药用植物胡黄连ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的 优选胡黄连稳定的ISSR-RCR反应体系.方法 采用4因素(dNTRs、Mg~(2+)、Taq酶、引物)4水平的正交实验和单因子梯度优化相结合的方法.结果 适于胡黄连的25μl ISSR-PCR反应体系中各因素最佳浓度分别为10×buffer 2.5 μl,dNTPs 150μmol/L,Mg~(2+)1.5mmol/L,Taq酶1U,引物0.5 μmol/L,DNA 20 ng或10×buffer 2.5 μl,dNTPs 150μmol/L,Mg~(2+)2 mmol/L,Taq酶0.5 U,引物0.4 μmol/L,DNA 20 ng.结论 对于胡黄连ISSR-RCR试验,一次正交实验完全可以建立起满足要求的PCR体系.     

综合评分法优化柴胡RAPD-PCR反应体系

目的采用综合评分法优化柴胡RAPD-PCR的反应体系.方法以柴胡基因组DNA为模板,应用L16(4 5)正交表.研究了Taq酶、Mg2 、随机引物、dNTPs和模板DNA 5种RAPD反应组分浓度变化对扩增结果的影响.结果优化反应体系为25 μL反应体系中含有1 × buffer、Taq 酶1.5 U、Mg2 2.5 mmol/L、引物0.4 μmol/L、dNTPs 0.15 mmol/L、模板DNA50ng.结论综合评分法能客观高效的优化柴胡RAPD反应体系.     

利用综合评分法优化柴胡ISSR-PCR反应体系

目的研究柴胡ISSR-PCR的最佳反应体系。方法应用综合评分法,对Taq酶、Mg2+、引物、总DNA和dNTPs 5种ISSR反应成分进行优选。结果优化反应体系为:25μL反应体系中含有1×buffer、Taq酶1.0 U、Mg2+2.5 mmol.L-1、引物0.4μmol.L-1、DNA 75 ng、dNTPs 0.3 mmol.L-1。结论综合评分法优化柴胡ISSR反应体系可行,为下一步试验提供了可靠参数。     

对叶百部基因组DNA提取及ISSR-PCR体系优化

目的建立适合对叶百部基因组DNA提取方法及ISSR-PCR最佳反应体系。方法通过改良的CTAB法提取对叶百部基因组DNA,并采用正交试验设计方法对影响ISSR-PCR反应体系的5种因素(d NTP、模板DNA、引物、Mg2+和Taq聚合酶)4个水平进行正交试验,优化ISSR-PCR反应体系。结果确立了对叶百部最佳反应体系,即在20μl的总反应体积中含有10×PCR buffer 2μl,d NTP 175μmol/L,Mg2+1.7mmol/L,引物0.6μmol/L,Taq酶1.0U,模板DNA 15ng。结论建立并优化了对叶百部基因组DNA提取方法及ISSR-PCR反应体系。     

阳春砂ISSR-PCR反应体系的建立和优化

目的 建立起适合阳春砂的ISSR-PCR反应体系.方法 综合运用单因素实验和L9(34)正交实验两种方法,对DNA模板、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶等因素进行优化,以及采用温度梯度筛选引物的退火温度.结果 最终获得的阳春砂的最优ISSR-PCR体系为:总体积为20 μl,其中包括10×Ex Taq Buffer(含15 mmol·L-1 Mg2+)2 μl,25 ng DNA模板,0.50 μmol·L-1引物,0.75 mmol·L-1 dNTPs和1.0 U Ex Taq酶.通过温度梯度筛选出引物UBC808的最佳退火温度为52.0 ℃.结论 这一优化体系为阳春砂的ISSR分析奠定了基础.     

何首乌及其混伪品序列相关扩增多态性反应体系的优化

目的 建立何首乌及其混伪品序列相关扩增多态性(SRAP)分子鉴定技术体系.方法 正交优化影响SRAP-PCR的Mg2+、dNTPs、引物浓度与Taq聚合酶量.结果 20 μl反应体系的优化组合为:Mg2+ 2.5 mmol/L,dNTPs 0.4 mmol/L,引物0.35μmol/L,Taq酶1U.结论 Mg2+、dNTPs、引物浓度与Taq聚合酶量对不同物种SRAP-PCR结果有不同程度影响,利用SRAP分子鉴定前应对此4因素进行优化.     

正交设计优化地枫皮ISSR-PCR反应体系

目的 建立稳定性高、重现性好,适合地枫皮遗传差异分析的ISSR-PCR反应体系.方法 利用正交试验设计,对地枫皮ISSR-PCR反应的5个因素(Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA浓度)进行优化,PCR结果用SPSS统计软件分析,在此基础上对PCR反应过程中的退火温度和循环次数进行梯度检测.结果 大部分因素的不同水平对PCR反应有显著影响,其中Taq酶影响最大;地枫皮ISSR-PCR最佳反应体系(20 μL)为:Mg2+ 1.60 mmol/L、dNTP 0.22 mmol/L、引物0.90 μmol/L、Taq酶0.50 U、模板DNA 70.00 ng;最佳退火温度和循环次数分别为51.8℃和40次;从62条引物中筛选出13条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物.结论 建立的地枫皮ISSR-PCR反应体系,经过16份地枫皮样品检验,证明该体系稳定可靠,可用于地枫皮遗传差异分析.     

拳卷地钱基因组DNA提取及ISSR-PCR扩增体系优化

目的建立一种拳卷地钱基因组DNA的提取方法;对影响拳卷地钱ISSR-PCR反应的各因素进行优化,建立稳定的反应体系。方法采用改进的CTAB法提取拳卷地钱基因组DNA;以Taq酶、Mg2+、dNTP和引物4因素3水平的正交设计对拳卷地钱ISSR-PCR反应体系进行优化。结果采用改进的CTAB法提取的拳卷地钱基因组DNA质量高,且适用于ISSR-PCR扩增;获得拳卷地钱最佳反应体系(20μl)为:Taq酶0.5 U,Mg2+2.0 mmol/L,dNTP 250μmol/L,模板DNA 50ng,引物0.6μmol/L。结论建立并优化了拳卷地钱总DNA提取方法及ISSR-PCR反应体系。     

水蛭ISSR-PCR反应体系的建立及优化

目的 建立并优化水蛭ISSR-PCR反应体系及扩增程序,为水蛭进行遗传多样性研究提供依据.方法 使用引物ISSR825,采用正交优化方法对影响PCR反应的Mg2+、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA进行了体系优化,同时对引物的最佳退火温度进行了选择.结果 在25 μL总体积中,其中包括10×PCR缓冲液2.5 μL、Mg2+ 2.0 mmol/L、dNTP0.25 mmol/L、引物0.8 μmol/L、Taq DNA聚合酶2.5 U、模板DNA 2.0 ng/μL,最佳退火温度为49.7℃.结论 所建立的最佳ISSR-PCR反应体系稳定可靠,可用于水蛭遗传多样性评价、不同种源鉴定及亲缘关系分析.     

桔梗ISSR反应体系的建立和优化

目的建立并优化桔梗ISSR-PCR反应体系和扩增程序。方法采用正交试验和单因子试验,对ISSR反应体系主要因子(dNTPs、Taq酶、引物、Mg2+、模板)进行筛选。之后通过单因子试验,进行引物退火温度、循环次数的筛选。结果桔梗ISSR-PCR的最佳反应体系(20μl)为:dNTPs 0.25mmol/L、Taq酶1.0U、引物0.30μmol/L、Mg2+1.50mmol/L、模板DNA10ng。利用此反应体系从54条引物中筛选出12条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,确定了引物UBC853[序列为(TC)8RC]的最佳退火温度为55℃和循环次数为45次。结论建立的桔梗ISSR-PCR反应体系,经过白、紫花桔梗共20份样品检验,证明该体系具有稳定性和可靠性,可用于桔梗遗传多样性研究。     

正交设计优化翼梗五味子ISSR-PCR反应体系

目的对影响翼梗五味子ISSR-PCR扩增反应的各因素进行优化,建立稳定的反应体系。方法基于正交极差分析方法,以Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP和引物5因素4水平的正交试验对翼梗五味子ISSR-PCR反应体系进行优化。结果翼梗五味子ISSR-PCR的最佳反应体系(20μL)为:Taq酶1.00 U、Mg2+1.50 mmol/L、模板DNA 40.00 ng、dNTP 0.25mmol/L、引物0.50μmol/L。筛选出12条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并确定了每个引物的最佳退火温度。结论所建立的翼梗五味子ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、重复性好等优点,为翼梗五味子的分子水平研究提供实验依据。     

夏枯草ISSR分子标记技术的建立与体系优化

目的 建立并优化夏枯草ISSR-PCR反应体系和扩增程序.为探讨夏枯草种质问遗传多样性奠定基础.方法 采用单因子试验和正交设计方法,研究.Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA、退火温度及循环次数对PCR扩增的影响.结果 夏枯草ISSR-PCR的最佳反应体系为:在20 μL的反应体系中含模板DNA 30ng,Mg2+ 2.2 mmol/L、dNTP 175 μmol/L、引物0.75μmol/L、Taq DNA聚合酶1.0 U.在此基础上,从92条引物中筛选出18条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物.并通过梯度PCR试验.确定引物最佳退火温度.结论 采用单因子试验和正交设计方法可以快速建立ISSR-PCR反应体系,经过24份夏枯草种质检验,证明该体系稳定可靠,可用于夏枯草遗传分析.     

金樱子ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的为获得稳定的金樱子ISSR反应体系。方法采用L16(45)正交试验设计,以金樱子DNA为模板,研究PCR反应体系中5种主要成分,即Mg2+、d NTPs、Tag酶、引物及模板对金樱子ISSR-PCR扩增结果的影响。结果金樱子ISSR在20μl的最佳反应体系中,Mg2+浓度为0.5mmol/L,Tag酶为0.9 U/μl,d NTPs为0.3 mmol/L,引物为0.2(100μmol/L),模板DNA用量为2ng/μl。结论实验结果可用于金樱子ISSR的构建。     

正交设计法优化川木通RAPD-PCR体系研究

目的 确定川木通RAPD-PCR反应各因素的最佳水平,最终确定RAPD-PCR反应的最佳反应条件.方法 采用正交设计L_(16)(4~5)在4个水平上对川木通类植物进行RAPD-PCR进行试验.两次结果分别用统计软件MINITAB进行分析.结果 最终确定RAPD-PCR反应的最佳反应条件为:20 μl体系,其中含1×PCR buffer,2.5 mmol/L MgCl_2,0.15 mmol/L dNTPs,1.0 U Taq酶,0.5 μmol/L 10-mer引物,50 ng模板DNA,最终确定退火温度36℃.同时发现Taq酶对反应体系影响最大.结论 建立了可靠的反应体系,为该类药材的分子鉴定奠定了基础.     

濒危药用植物三叶青ISSR分子标记的建立

目的对三叶青的简单重复序列-聚合酶链式反应(ISSR-PCR)体系和扩增程序进行优化,并将其应用于野生三叶青种质资源的遗传分子标记。方法采用单因素试验,对三叶青ISSR-PCR反应条件中的Mg2+、d NTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶浓度和退火温度等因素进行筛选,之后结合正交试验来选择多态性高、重复性好的ISSR引物。结果建立了ISSR-PCR最佳反应体系,为25μL反应体系中含有2.5 mmol/L Mg2+、0.2μmol/L引物、0.25mmol/L d NTP、50 ng DNA模板、0.5U Taq DNA聚合酶,并利用U810等16条引物,初步构建了15份三叶青种质资源的ISSR指纹图谱,平均多态条带百分率达57.0%。结论该反应体系的稳定性和多态性良好,可满足对三叶青野生资源的遗传变异水平和结构分析的研究考察。     

正交设计优选昧连简单序列重复间扩增多太性反应体系的研究

目的 优化味连简单序列重复间扩增多太性(Coptis chinensis Franch.ISSR)反应体系.方法 利用正交实验设计,从Mg2 ,dNTP.引物,BSA这4种因素3个水平进行优化.结果 确立了适合黄连ISSR分析的反应体系,即在25 μl反应体系中,内含1×PCR buffer,1.5 mmol/L Mg2 ,200 μmol/L dNTP,0.4 μmol/L引物,40 ng模板,1U Taq DNA聚合酶,BSA 1 μg/μl.结论 利用此优化反应体系能得到清晰、稳定的图谱.     

何首乌ISSR—PCR反应体系的建立与优化

目的 建立和优化ISSR-PCR反应体系.方法 通过单因素实验研究ISSR反应体系中主要成分(模板、Taq DNA聚合酶、Mg2 、引物、dNTPs)以及退火温度对扩增结果的影响.结果 建立了适合何首乌ISSR分析的反应体系和扩增程序,即在25μl反应体系中,内含1×Taq酶配套缓冲液、100ng模板、1.5 U Taq DNA聚合酶、1.5 mmol/L Mg2 、0.6μmol/L引物、0.2 mmol/L dNTPs.扩增程序为94℃预变性5 min;然后是94℃变性45s,(据不同引物的退火温度)复性1 min,72℃延伸1.5 min,共35个循环;72℃延伸7 min,4℃保存.结论 这一优化体系的建立为今后利用ISSR标记技术进行何首乌鉴定及种质资源遗传多样性分析提供了一个标准化程序.     

金钗石斛相关序列扩增多态性反应体系的正交优化研究

目的建立金钗石斛Dendrobiumnobile相关序列扩增多态性(SRAP)反应体系,为金钗石斛分子生物学研究提供技术支持。方法运用L25(56)正交设计对影响金钗石斛SRAP反应的5个因素:模板DNA、Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物在5个水平上进行优化试验,对PCR结果进行极差分析。结果金钗石斛SRAP反应最佳体系为:25μL PCR体系中含有20 ng模板DNA,2.0 mmol/L Mg2+,0.2 mmol/L dNTPs,1 UTaq酶,0.6μmol/L引物。各因素对SRAP反应的影响依次为:Taq酶Mg2+dNTPs模板DNA引物。结论所建立的金钗石斛SRAP反应体系具有标记位点清晰、多态性丰富、稳定性好等特点,可用于金钗石斛分子生物学的研究。     

羌活和宽叶羌活简单重复序列区间扩增反应体系的正交优化

目的通过探讨羌活和宽叶羌活ISSR实验中各种因素的影响,以建立羌活和宽叶羌活的简单重复序列区间扩增(ISSR-PCR)最佳反应体系。方法利用正交实验设计L9(34)对羌活和宽叶羌活ISSR-PCR反应体系的4因素(Mg2 ,dNTP,引物,Taq酶)在3个水平上进行优化实验,PCR结果用SPSS13.0统计软件分析,并设置梯度PCR进行引物退火温度筛选。结果在20μl ISSR-PCR反应体系中,各组分的最适浓度为:2.0 mmol/L Mg2 ,250μmol/L dNTPs,0.50μmol/L引物,1UTaq酶,40 ng DNA模板;模板DNA40~90 ng,不同引物有不同的最佳退火温度,范围在48~52℃。结论该优化体系的建立为进一步进行羌活和宽叶羌活种群间遗传多样性研究提供了参考。     

蒲公英ISSR-PCR反应体系及扩增程序的建立与优化

目的:优化蒲公英ISSR-PCR反应体系及扩增程序;筛选适合的引物,并确定最佳退火温度.方法:采用CTAB法提取蒲公英叶片的DNA,利用正交试验设计,从Taq酶MIX、模板DNA、引物3种因素2个水平,对蒲公英ISSR-PCR反应体系进行考察;采用单因素实验对其扩增程序进行优化.结果:确立了适合于蒲公英的最佳ISSR-PCR反应方法,即在25 μL反应体系中,内含Taq酶MIX 15 μL(1.25 UTaq DNA聚合酶,1.8 mmol·L-1 Mg2+,dNTPs各0.24 mmol·L-1),0.3 μmol·L-1引物,5 ng模板.在此基础上,从50条引物中筛选出16条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度.结论:采用单因子试验和正交设计方法可以快速建立ISSR-PCR反应体系,经过验证,证明该体系稳定可靠,可用于蒲公英遗传分析.