抗二羰基/L-木酮糖还原酶单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗人二羰基/L-木酮糖还原酶(Dicarbon-yl/L-xylulosereductase,DCXR)的单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定。方法将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体,用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备mAb,并通过间接ELISA法、Westernblot及免疫组化的方法对mAb进行特性鉴定,通过免疫沉淀联合质谱、Uni-ZAPXR表达文库筛选鉴定抗原。结果获得1株可稳定分泌抗人DCXRmAb的杂交瘤细胞系。mAb的Ig亚类(型)为IgG1(κ),该mAb可用于ELISA检测、Westernblot、免疫组化和免疫沉淀实验。结论成功制备了抗人DCXR的mAb,为DCXR的研究提供了有力的工具。     

抗AGR2单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的:制备鼠抗AGR2单克隆抗体(mAb)并对其特性进行鉴定及其初步应用研究。方法:以AGR2-MBP融合蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备鼠抗AGR2的mAb,并用Protein-G亲和层析法纯化mAb。用间接ELISA法测定mAb的效价,以Western blot鉴定mAb的特异性。用免疫荧光、免疫沉淀和MTT法对mAb进行初步应用研究。结果:获得1株可持续、稳定分泌抗AGR2的mAb的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞分泌的mAb的Ig亚类(型)为IgG1(κ),腹水mAb的效价达1×10-6。Western blot检测显示,在Mr为20000处有1条清晰的带。免疫荧光显示,该mAb可与乳腺癌细胞中的AGR2蛋白结合。免疫沉淀证实该mAb可与天然状态的AGR2有效结合。MTT实验显示该mAb对乳腺癌细胞MCF7的生长有抑制作用。结论:制备出的鼠抗AGR2的mAb效价高、特异性良好,可抑制细胞的生长,有一定的应用价值,为进一步研究AGR2的功能及其在乳腺癌、前列腺癌等癌症的诊断和治疗中的作用提供了工具。     

抗丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基单克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备抗人丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基(pyruvate dehydrogenase complex E2,PDC-E2)的单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定.方法 将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体,用线粒体总蛋白免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备mAb,并通过间接ELISA法、Western blot及免疫组化的方法对mAb进行特性鉴定,通过免疫沉淀联合质谱、Uni-ZAP XR肝脏cDNA表达文库筛选鉴定抗原.结果 获得1株可稳定分泌抗人PDC-E2 mAb 的杂交瘤细胞系.mAb的Ig亚类(型)为IgG1(κ), 该mAb可用于ELISA检测、Western blot、免疫组化和免疫沉淀实验.结论 成功制备了抗人PDC-E2的mAb,为PDC-E2的研究提供了有力的工具.     

乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原酶单克隆抗体的制备与鉴定

目的：制备鼠抗人乙醛酸还原酗羟基丙酮酸还原酶单克隆抗体（mAb）并进行初步鉴定。方法：将正常成人肝组织匀浆离心并分离出肝脏胞质总蛋白，用肝脏胞质总蛋白免疫BALB／c小鼠，采用杂交瘤技术制备mAb，并通过间接ELISA法、Western blot及免疫组化的方法对mAb进行特异性鉴定，通过免疫沉淀联合质谱和Uni-ZAP XR表达文库筛选鉴定抗原。结果：通过间接ELISA筛选获得杂交瘤细胞株ADB291，其分泌的mAb Ig亚类（型）为IgG1（κ），Western blot结果显示该mAb识别相对分子质量（Mr）为35000的蛋白；对免疫沉淀获得的相应抗原回收、酶切、质谱鉴定为GRH—PR。同时应用mAb ADB291对人肝脏cDNA表达文库（Uni-ZAP XR）进行筛选，筛选所获得的阳性噬菌斑测序结果显示2个阳性克隆插入序列均为GRHPR；阳性克隆转化表达后的Western blot结果确认该抗体识别肘，35000的表达蛋白。结论：mAb ADB291特异识别的抗原为GRHPR，该mAb在GRHPR的功能研究和二型原发性尿草酸盐过多遗传疾病的临床诊断等方面具有应用价值。     

抗SARS冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备和初步应用

目的:研制抗SARSCoVN蛋白的单克隆抗体(mAb)。方法:以纯化的GSTN免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗SARSCoVN蛋白mAb;用免疫双扩散鉴定Ig亚类;Westernblot和免疫组化鉴定mAb的特异性;间接ELISA检测mAb的腹水效价、相对亲和常数。结果:获得1株可分泌特异性mAb的抗SARSCoVN蛋白的杂交瘤细胞系3E10H,Ig亚类为IgG2b;其腹水效价为8×10-5;其相对亲和力1.725×10-10mol/L,Westernblot和免疫组化阳性。结论:获得特异性抗SARSCoVN蛋白的mAb,为进一步用于临床诊断和实验研究创造了条件。     

氨甲酰磷酸合成酶单克隆抗体的制备、鉴定及应用

目的:制备抗人氨甲酰磷酸合成酶(CPSI)的单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定与应用.方法:将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体,用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备 mAb,并通过间接ELISA法、Western blot、免疫组化及免疫荧光染色的方法对mAb进行特性鉴定,通过免疫沉淀联合质谱、Uni-ZAP XR表达文库筛选鉴定抗原,借助免疫捕获的方法用抗体来分离复合物.结果:获得3株可稳定分泌抗人CPSI mAb的杂交瘤细胞系.mAb的Ig亚类(型)为IgGl(K),该mAb可用于ELISA检测、Western blot、免疫组化、免疫荧光染色、免疫沉淀实验和复合物的分离.结论:成功制备了抗人CPSI的mAb,为CPSI的研究提供了有力的工具.     

抗11β-羟类固醇脱氢酶1的单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备抗人11β-羟类固醇脱氢酶1(homo sapiens hydroxysteroid 11-beta dehydrogenase 1,HSD11B1)的单克隆抗体(mAb)并初步鉴定其特性.方法:将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体,用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备mAb,并通过间接ELISA法、Western blot、免疫组化的方法对mAb进行特性鉴定,通过免疫沉淀、Uni-ZAP XR肝脏cDNA表达文库筛选鉴定抗原.结果:通过间接ELISA筛选获得1株可稳定分泌抗人HSD11B1 mAb的杂交瘤细胞系.其分泌的mAb的Ig亚类(型)为IgG1(κ),Western blot结果显示该mAb可以特异地识别相对分子质量(Mr)为35 000的蛋白;应用mAb CBF245对人肝脏cDNA表达文库(Uni-ZAP XR)进行筛选,阳性噬菌斑测序结果显示5个阳性克隆插入序列均为HSD11B1.结论:mAb BAD062特异地识别抗原HSD11B1,该mAb可用于ELISA检测、Western blot、免疫组化和免疫沉淀实验,为HSD11B1的研究提供了有力的工具.     

抗人羧酸酯酶-Ⅱ多克隆抗体的制备、鉴定及应用

目的:构建人羧酸酯酶-Ⅱ(hCE-Ⅱ)原核表达质粒并在大肠杆菌中表达,制备多克隆抗体(pAb),并对其特性进行初步鉴定.方法:以人正常肝cDNA文库为模板,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-hCE-Ⅱ(即hCE-Ⅱ-GST)和pET-32a-hCE-Ⅱ(即hCE-Ⅱ-His).在宿主菌BL21内进行诱导表达,hCE-Ⅱ-GST融合蛋白作为免疫原免疫大耳白兔,用辛酸-硫酸铵分步沉淀法初步纯化抗血清,并用间接ELISA、West-ern blot及免疫组化检测抗体的灵敏度和特异性.结果:成功制备了抗hCE-Ⅱ的多克隆抗体.Western blot鉴定表明该抗体可特异性识别重组蛋白以及天然的人肝微粒体蛋白.免疫组织化学鉴定显示该抗体可特异性结合肝包浆中的hCE-Ⅱ蛋白,而不与血管平滑肌细胞结合.结论:制备的pAb有较高的效价和较好的特异性,为肝癌诊断试剂盒的研究奠定了实验基础.     

烯脂酰辅酶A水解酶单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备小鼠抗人烯脂酰辅酶A水解酶(enoyl CoA hydratase,ECHS1)的单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定.方法:将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体,用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备mAb,并通过间接ELISA、Western blot、免疫沉淀、免疫组化和间接免疫荧光等方法对mAb进行特异性鉴定,通过Uni-ZAP XR正常成人肝脏cDNA表达文库筛选鉴定抗原.结果:获得1株可稳定分泌抗人ECHS1 mAb 的杂交瘤细胞株BGB095.该mAb的Ig亚类(型)为IgG1(κ),可用于ELISA检测、Western blot、免疫沉淀、免疫组化等实验.结论:成功制备了抗人ECHS1的mAb,为代谢疾病和肿瘤的研究提供了有力的工具.     

抗人GCRG213单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备GCRG213单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定。方法:在大肠杆菌中表达HIS-GCRG213融合蛋白,并以所获蛋白作为免疫原制备鼠mAb。采用ELISA、Westernblot法鉴定抗体的效价及特异性。免疫组化染色观察GCRG213在胃癌和正常组织中的表达。结果:HIS-GCRG213融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达,经常规的细胞融合和筛选获得2株可稳定分泌抗GCRG213的杂交瘤细胞株。ELISA法检测腹水的效价可达到1∶106,Western blot证实该抗体可与重组HIS-GCRG213蛋白特异性结合。免疫组化染色显示GCRG213在胃癌组织中的表达明显强于正常胃黏膜组织。结论:成功地制备出2株抗GCRG213的mAb,为进一步研究GCRG213的生物学功能提供了有效的工具。     

抗人RANTES分子单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:制备抗人RANTES分子单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定,为研究RANTES分子的组织分布和功能提供实验手段。方法:应用淋巴细胞杂交瘤技术,制备小鼠源性抗人RANTESmAb。用ELISA法鉴定腹水mAb的效价。用Q FastFlow阴离子交换柱纯化mAb。用Westernblot鉴定mAb的抗原结合活性。用免疫组化染色法,对RANTES分子在进行小肠移植术的大鼠移植肠组织中的分布进行鉴定。结果:获得4株分泌抗RANTESmAb的杂交瘤细胞株。间接ELISA法测定腹水mAb的效价均达1×10-6,3株mAb为IgG1亚类(κ),1株为IgG2b(κ)。Westernblot的结果显示,3株mAb与人RANTES均有良好的结合活性。用3株mAb进行免疫组化染色的结果显示,RANTES分子在进行小肠移植术的大鼠小肠腺上皮细胞胞质中呈高表达。结论:获得4株能特异性识别天然RANTES分子的mAb。大鼠小肠移植后其肠上皮细胞中可高水平地表达RANTES。     

抗SARS冠状病毒M蛋白片段单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的:制备抗SARS冠状病毒(SARS-CoV)M蛋白N端1~43氨基酸(aa)单克隆抗体(mAb),并对其特性进行初步鉴定。方法:用纯化的SARS-M/GST融合蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗M蛋白片段的mAb。用间接ELISA法筛选能分泌抗M蛋白片段mAb的杂交瘤细胞株。Westernblot和间接ELISA鉴定所获mAb的特异性,并用小鼠mAb亚类测定试剂盒检测所获的mAbIg亚类。为分析mAb识别位点,进一步将M蛋白片段截短为部分重叠的2段表达,以Westernblot初步定位mAb识别位点。结果:获得1株可分泌特异性抗SARS-CoVM蛋白片段的mAb杂交瘤细胞株(3H9),Ig亚类鉴定为IgG2a,轻链为κ型。Westernblot显示其mAb可特异识别SARS-CoVM蛋白N端1~43aa,间接ELISA证实mAb可与包被于聚苯乙烯微孔板上的SARS病毒全蛋白抗原发生特异性反应,其识别位点位于M蛋白N端16~28aa。结论:成功获得1株抗SARS-CoVM蛋白N端1~43aamAb杂交瘤细胞,并初步定位其识别位点。     

抗丁型肝炎病毒mAb的制备及其初步应用

目的 :以基因工程表达丁型肝炎病毒抗原蛋白 (HDAg)为抗原 ,建立分泌单克隆抗体 (mAb)的杂交瘤细胞系 ,并对其分泌的mAb进行鉴定。方法 :用Ni NTA技术纯化HDAg免疫BALB/c小鼠 ,取脾细胞及骨髓瘤细胞按常规方法融合、筛选、克隆化及腹水注射制备mAb。采用ELISA及免疫组化技术进行鉴定。结果 :筛选出 2株能稳定分泌特异性抗 HD的mAb杂交瘤细胞株 (HD1,HD2 ) ,经多次复苏传代仍能稳定分泌抗体 ,特异性强 ,效价高。应用于ELISA测定患者血清HDAg均呈特异性阳性反应。免疫组化检测肝组织显示 ,针对该mAb的抗原主要分布于细胞核或浆内。结论 :此两株丁肝杂交瘤细胞株分泌的抗体对丁肝抗原具有特异亲和性 ,为丁型肝炎病毒的临床诊断及病理检测提供技术基础     

基于抗原表位制备抗人GP73单克隆抗体

目的:制备抗GP73蛋白的单克隆抗体(mAb)。方法:将GP73蛋白N末端的肽段(AAAERGAVELK)展示于T7噬菌体表面,扩增重组噬菌体作为抗原免疫小鼠,制备抗体。通过ELISA法检测小鼠血清抗体的效价,筛选分泌抗GP73蛋白抗体的杂交瘤细胞株;通过ELISA、Westernblot等方法检测mAb的特异性。结果:利用表面展示GP73抗原表位的重组噬菌体为抗原免疫小鼠,通过细胞融合和筛选得到了能识别GP73蛋白的mAb,且特异性较好。结论:将蛋白质抗原的合适抗原表位展示在T7噬菌体表面,用这种重组噬菌体作为替代抗原可以制备识别全蛋白的mAb。     

抗H9亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的 :制备抗禽流感病毒 (AIV)H9亚型血凝素蛋白的单克隆抗体 (mAb)。方法 :以AIVH9亚型油乳剂灭活疫苗作为免疫原 ,免疫 8wk龄BALB/c小鼠。采用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗AIVH9亚型血凝素蛋白的mAb ;采用ELISA和血凝抑制试验(HI)检测腹水mAb的效价 ;采用ELISA、HI、免疫荧光染色 (IF)及Westernblot鉴定mAb的特异性。结果 :获得 3株可稳定分泌特异性mAb的杂交瘤细胞株 2A3、2H1和 1C8,其腹水mAb的ELISA效价依次为 1× 10 7、1× 10 5和 5× 10 6,血凝抑制效价为 1× 2 8～ 1× 2 13 ;3株mAb的Ig亚类均为IgG1。以mAb 2H1进行Westernblot的结果显示 ,该mAb能与AIV的Mr 为 75 0 0 0的蛋白条带起反应 ,表明其是针对AIVH9亚型血凝素蛋白的mAb。与 32株AIVH9亚型国内分离株进行血凝抑制试验表明 ,mAb 2H1具有良好的广谱性。结论 :成功地制备了抗AIVH9亚型血凝素蛋白的mAb ,为AIV的抗原性分析、血清学诊断、疫苗质量的监测及流行病学调查等奠定了基础     

鼠抗人CD20单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备CD20融合蛋白及制备CD20的单克隆抗体(mAb),并对其进行特性鉴定.方法:以人单核细胞cDNA文库为模板,构建重组表达质粒pGEX- 4T-1-CD20 (即CD20-GST) 和pET-32a-CD20(即CD20-His).以融合蛋白CD20-GST为免疫源免疫BALB/c雌性小鼠制备(mAb),用间接ELISA法测定抗体的效价,Western blot、免疫荧光鉴定其特异性及免疫组化染色法对mAb相应的抗原进行组织定位.结果:CD20-GST 和CD20-His蛋白在大肠杆菌中可高效表达,经纯化后可获得高纯度的CD20蛋白,经细胞融合得到1株稳定分泌CD20抗体的杂交瘤细胞株,Western blot和免疫组化显示抗CD20 mAb与CD20蛋白具有良好的反应性.结论:成功制备高纯度CD20蛋白并以此为抗原制备了1株能够稳定分泌抗人CD20的鼠mAb的杂交瘤细胞株BD11F4,为进一步研究CD20对非霍奇金淋巴瘤的诊断治疗提供基础.     

抗人FKBP52分子单克隆抗体的制备和鉴定

目的；研制抗人FKBP52单克隆抗体（mAb)，并分析其免疫生物学特性。方法：采用纯化的人FKBP52蛋白免疫BALB／c小鼠。用ELISA法鉴定mAb的特异性；用Western blot鉴定制备的9株mAb所识别的抗原相对分子质量（Mr)及结合人FKBP52分子的功能区。结果：共获得9株分泌抗人FKBP52 mAb的杂交瘤细胞。抗人FKBP52 mAb可识别相对Mr为52000在原核系统中表达的人FKBP52蛋白，也可识别Jurkat细胞浆中Mr为52000的天然FKBP52蛋白。两株mAb均可识别人FKBP52分子中的第2功能区。其余7株mAb可识别人FKBP52分子中的第3功能区。结论：成功地制备了抗人FKBP52分子mAb。     

Clusterin抗原的表达、抗体制备及其初步鉴定

目的:制备Clusterin(CLU)多克隆和单克隆抗体(mAb),并进行特性鉴定.方法:以成人肝cDNA表达文库为模板,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-CLU和PET-32a-CLU.GST-CLU融合蛋白在大肠杆菌中表达,被作为免疫原制备兔多抗和鼠mAb.采用ELISA法和Western blot鉴定抗CLU抗血清在重组蛋白和天然蛋白中的特异性.采用Western blot,间接免疫荧光,免疫组化鉴定mAb的特异性.结果:GST-CLU融合蛋白在相对分子质量(Mr)约54 000处呈现明显表达条带.Western blot鉴定表明,制备的抗CLU兔多克隆抗体可特异地识别成人肝总蛋白中Mr约52 000和58 000的CLU蛋白.获得9株可稳定分泌抗CLU的杂交瘤细胞株可识别重组人CLU蛋白,其中有2株可特异性结合HepG2细胞质中的蛋白,4株可特异性结合成人肝脏组织肝细胞质中的蛋白.结论:成功地制备出兔抗人CLU抗血清和9株抗CLU的mAb,为进一步研究CLU在肿瘤中的功能奠定了实验基础.     

抗禽流感病毒M2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗禽流感病毒M2蛋白的单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定.方法:利用纯化的融合蛋白GST-M2免疫BALB/c小鼠,然后以GST-M2 和 GST分别作为ELISA抗原进行筛选,选择GST-M2抗原检测强阳性、GST抗原检测阴性的杂交瘤细胞进行克隆,建立能稳定分泌抗AIV M2 mAb的杂交瘤细胞株.mAb的效价采用间接ELISA和琼脂扩散试验(AGP)测定,用夹心ELISA测定Ig亚类,Western blot、抗原捕获ELISA、间接免疫荧光及免疫组化染色法检测 mAb 的特性.结果:得到4株分泌抗禽流感病毒M2蛋白的mAb的杂交瘤细胞株1E1、2F8、4E3 和 5D6,小鼠腹水中抗体的ELISA效价大于210×100、AGP效价大于1:4.抗体亚类鉴定1E1和4E3为IgG2a,2178和5G6为IgG2b.抗原捕获ELISA表明,2F8 wAb能与H5、H9亚型AIV发生特异性反应,而不能与鸡新城疫病毒(NDV)和鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)反应.IFA和免疫组化试验表明,2F8 mAb能够与感染了禽流感病毒的MDCK细胞以及鸡体组织细胞发生特异性结合.结论:本研究获得4株抗禽流感病毒M2蛋白的mAb,其中2F8mAb的效价高、特异性强,可作为检测AIV方法的核心试剂.     

抗前列腺干细胞抗原鼠单克隆抗体的制备及其初步鉴定

目的:制备抗前列腺干细胞抗原鼠单克隆抗体(mAb).方法:采用杂交瘤技术,获得了10余株针对前列腺干细胞抗原(PSCA)的鼠mAb杂交瘤细胞株,对其中的6株进行了相关鉴定.结果:6株mAb的腹水效价均达到 1: 512 000,将其中的两株mAb进行了纯化,纯化后纯度大于90%,抗体亚类(型)mAb1、 mAb26为 IgG2b/k型,mAb6、 mAb11、 mAb37 为IgG1/k型,mAb46为 IgG2a/k型;ELISA结果显示制备的mAb与PSCA可发生特异反应.结论:制备了抗前列腺干细胞抗原鼠mAb,为PSCA生物学功能的研究打下基础.