药用植物胡黄连ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的 优选胡黄连稳定的ISSR-RCR反应体系.方法 采用4因素(dNTRs、Mg~(2+)、Taq酶、引物)4水平的正交实验和单因子梯度优化相结合的方法.结果 适于胡黄连的25μl ISSR-PCR反应体系中各因素最佳浓度分别为10×buffer 2.5 μl,dNTPs 150μmol/L,Mg~(2+)1.5mmol/L,Taq酶1U,引物0.5 μmol/L,DNA 20 ng或10×buffer 2.5 μl,dNTPs 150μmol/L,Mg~(2+)2 mmol/L,Taq酶0.5 U,引物0.4 μmol/L,DNA 20 ng.结论 对于胡黄连ISSR-RCR试验,一次正交实验完全可以建立起满足要求的PCR体系.     

阳春砂ISSR-PCR反应体系的建立和优化

目的 建立起适合阳春砂的ISSR-PCR反应体系.方法 综合运用单因素实验和L9(34)正交实验两种方法,对DNA模板、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶等因素进行优化,以及采用温度梯度筛选引物的退火温度.结果 最终获得的阳春砂的最优ISSR-PCR体系为:总体积为20 μl,其中包括10×Ex Taq Buffer(含15 mmol·L-1 Mg2+)2 μl,25 ng DNA模板,0.50 μmol·L-1引物,0.75 mmol·L-1 dNTPs和1.0 U Ex Taq酶.通过温度梯度筛选出引物UBC808的最佳退火温度为52.0 ℃.结论 这一优化体系为阳春砂的ISSR分析奠定了基础.     

水蛭ISSR-PCR反应体系的建立及优化

目的 建立并优化水蛭ISSR-PCR反应体系及扩增程序,为水蛭进行遗传多样性研究提供依据.方法 使用引物ISSR825,采用正交优化方法对影响PCR反应的Mg2+、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA进行了体系优化,同时对引物的最佳退火温度进行了选择.结果 在25 μL总体积中,其中包括10×PCR缓冲液2.5 μL、Mg2+ 2.0 mmol/L、dNTP0.25 mmol/L、引物0.8 μmol/L、Taq DNA聚合酶2.5 U、模板DNA 2.0 ng/μL,最佳退火温度为49.7℃.结论 所建立的最佳ISSR-PCR反应体系稳定可靠,可用于水蛭遗传多样性评价、不同种源鉴定及亲缘关系分析.     

蒲公英ISSR-PCR反应体系及扩增程序的建立与优化

目的:优化蒲公英ISSR-PCR反应体系及扩增程序;筛选适合的引物,并确定最佳退火温度.方法:采用CTAB法提取蒲公英叶片的DNA,利用正交试验设计,从Taq酶MIX、模板DNA、引物3种因素2个水平,对蒲公英ISSR-PCR反应体系进行考察;采用单因素实验对其扩增程序进行优化.结果:确立了适合于蒲公英的最佳ISSR-PCR反应方法,即在25 μL反应体系中,内含Taq酶MIX 15 μL(1.25 UTaq DNA聚合酶,1.8 mmol·L-1 Mg2+,dNTPs各0.24 mmol·L-1),0.3 μmol·L-1引物,5 ng模板.在此基础上,从50条引物中筛选出16条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度.结论:采用单因子试验和正交设计方法可以快速建立ISSR-PCR反应体系,经过验证,证明该体系稳定可靠,可用于蒲公英遗传分析.     

瓜蒌ISSR-PCR最佳反应体系的研究

为了得到适合研究瓜蒌农家品种的ISSR-PCR反应条件,本研究采用单因素实验和正交实验,对瓜蒌ISSR反应体系进行了优化,确立了适合瓜蒌的ISSR反应体系:20μL反应体系,含0.5μmol/L引物、2×Master Mix(Taq DNA Polymerase)10μL、35 ng模板DNA。通过性状差异较大样品的单因素试验,确定了能够适合尽量多样品的ISSR最佳反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,退火1 min,72℃延伸45 s,35个循环;72℃延伸7min,4℃保存。不同的引物所需要的退火温度不尽一致。     

夏枯草ISSR分子标记技术的建立与体系优化

目的 建立并优化夏枯草ISSR-PCR反应体系和扩增程序.为探讨夏枯草种质问遗传多样性奠定基础.方法 采用单因子试验和正交设计方法,研究.Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA、退火温度及循环次数对PCR扩增的影响.结果 夏枯草ISSR-PCR的最佳反应体系为:在20 μL的反应体系中含模板DNA 30ng,Mg2+ 2.2 mmol/L、dNTP 175 μmol/L、引物0.75μmol/L、Taq DNA聚合酶1.0 U.在此基础上,从92条引物中筛选出18条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物.并通过梯度PCR试验.确定引物最佳退火温度.结论 采用单因子试验和正交设计方法可以快速建立ISSR-PCR反应体系,经过24份夏枯草种质检验,证明该体系稳定可靠,可用于夏枯草遗传分析.     

地龙ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的 建立和优化地龙ISSR-PCR反应体系.方法 以地龙药材为实验试材,采用异丙醇沉淀法提取了地龙总DNA模板,对地龙ISSR-PCR反应体系中各个主要影响因子进行了优化和筛选.结果 建立了标记位点清晰、稳定、重复性好,可用于地龙ISSR分析的最佳反应体系,50 μl体系中含有:1×Taq酶配套缓冲液,DNA模板50 ng,2.5U Taq DNA聚合酶,2 mmol/L MgCl2,0.8 μmol/L引物,0.2 mmol/L dNTPs.扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,(据不同引物的退火温度)复性30 s,72℃延伸1.5 min,共35个循环;72℃延伸5 min,反应结束后,4℃保存.结论 这一优化体系的建立为今后利用ISSR标记技术进行地龙类药用动物鉴定及种质资源遗传多样性分析奠定了基础.     

党参ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的：建立党参的ISSR-PCR反应体系,为今后利用ISSR标记技术进行党参鉴定及种质遗传多样性分析提供一个标准化程序。方法：采用试剂盒法提取党参基因组DNA为模板,通过单因素实验分析了ISSR-PCR反应体系中MgCl2、dNTPs、引物浓度、TaqDNA聚合酶、模板DNA用量及退火温度对ISSR-PCR扩增的影响。结果：建立了重复性好,分辨率高的ISSR-PCR反应体系,即在25μL反应体系中,含有10×PCR Buffer缓冲液2.5 μL,MgCl2 2.0 mmol·L-1,dNTPs 0.5 mmol·L-1,引物0.4 μmol·L-1,Taq DNA聚合酶1.0 U,模板DNA为30 ng;扩增程序为：94 ℃预变性5 min,然后94 ℃变性30 s,51.7 ℃退火1 min,72 ℃延伸1.5 min,共计35个循环,循环结束后在72 ℃延伸7 min,4 ℃保存。结论：建立了适用于党参的ISSR-PCR反应体系,为应用ISSR技术鉴定党参种质资源、分子标记辅助选择育种及其遗传多样性研究奠定了基础。     

栽培胡黄连与野生胡黄连的鉴别比较研究

目的：探讨栽培胡黄连代替野生胡黄连药用的可行性,为野生胡黄连的资源保护和可持续利用奠定基础。方法：采用来源鉴别、性状鉴别、显微及理化鉴别的方法对栽培胡黄连与野生胡黄连进行鉴别比较研究。结果：二者植物形态、性状及显微特征有很大的相似性;薄层色谱斑点数目、颜色及Rf值、紫外吸收峰形及吸收波长也基本相似。结论：初步论证了人工栽培胡黄连替代野生胡黄连药用的可行性,也是对濒危植物胡黄连进行资源保护的一种可行性尝试。     

麻花秦艽ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的:建立麻花秦艽的简单重复序列区间-聚合酶链反应(ISSR-PCR)最佳反应体系,为该药材的种质鉴定及遗传多样性等研究提供参考。方法:运用单因素试验和正交试验优选麻花秦艽的ISSR-PCR反应体系中DNA模板用量,Mg2+浓度,dNTPs浓度,TaqDNA聚合酶用量和引物浓度等参数,确定麻花秦艽每条引物的最佳退火温度。结果:ISSR-PCR最佳反应体系(20μL)为模板DNA1μL(36mg·L-1),10×PCR缓冲液(含Mg2+)1.75μL(20mmol·L-1),dNTPs0.8μL(10mmol·L-1),Taq酶0.1μL(0.5%)及引物0.6μL(10mmol·L-1);筛选出12条多态性高、扩增稳定的ISSR引物,UBC-809引物的最佳退火温度55.5℃。扩增出的7条带中多态性带为6条,多态性位点比率85.71%。结论:建立的麻花秦艽ISSR-PCR反应体系稳定可靠,位于500bp处的条带为非多态性条带,可作为该种属的特征性条带。     

金樱子ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的为获得稳定的金樱子ISSR反应体系。方法采用L16(45)正交试验设计,以金樱子DNA为模板,研究PCR反应体系中5种主要成分,即Mg2+、d NTPs、Tag酶、引物及模板对金樱子ISSR-PCR扩增结果的影响。结果金樱子ISSR在20μl的最佳反应体系中,Mg2+浓度为0.5mmol/L,Tag酶为0.9 U/μl,d NTPs为0.3 mmol/L,引物为0.2(100μmol/L),模板DNA用量为2ng/μl。结论实验结果可用于金樱子ISSR的构建。     

正交设计优化地枫皮ISSR-PCR反应体系

目的 建立稳定性高、重现性好,适合地枫皮遗传差异分析的ISSR-PCR反应体系.方法 利用正交试验设计,对地枫皮ISSR-PCR反应的5个因素(Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA浓度)进行优化,PCR结果用SPSS统计软件分析,在此基础上对PCR反应过程中的退火温度和循环次数进行梯度检测.结果 大部分因素的不同水平对PCR反应有显著影响,其中Taq酶影响最大;地枫皮ISSR-PCR最佳反应体系(20 μL)为:Mg2+ 1.60 mmol/L、dNTP 0.22 mmol/L、引物0.90 μmol/L、Taq酶0.50 U、模板DNA 70.00 ng;最佳退火温度和循环次数分别为51.8℃和40次;从62条引物中筛选出13条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物.结论 建立的地枫皮ISSR-PCR反应体系,经过16份地枫皮样品检验,证明该体系稳定可靠,可用于地枫皮遗传差异分析.     

云南沉香ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的建立并优化出清晰稳定的云南沉香ISSR-PCR反应体系和扩增程序,并筛选出适合的引物。方法利用正交设计试验,对云南沉香ISSR-PCR反应体系中的5个主要因素进行优化,并设置温度梯度检测最佳退火温度。结果首次建立了云南沉香ISSR-PCR的最佳反应体系,即在20μl反应体系中,各个因素的浓度分别为:模板DNA 10 ng/20μl、Mg2+3mmol/L、Taq DNA聚合酶2.4 U/20μl、d NTP 0.6mmol/L、引物0.2μmol/L;引物UBC811的最佳退火温度为53.0℃。并且,从100条引物中筛选出16条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。结论优化确立的云南沉香ISSR-PCR反应体系稳定可靠,可为后续云南沉香的遗传多样性分析研究奠定基础。     

天门冬ISSR分子标记技术的建立与体系优化

目的建立并优化天门冬ISSR-PCR反应体系和扩增程序,为探讨天门冬种质间遗传多样性提供依据。方法采用单因子试验和正交设计法,研究Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA、延伸时间及循环次数对PCR扩增的影响。结果天门冬ISSR-PCR的最佳反应体系为25μL的反应体系中含模板DNA 40 ng、Mg2+1.25 mmol/L、dNTP 320μmol/L、引物1.2μmol/L、Taq DNA聚合酶1.5 U。在此基础上,从50条引物中筛选出13条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度。结论建立的天门冬ISSR-PCR反应体系,经过17份天门冬种质检验,证明该体系稳定可靠,可用于天门冬遗传分析。     

白芨ISSR-PCR反应体系的建立及优化

目的:对白芨ISSR-PCR反应体系进行建立以及优化。方法:采用正交试验对影响白芨的ISSR-PCR反应体系中的6个影响因素Taq DNA聚合酶、BSA、引物、模板DNA、d NTP、Mg2+进行系统的筛选和优化,寻找白芨ISSR-PCR的最优条件。结果:经过系统的优化后,最终确立了最优的白芨ISSR-PCR方案,50μL反应液中Taq DNA聚合酶为2.5U、BSA为7.5g/L、引物为5.0μmo L/L、模板DNA为200ng、d NTP为0.4mmo L/L、Mg2+为4.0mmo L/L。结论:试验结果得出最佳的白芨ISSR-PCR反应体系,为后期合理有效的应用ISSR方法对白芨遗传资源的监测提供了参考。     

利用综合评分法优化柴胡ISSR-PCR反应体系

目的研究柴胡ISSR-PCR的最佳反应体系。方法应用综合评分法,对Taq酶、Mg2+、引物、总DNA和dNTPs 5种ISSR反应成分进行优选。结果优化反应体系为:25μL反应体系中含有1×buffer、Taq酶1.0 U、Mg2+2.5 mmol.L-1、引物0.4μmol.L-1、DNA 75 ng、dNTPs 0.3 mmol.L-1。结论综合评分法优化柴胡ISSR反应体系可行,为下一步试验提供了可靠参数。     

西藏胡黄连的化学成分

 目的对中药西藏胡黄连(Picrorhiza scrophulariiflora)体积分数95%乙醇提取物的化学成分进行研究。方法采用反复硅胶、Sephadex LH-20柱色谱等方法进行分离,根据化合物的理化性质、波谱分析及与文献报道对照鉴定化合物的结构。结果从中分离得到8个化合物,其结构鉴定为11-O-(4′-甲氧基没食子酰基)-岩白菜素(1)、11-O-没食子酰基岩白菜素(2)、岩白菜素(3)、熊果苷(4)、草夹竹桃苷(5)、胡黄连苷A(6)、β-谷甾醇(7)、胡萝卜苷(8)。结论除化合物5和6外,其余6个化合物均为首次从胡黄连属植物中分离得到。     

传统中药金钱草ISSR-PCR反应体系的正交优化研究

建立稳定、可靠的金钱草ISSR-PCR反应体系,为金钱草遗传多样性分析、优良品种选育、药材分子鉴定奠定基础。该研究在7水平单因素实验的基础上,采用L₁₆（4⁵）正交试验设计,应用SPSS 19.0进行方差分析,对影响反应体系的5个主要因素在4个水平上进行优化。利用优化的反应体系,筛选引物最适退火温度,以23份不同产地金钱草材料检测体系稳定性。结果显示模板DNA,引物,dNTP,Mg²⁺,Taq酶5个因素对金钱草ISSR-PCR反应结果均有极显著影响,影响大小依次为引物>Taq酶>模板DNA>Mg²⁺>dNTP,确定最优反应体系为总体积25 μL,模板DNA 60 ng,引物0.3 μmol·L^-1,dNTP 0.2 mmol·L^-1,Mg²⁺ 1.8 mmol·L^-1,Taq酶1.25 U。经不同产地样品检测,该优化体系稳定、可靠。该研究为其他物种ISSR-PCR体系的优化提供参考。     

正交设计优化翼梗五味子ISSR-PCR反应体系

目的对影响翼梗五味子ISSR-PCR扩增反应的各因素进行优化,建立稳定的反应体系。方法基于正交极差分析方法,以Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP和引物5因素4水平的正交试验对翼梗五味子ISSR-PCR反应体系进行优化。结果翼梗五味子ISSR-PCR的最佳反应体系(20μL)为:Taq酶1.00 U、Mg2+1.50 mmol/L、模板DNA 40.00 ng、dNTP 0.25mmol/L、引物0.50μmol/L。筛选出12条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并确定了每个引物的最佳退火温度。结论所建立的翼梗五味子ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、重复性好等优点,为翼梗五味子的分子水平研究提供实验依据。     

正交设计法优选西藏胡黄连提取工艺的实验研究

目的优选西藏胡黄连中有效成分胡黄连苷Ⅰ、Ⅱ的最佳提取工艺。方法以95%乙醇为提取溶剂,采用渗漉提取法,分别以胡黄连苷Ⅰ、Ⅱ的总含量为指标,正交设计考察药粉粒度、浸泡时间、溶剂用量及流速对胡黄连苷Ⅰ、Ⅱ提取的影响。结果最佳提取工艺为药材粉碎为65目,95%乙醇润透,浸泡12h,以15倍量95%乙醇1mL/min的流速进行渗漉提取。结论优选的最佳工艺稳定可靠,适用于西藏胡黄连中胡黄连苷Ⅰ、Ⅱ的提取,可供工业化生产参考。