屋尘螨过敏原Der p1研究进展

屋尘螨（dermatophagoides，house dust mite，HDM）是国内最重要的室内过敏原之一，含有多种与哮喘有关的抗原成分，其中Der p1是主要抗原之一，在哮喘的发病机制中起着重要的作用，也是研究最多的屋尘螨抗原之一，本文就Der p1的研究现状进行回顾。     

屋尘螨Der p7基因的克隆表达、纯化及过敏原性鉴定

目的探讨屋尘螨Der p7基因的克隆表达、纯化及过敏原性分析。方法逆转录聚合酶链式反应(RTPCR)扩增屋尘螨Der p7基因,经酶切、连接后转化大肠杆菌,挑取阳性单克隆菌落,扩增培养后测序鉴定正确后大量表达;采用亲和层析法纯化表达产物,免疫印迹(Western blot)法鉴定其过敏原性;生物信息学方法分析其基因的同源性。结果 RT-PCR显示Der p7基因片段大小约700 bp;大量表达后进行的SDS-PAGE电泳分析显示,Der p7蛋白表达于沉淀物中,以包涵体蛋白为主,分子质量约39 kDa。Western blot显示该重组基因所表达的蛋白可与尘螨过敏患者的血清起反应,表明该重组蛋白具有过敏原性。生物信息学分析显示克隆的Der p7基因与Der f7基因的同源性约79.14%。结论本实验成功获得大量表达及纯化后具有过敏原性的Der p7蛋白,对临床上完善对过敏性疾病的检测与治疗具有积极的意义。     

屋尘螨变应原Der p9基因的克隆表达、纯化及反应原性鉴定

目的克隆表达及纯化屋尘螨第九组变应原(Der p9)蛋白,并鉴定其反应原性。方法提取屋尘螨总RNA,通过RT-PCR克隆Der P9基因,并连接到pET-32a表达载体上,得到的重组质粒pET-32a-Der p9转化至E.Coli BL21(DE3),用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过镍离子亲和层析纯化目的蛋白;通过Western blotting等方法检测Der p9重组蛋白的反应原性。结果 Der p9基因片段大小约为850 bp,其基因片段与Gen Bank公布的Der p9基因(登录号为AAP57077.1)同源性为81.94%;重组Der p9在BL21(DE3)中可高效表达,分子质量约为47 k Da,表达后的重组蛋白主要以包涵体的形式存在。Der p9重组蛋白与屋尘螨过敏患者血清呈阳性反应,具有反应原性。结论成功克隆并表达出Der p9,通过纯化获得较强反应原性的Der p9重组蛋白,为尘螨过敏性疾病诊断及免疫治疗奠定理论基础。     

表达屋尘螨I类变应原Der p1的基因工程菌的发酵条件探讨

目的：探讨发酵条件对大肠杆菌工程菌表达重组屋尘螨I类变应原（Der p1)的影响。方法：应用摇瓶发酵试验观察不同诱导时间和不同诱导时机对Der p1表达量的影响。结果：（1）Der p 1基因在E.coliBL21（pBVDP8)菌密度A600nm0.6左右时，42℃最佳诱导时间为4h.(2)工程菌E.coli BL21(pBVDP8)在30℃培养至A600nm为0．5－0．7时，42℃诱导4hDerp 1表达量最高，结论：确定了最适诱导时间和诱导时机，初步形成了一套高表达Der p 1的发酵技术。     

屋尘螨变应原Der p 1基因原核表达产物的纯化及特性鉴定

目的建立屋尘螨主要变应原Derp1蛋白原核表达产物的纯化方法,获得理想的表达产物并鉴定其免疫原性。方法大量诱导表达含pET24a-Derp1质粒的BL21工程菌,表达产物以重组蛋白包涵体的形式存在,包涵体经洗涤与溶解后,使用结合6组氨酸的镍柱进行亲和层析纯化蛋白质,用稀释复性方法进行重组蛋白的复性,再用屋尘螨过敏性哮喘患者阳性血清经Dot-ELISA方法分析Derp1纯化蛋白的抗原活性。结果分步洗涤可有效去除重组蛋白包涵体沉淀中混杂的多数杂蛋白成分,亲和层析分离可获得高纯度重组变应原Derp1蛋白。Dot-ELISA法检测结果表明经复性并纯化的Derp1蛋白呈强阳性反应,最佳血清稀释度为1∶64,而重组蛋白与正常人血清呈阴性反应。结论纯化后的融合蛋白Derp1具有较高的纯度及较强的免疫活性,可望作为有效的屋尘螨变应原诊断试剂和疫苗的候选分子。     

真核表达质粒pVAX1-Der p 1的构建及在真核细胞中的表达

目的:构建真核表达质粒pVAX1-Der p 1,检测质粒编码的重组蛋白在真核细胞293T中的表达,为进一步的动物实验打下基础。方法:分离屋尘螨总RNA,根据GenBank已公布的Der p 1核酸序列设计引物,PCR扩增Der p 1编码基因,以其全长为目的基因,定向克隆至真核表达载体pVAX1,将其转化大肠杆菌DH...     

表达屋尘螨Ⅰ类变应原Der p 1的基因工程菌的发酵条件探讨

目的 探讨发酵条件对大肠杆菌工程菌表达重组屋尘螨Ⅰ类变应原(Der p 1)的影响.方法 应用摇瓶发酵试验观察不同诱导时间和不同诱导时机对Der p 1表达量的影响.结果 (1)Der p 1基因在E.coli BL21(pBVDP8)菌密度A600 nm0.6左右时,42℃最佳诱导时间为4 h.(2)工程菌E.coli BL21(pBVDP8)在30℃培养至A600 nm为0.5～0.7时,42℃诱导4 h Der p 1表达量最高.结论 确定了最适诱导时间和诱导时机,初步形成了一套高表达Der p 1的发酵技术.     

麻风杆菌α2抗原基因的克隆及表达研究

目的用现代分子生物学技术即基因工程手段制备麻风杆菌抗原。方法用原位斑点杂交法筛选阳性克隆,并对其中一株约３０００ｂｐ的ＤＮＡ片段进行酶谱和ＤＮＡ序列分析。结果从本实验组制备的麻风杆菌基因文库中筛选出２株含α２抗原的基因片段,并建立了α２抗原基因在大肠杆菌中的表达体系,在ＸＬＩ－Ｂｌｕｅ菌株中大量表达出易于提纯的α２重组融合蛋白抗原,经麦芽糖亲和色谱柱提纯后,每２００ｍｌ转化宿主菌培养液可获得１０ｍｇ重组融合蛋白。结论α２重组融合蛋白抗原的制备对于探讨麻风病的发病机制、建立麻风病和其它抗酸杆菌疾病（如结核病等）的高度特异性血清学诊断方法都有意义。     

尘螨主要变应原Der f1融合基因真核表达载体的构建

目的:构建尘螨主要变应原Der f1融合基因真核表达载体,为进一步转染真核细胞表达融合蛋白奠定基础.方法:根据Genebank中Der f1基因的核酸序列(AB034946),设计引物,采用PCR法,从保存的JM109工程菌中扩增Der f1编码基因,将其连接到小鼠IL-12(mIL-12)基因3′端,组成融合基因mI...     

Der p2基因真核表达载体的构建及其在小鼠树突状细胞中表达

目的构建Der p2真核表达载体,并证明能在小鼠骨髓来源的树突状细胞（DC）中表达.方法采用分子生物学方法,将原核表达质粒plambd Der p2携带的Der p2全长cDNA切下,重组到真核表达质粒pCI-neo中,然后在脂质体介导下,将重组质粒转染到小鼠骨髓来源的DC,并用RT-PCR、Western Blot检测Der p2 mRNA和蛋白表达.结果测序证实构建的重组质粒中携带了Der p2的全长cDNA序列,且与Gene Bank序列完全一致;重组质粒转染小鼠DC后,能产生Der p2 mRNA和蛋白.结论成功构建重组Der p2基因真核表达载体,其转染DC后,能有效地表达于DC中.     

人黑色素瘤抗原MAGE-A10的基因克隆及原核表达

目的:扩增和克隆人黑色素瘤抗原MAGE-A10(melanoma antigen A10)cDNA,构建原核表达载体并在大肠杆菌表达. 方法:从人黑色素瘤细胞系LiBr中提取总RNA,用RT-PCR从中扩增出MAGE-A10 cDNA,插入载体pMD18-T中. 测序正确后,克隆至原核表达载体pGEX-4T-3中,构建重组表达载体pGEX-4T-3-MAGE-A10,转化大肠杆菌BL21株进行表达. 经IPTG诱导表达,谷胱甘肽亲和层析获得重组目的蛋白. 结果:成功获得MAGE-A10编码基因并构建原核表达载体,测序结果与GenBank收录序列相一致. 可以获得部分可溶性的原核重组蛋白,经亲和层析和分析,证实融合蛋白占总量的58.9%. SDS-PAGE分析其相对分子质量(Mr)为67 000,Western blot证实为目的蛋白. 结论:成功获得MAGE-A10 cDNA,构建得原核表达载体并获得高效表达. 本研究为制备MAGE-A10 mAb及研究MAGE-A10可能参与肿瘤发生发展的机制奠定了基础.     

肝细胞癌MAGE-A9基因的克隆、表达及特性鉴定

目的：扩增和克隆人黑色素瘤抗原MAGE—A9(melanoma antigen A9)cDNA，构建原核表达载体，制备抗MAGE—A9单抗．观察其在肝细胞癌中的表达。方法：从人肝癌组织提取总RNA，用RT—PCR从中扩增出MAGE—A9 cDNA，插入载体pMD18-T中．测序正确后，构建重组表达载体pBAD/gⅢ-MAGE—A9,转化大肠杆菌TOP10株进行表达。重组蛋白经L-Arabinose诱导表达纯化后．制备抗MAGE—A9单抗．免疫组化检测MAGE—A9在肝细胞癌中的表达和定位。结果：获得MAGE-A9cDNA，测序结果与GenBank一致。成功构建表达载体，表达可溶重组蛋白，SDS—PAGE分析其相对分子质量为35kD。获得抗MAGE—A9单抗，MAGE-A9在肝细胞癌中的阳性表达率为21％(8／39)，主要表达于胞浆，未见肿瘤异质性，统计学分析MAGE—A9的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小和分化程度没有相关性。结论：有相当部分肝癌患者的肿瘤表达MAGE—A9抗原，且其表达与患者年龄、性别、肿瘤大小和分化程度没有相关性．MAGE-A9可能成为肝癌特异性免疫治疗的靶点。     

鼠疫耶尔森氏菌 YopD 抗原基因在大肠杆菌中的克隆表达

目的：利用 DNA 重组技术,在大肠杆菌中获得融合表达的鼠疫耶尔森氏菌 YopD 抗原基因。方法根据查找文献及基因比对选取了鼠疫菌重要功能蛋白-YopD 蛋白。利用分子克隆技术克隆后,在原核系统中进行表达。根据云南玉龙菌株（D106004）全基因组序列设计引物,PCR 扩增目的基因片段。采用 pET-32a（＋）作为表达载体,通过双酶切和连接反应,将目的基因片段定向插入载体中,构建重组表达质粒。IPTG 诱导,使重组质粒在其宿主菌 E ．coli BL21（DE3）中表达。结果在大肠杆菌中成功获得了融合表达蛋白,即重组 YopD 蛋白。结论以质粒 pET-32a（＋）作为表达载体,鼠疫菌重要功能蛋白 YopD 能够在大肠杆菌 E ．coli BL21（DE3）中稳定高效地表达,为鼠疫潜在诊断靶点及新型疫苗选择的可能性奠定了基础。     

屋尘螨提取液在BALB/c小鼠气道炎症中的作用

目的比较3种屋尘螨提取液(house dust mite extract,HDM)对BALB/c小鼠气道炎症表型的影响,并分析其可能的原因。方法 BALB/c小鼠于实验第0、7、14、21、28、35天进行PBS液或HDM液(100μg/50μl PBS)滴鼻。采用头体积描记法测量小鼠的气道反应性;对支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BAL)进行细胞计数和分类;ELISA法检测BAL中CXCL1、CXCL2、CCL11(eotaxin)、IL-5、IFN-γ、IL-10和IL-17的含量及血清总Ig E;对肺组织PAS染色后进行病理学观察。结果 HDM1诱导了以中性粒细胞和嗜酸性粒细胞为主的混合型气道炎症;HDM2诱导的小鼠气道炎症以中性粒细胞升高为主;HDM3仅诱导了微弱的小鼠气道炎症反应,未见中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的显著增加。3种HDM均引起BAL中CXCL1蛋白水平的升高,并伴随着高脚杯细胞增生等病理组织学改变。结论不同来源的HDM可能与不同类型的小鼠气道炎症相关。     

沙眼衣原体ompA基因克隆及其在真核细胞中的表达

目的克隆D型沙眼衣原体(Ct)ompA基因,构建真核表达重组质粒,转染真核细胞,为核酸疫苗的研制作准备.方法用PCR技术从D型Ct基因组DNA中扩增ompA基因片段,重组入pUCm-T克隆载体.将pUCm-T/ompA中的ompA外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体,进行序列分析和酶切鉴定后,运用脂质体将重组体pcDNA3.1/ompA转染HeLa细胞,免疫组化法观察目的的基因的表达.结果从D型Ct基因组DNA中扩增出特异的ompA基因片段;序列测定证实与GenBank登陆的D型Ct一致;重组质粒pcDNA3.1/ompA在HeLa中获得表达.结论Ct ompA基因能够在体外真核细胞表达,为进一步研究Ct致病机制及DNA疫苗的研究提供理论依据.     

查菲埃立克体120 000表面抗原蛋白基因的克隆与表达

目的 构建查菲埃立克特异性表面抗原P120基因的原核表达质粒,并使该基因在E.coli中高效表达。方法 依据查菲埃立克体P120基因序列设计一对特异性引物,用PCR从查菲埃立体克体的基因中扩增含有编码P120原决定簇的基因片段,而后将PCR产物用T载体克隆。用酶将PCR产物从T载体切下,将它定向插入原核表达质粒PET11C构建PET11C／p120基因。PET12C／p120重组质粒转化的E．coli在TPTG的诱导下产生一分子量为41000的天然蛋白,它的产量占细菌蛋白总量的28％,用免疫印迹分析证明它能特异地与查菲埃立体克感染病人血清反应。结论 查菲埃立克体特异性的P120抗原在原核表达系统被高效表达,该抗原的研制成功为制备人单核细胞埃立克体病诊断抗原和疫苗奠定了基础。     

大鼠RGS4基因的克隆及在原核中的表达

目的构建pGEX4T-1-RGS4载体,并检测融合蛋白GST-RSG4在原核中的表达水平。方法采用RT-PCR方法,将克隆SD大鼠G蛋白信号转导调节因子(regulator of G protein signaling4,RGS4)基因全长编码区的cDNA连接到原核表达载体pGEX4T-1中,IPTG诱导原核表达,通过Western blot检测融合蛋白GST-RSG4的表达水平。结果成功构建了pGEX4T-1-RGS4载体;经IPTG的诱导,RGS4可与GST以融合蛋白的形式高效表达。pGEX4T-1-RGS4在原核内表达产物相对分子质量约为50×103,与预期融合蛋白大小一致。结论构建的重组质粒能够在大肠杆菌中高效表达。     

尘螨特异性免疫治疗对哮喘患儿的干预及对肺功能的影响

目的探讨尘螨特异性免疫治疗(SIT)与哮喘患儿IgE的相关性及对肺功能的影响。方法将56例哮喘轻-中度发作期儿童,随机分为A组35例(加用SIT治疗),B组21例(对照组)。在SIT前和SIT后6个月检测过敏原皮试、血浆IgE、肺功能,并进行临床疗效评价。结果 A组SIT后血浆总IgE、尘螨特异性IgE下降,过敏原复查有意义;临床疗效比较,A组有效率93.86%,B组为82%;两组肺通气功能均明显改善。结论 SIT可减少IgE的合成;SIT可明显改善肺通气功能,结合尘螨特异性IgE下降、临床疗效好,为哮喘用药及调整提供客观依据。     

人类TAP2基因克隆及真核表达质粒的构建

目的 克隆抗原处理相关转运体亚基TAP2基因片段并构建真核表达载体。方法 从EB病毒刺激的人B淋巴母细胞系(B-LCL)中提取总RNA,用RT-PCR从中扩增出TAP2 cDNA。将TAP2 cDNA插入表达载体pcDNA3．1／VS-His-TOPO中,构建重组表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO-TAP2,并进行测序分析。结果 经RT-PCR和测序鉴定,成功地克隆了人TAP2 cDNA。结论 获得了人TAP2 cDNA并构建了重组真核表达载体,对TAP2基因产物在体外表达、进一步研究TAP2分子在肿瘤基因治疗方面的作用具有重要的意义。     

尘螨特异性免疫治疗前后哮喘患儿过敏原变化趋势

目的:探讨经标准化尘螨特异性免疫治疗(Specific immunotherapy,SIT)前后,哮喘患儿吸入性过敏原的变化趋势.方法:收集2005年6月～2007年3月140例在重庆医科大学附属儿童医院进行标准化尘螨特异性免疫治疗哮喘患儿的资料,对其治疗前后分别做尘螨、花粉、霉菌,蟑螂等13种常见的吸入性过敏原的皮肤点刺试验,并对其变化进行统计学分析.结果:皮肤点刺试验显示哮喘患儿中3种螨同时为阳性72.86%(103/140),螨合并其他过敏原阳性62.85%(88/140);93例患儿经治疗半年后,除猫毛和花粉外,3种螨虫、狗毛、蟑螂、霉菌的过敏原直径较治疗前有显著下降(尸l<0.000 1);78例患儿经治疗1年后,各过敏原的直径均有显著下降(蟑螂和花粉P<0.005,余P<0.000 1);尘螨合并其他过敏原阳性的患儿经半年或1年治疗后,其他过敏原全部转阴率均>70%;标准化尘螨特异性免疫治疗半年和1年后未发生新发过敏原的比例分别为84.95%(79/93)和87.18%(68/78).结论:标准化尘螨特异性免疫治疗不仅对尘螨而且对其他过敏原过敏的患儿均有显著疗效,其疗效与时间剂量呈相关性,提示通过单一脱敏治疗可以达到对其他过敏原的理想治疗;同时标准化特异性免疫治疗可能对新发过敏原有一定的阻止作用.