骨髓干细胞在小鼠糖尿病性肾脏疾病表型转移中的作用

目的 观察骨髓干细胞在糖尿病性肾脏疾病表型转移中的作用。方法采用链脲佐霉素（STZ）腹腔注射复制糖尿病动物模型,分离糖尿病小鼠和正常小鼠骨髓细胞,经尾静脉分别注入受放射后的小鼠体内作为实验组及对照组,移植后第8周测定各组小鼠空腹血糖和葡萄糖耐量、尿白蛋白、肾小球中a1Ⅳ型胶原和TGF-β1 mRNA的表达及肾脏病理改变。结果发现实验组小鼠血糖和葡萄糖耐量基本正常,但尿白蛋白／肌酐比值较对照组高出3．3倍,肾小球体积增大1．2倍,肾小球系膜基质增宽1．98倍,肾内Ⅳ型胶原沉积增多,肾小球中α1Ⅳ型胶原mRNA和TGF-β1 mRNA表达明显增强。结论骨髓干细胞在STZ复制的糖尿病小鼠肾脏病变表型转移中具有重要作用。     

蛋白激酶C-α、蛋白激酶C-βⅠ和蛋白激酶C-βⅡ在糖尿病肾病患者肾小球中的表达及其意义

目的探讨蛋白激酶C（PKC）-α、PKC-βⅠPKC-βⅡ在人正常肾组织以及糖尿病肾病患者（DN）肾小球中的表达及其与肾小球内转化生长因子（TGF-βⅠ和血管内皮细胞生长因子（VEGF）的关系。方法以正常肾组织为对照，取糖尿病肾病患者活检肾组织，采用PAS染色判定肾小球细胞外基质（ECM）扩张程度，半定量免疫组织化学法检测PKC-α、PKC-βⅠPKC-βⅡ、TGF-βⅠVEGF在肾小球中的表达。结果（1）PKC-α、PKC-βⅠPKC-βⅡ在正常肾小球中均有表达；（2）糖尿病肾病患者肾小球中PKC-α、PKC-βⅠTGF-β1和VEGF的表达明显增强而PKC-βⅡ的表达明显减弱，且肾小球ECM明显增加。其中PKC-α与VEGF的表达变化呈正相关（r，=0．600，P=0．039），PKC-βⅠTGF-βⅠ表达呈正相关（r=0．521,P=0．043）。结论PKC-α、PKC-βⅠPKC-βⅡ在正常人以及DN患者肾小球中的表达不同；PKC-α可能通过增强肾小球内VEGF的表达，而PKC-βⅠ能通过增强肾小球内TGF-βⅠ表达参与DN的发病过程。     

脂质与糖尿病大鼠肾小球TGF-β/Smad信号通路的关系

目的 探讨脂质对糖尿病大鼠肾小球TGF-β／Smad信号通路的影响。方法 糖尿病大鼠随机分成普通饲料组，高脂饲料组、高脂饲料加辛伐他汀干预组（辛伐他汀组）和正常对照组。16周后，采用RT-PCR、免疫组化和Western印迹法检测大鼠肾小球转化生长因子β1（TGF-β1）、转化生长因子Ⅱ型受体（TβRⅡ）、Ⅵ型胶原（ColⅥ）mRNA和蛋白和磷酸化Smad2（p—Smad2）表达的变化。结果 与正常对照组比较，普通饲料组、高脂饲料组、辛伐他汀组肾小球TGF-β1、TβRⅡ、ColⅥmRNA和蛋白及p-Smad2表达均上调，高脂饲料组上调最为明显；与高脂饲料组比较，辛伐他汀组TGF-β1、TβRⅡ、ColⅥ和p-Smad2表达明显下调。结论 脂质通过激活TGF-β／Smad信号通路，加剧糖尿病肾脏病变；辛伐他汀抑制TGF-β／Smad通路的激活，延缓糖尿病肾病的进展。     

高糖条件下基质细胞趋化因子1α抑制人肾小管上皮细胞Ⅳ型胶原表达

目的 本文探讨基质细胞趋化因子1α （stromal cell-derived factor-1,SDF-1α）对人肾小管上皮细胞（HK细胞）细胞外基质（Ⅳ型胶原）表达的影响.方法 不同浓度的葡萄糖培养HK细胞,分为正常葡萄糖组（NG组：含5.5 mmol/L葡萄糖）和高糖组（HG组：含25.0 mmol/L葡萄糖）,分别用转化生长因子β1 （TGF-β1）和SDF-1α干预HK细胞12h,再分为空白对照组（NC组）、阴性对照组（DMSO组）、T组（TGF-β1组）、S组（SDF-1α组）、T＋S组（TGF-β1和SDF-1α共同干预组）,采用实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blotting分别检测Ⅳ型胶原mRNA和蛋白的表达.两组间比较采用t检验.结果 （1）HK细胞能持续表达SDF-1α和其受体CXCR4 mRNA.高糖条件下SDF-1α和CXCR4mRNA表达呈时间梯度增加,24 h两者表达量达到高峰.24 h CXCR4 mRNA表达量是12h表达量的1.2倍（t=6.08,P＜0.05）,SDF-1αmRNA表达量是12h的1.58倍（t=7.52,P＜0.05）.（2）高糖条件下SDF-1α抑制HK细胞Ⅳ型胶原mRNA和蛋白的表达,并能降低由TGF-β1诱导的Ⅳ型胶原表达.S＋T组Ⅳ型胶原mRNA表达量是T组的0.33倍（t=12.57,P＜0.05）,蛋白表达量是T组的0.47倍（t=14.23,P＜0.05）.但在正常葡萄糖条件下,SDF-1α对由TGF-β1诱导的Ⅳ型胶原表达没有影响.（3）TGF-β1促进HK细胞Ⅳ型胶原mRNA和蛋白表达,高糖条件下其促进作用更为显著.T组Ⅳ型胶原mRNA是正常对照组的6.63倍（t=19.21,P＜0.05）,蛋白表达量是其2.59倍（t=15.71,P＜0.05）.结论 高糖条件下SDF-1α能减轻TGF-β1诱导的HK细胞Ⅳ型胶原表达,可能由此改善肾脏纤维化.TGF-β1促进HK细胞Ⅳ型胶原的表达,促进肾脏纤维化的发生发展.     

ICOS转基因小鼠感染日本血吸虫后HSCs活化效应及对肝纤维化的影响

目的 观察ICOS转基因小鼠感染日本血吸虫后原代肝星状细胞（HSCs）的活化效应,探讨ICOSL/ICOS信号介导HSCs活化在血吸虫病肝纤维化形成中的作用.方法 建立ICOS-Tg小鼠及野生型小鼠日本血吸虫模型,通过肝脏酶灌注法和密度梯度离心法分离感染前（0周）和感染后（4～9周）的小鼠原代HSCs,运用台盼蓝拒染法鉴定分离的原代HSCs成活率;应用其在328 nm波长紫外激发光下自发荧光特性以及在肝细胞中其特异性表达神经胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）鉴定分离的原代HSCs纯度;培养7d后,采用SYBR染料法实时荧光定量PCR检测原代HSCs中TGF-β1,Ⅰ、Ⅲ型胶原及α-SMA mRNA的表达变化.结果 分离的原代HSCs纯度达到90％,其成活率为95％.ICOS-Tg小鼠肝HSCs中α-SMAmRNA表达水平即HSCs的活化程度在感染后6、9周显著高于同时期野生型小鼠（P＜0.01）.ICOS-Tg小鼠肝HSCs中TGF-β1,Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA水平亦高于同时期野生型小鼠的水平,特别是在感染后6、9周呈显差异有统计学意义（P＜0.01～0.05）.结论 与野生型小鼠相比,感染日本血吸虫的ICOS-Tg小鼠肝HSCs活化增强,显著上调TGF-β1 mRNA、Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA及α-SMA mRNA的表达,提示在ICOS-Tg小鼠,ICOSL/ICOS信号的增强可明显上调HSCs活化促进肝纤维化的形成.     

高糖状态下肾脏系膜细胞葡萄糖转运蛋白1的表达及氟伐他汀的干预研究

目的观察高糖环境中大鼠肾脏系膜细胞（MC）葡萄糖转运蛋白1（GluT-1）及转化生长因子1（TGF-β1）mRNA表达变化以及氟伐他汀（Flu）的干预作用，探讨其保护肾脏的可能机制。方法原代培养MC分为正常对照（NG）组、甘露醇（MG）组、高糖（HG）组及HG＋Flu组，RT-PCR法检测细胞中GluT-1mRNA和TGF-β1 mRNA的表达，放免法测定各组细胞培养上清液中Ⅳ型胶原含量。结果HG组各时相点GluT-1mRNA、TGF-β1 mRNA表达量均高于NC组（P〈0．01），从48h开始HG组细胞上清液Ⅳ型胶原的含量较NC组增高（P〈0．05），而HG＋Flu组GluT-1 mRNA表达量、TGF-β1 mRNA的表达、细胞上清液Ⅳ型胶原含量均较同时点HG组明显降低（P〈0．01）。结论高糖刺激使MC内GluT-1 mRNA表达增高，TGF-β1 mRNA表达上调，Ⅳ型胶原分泌增多。高糖状态下，Flu抑制细胞外基质积聚的作用可能与其抑制高糖引起MC GluT-1过表达、减少TGF-β1的合成有关。     

蛋白激酶C和TGF-β1在糖尿病大鼠肾脏中的表达

目的研究糖尿病大鼠肾小球中蛋白激酶C（PKC）活性变化和转化生长因子-β1（TGF-β1）的动态变化，探讨二者之间相互关系及其与糖尿病肾病（DN）发生发展的关系。方法用链脲佐菌素制备糖尿病大鼠实验模型，将大鼠随机分为正常对照组（N）、糖碌病2w组（DM2）和糖尿病4w组（DM4）。断头处死，分离肾小球，提取纯化胞浆及胞膜蛋白，利用（γ-32^P）-ATP底物磷酸化的方法检测胞浆及胞膜PKC括性。用免疫组织化学和400倍光镜检测TGF-β1在各组大鼠肾脏的表达。结果（1）糖尿病大鼠肾小球细胞内总的PKC活性与对照组无显著性差异，胞浆PKC活性略有下降，相差不显著；肾小球细胞膜PKC活性明显高于正常对照组，膜结合PKC百分比显著增加，且细胞膜PKC活性与肾脏肥大指数及Cer呈正相关。（2）糖尿病组TGF-β1的表达多于正常组。（3）肾小球细胞膜PKC活性与TGF-β1的表达正相关。结论高血糖慢性刺激可引起肾小球PKC活性增高，并诱导TGF-β1的表达。在糖尿病早期肾内血流动力学改变中发挥着重要的调控作用。     

丹参酮ⅡA对大鼠肾间质纤维化的抑制作用

目的：探讨丹参酮ⅡA对大鼠肾间质纤维化的作用及机制。方法：30只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组和丹参酮ⅡA组。结扎大鼠单侧输尿管建立肾间质纤维化动物模型。丹参酮ⅡA经腹腔注射，剂量为1．5mg／（kg·d）。术后第10天取梗阻侧肾组织作HE、Masson染色，观察肾间质病理改变。免疫组化法检测肾组织转化生长因子-β1（TGF-β1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及Ⅰ型胶原的蛋白表达与定位。逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测三者的mRNA水平。结果：模型组术后第10天梗阻侧出现明显的肾间质纤维化，肾组织TGF-β1、α—SMA和Ⅰ型胶原的蛋白及mRNA表达显著增加（P〈0．01）。丹参酮ⅡA组肾间质纤维化程度减轻，肾组织TGF-β1、α—sMA及Ⅰ型胶原表达下调（P〈0．05）。结论：丹参酮ⅡA对大鼠肾间质纤维化有明显的抑制作用，其机制可能与下调TGF-β1表达，抑制成纤维细胞增殖和表型转化，减少胶原沉积有关。     

转化生长因子β1反义寡核苷酸抑制单侧肾切除糖尿病大鼠系膜增生

目的 探讨转化生长因子（TGF）β1反义寡核苷酸对单侧肾切除糖尿病大鼠系膜增生的作用。方法 采用人工合成TGF－β1反义、正义及错配的3组寡核苷酸经脂质体包裹柏转染单侧肾切除糖尿病大鼠肾小球系膜细胞（MC）。用细胞计数检测转染后MC的生长抑制率，用RT－PCR和ELISA方法检测TGF－β1 mRNA和蛋白的表达水平，并检测IV型胶原mRNA表达水平的变化。结果 TGF－β1反义寡核苷酸可抑制MC的存活，TGF－β1 mRNA及蛋白的表达水平下降，IV型胶原mRNA的水平也下降。结论 TGF－β1反义寡核苷酸不仅抑制TGF－β1 mRNA及蛋白的表达，而且还可抑制细胞外基质IV型胶原mRNA的表达，抑制MC的肥大，从而抑制单侧肾切除糖尿病大鼠系膜的增生。     

小鼠肾组织中SnoN蛋白表达水平与肾小管上皮细胞转分化的关系

目的：通过观察正常和单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠肾组织中转录共抑制因子SnoN表达水平的变化，探讨SnoN在肾小管上皮细胞转分化的作用。方法：采用结扎雄性CD-1小鼠左侧输尿管的方法建立UUO动物模型。设假手术小鼠为正常对照组。应用酶联免疫吸附（ELISA）法检测肾组织中转化生长因子β1（TGF-β1）水平，酸水解一比色法测定肾组织内胶原的含量。借助蛋白印迹技术，检测肾组织中SnoN和α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）蛋白的变化。以人肾小管上皮细胞（HKC）为体外研究对象，观察TGF-β1对其SnoN表达的直接作用。结果：与假手术组小鼠相比，UUO小鼠术后3天肾组织中SnoN蛋白的表达量即明显降低，术后7天时进一步降为对照组的16％。同时，UUO小鼠肾组织TGF-β1水平、α-SMA蛋白表达量，及其胶原的含量亦随着病程的增加而显著增加。相关分析结果表明，SnoN的减少程度与肾组织内TGF-β1水平、α-SMA的表达和胶原的聚积密切相关（P〈0．01）。此外，HKC细胞培养实验结果表明，TGF-β1减低该细胞表达SnoN蛋白的作用先于α-SMA蛋白的变化。结论：肾脏SnoN表达水平与肾纤维化密切相关，可能通过干扰TGF-β1所致的小管上皮细胞转分化作用影响肾组织的纤维化过程。