达(F=226.825,P=0.000)和Lo Vo细胞株表达(F=153.642,P=0.000)亦具有统计学意义。结论:结直肠癌细胞株HT-29和Lo Vo中MLH-1启动子甲基化可能是导致该基因表达下调甚至失活的主要原因。5'-氮杂-2'-脱氧胞苷能够较成功的逆转结直肠癌细胞株HT-29和Lo Vo中MLH-1基因的甲基化状态,并能恢复mRNA及蛋白重新表达。