半合成抗体库的构建及鉴定

目的构建半合成抗体库,不经免疫制备抗体。方法通过ＰＣＲ法,从人胎肝ＤＮＡ扩增基因组ＶＨ段基因,从Ｆｄ基因制备含有不同长度随机化ＣＤＲ３的ＦＲ３－ＣＤＲ３－Ｊ－ＣＨ１片段,然后用重叠ＰＣＲ法构建Ｆｄ库,与人轻链基因库组合构建成半合成抗体库。结果通过各种组合多次建库,获得总容量为４×１０８的半合成抗体库,其Ｆｄ段和轻链基因的重组率均大于９０％,Ｆａｂ表达率为５０％。挑选２０个克隆测定ＣＤＲ３序列符合所设计的随机序列,用三种不同抗原进行筛选均得到了特异性噬菌体抗体。结论所构建的半合成噬菌体抗体库可以用于不经免疫制备抗体     

抗HBs人VH基因中异常序列对抗体活性影响的研究

目的 从噬菌体抗体库中克隆到１株ＶＨ第３骨架区中含有异常序列的抗ＨＢｓ人Ｆａｂ基因,探讨该ＶＨ基因中异常序列对抗体活性的影响。方法 采用重叠ＰＣＲ方法去除了这段异常序列,构建表达载体,转化大肠杆菌表达出抗ＨＢｓＡｇ噬菌体抗体和可溶性Ｆａｂ,测定了它们与抗原的结合活性。结果 与原抗体比较,改造后的抗体与抗原的结合活性明显下降,分子模建提示这段异常序列对ＶＨ ＣＤＲ１和ＣＤＲ２的部分氨基酸残基的位置有     

从噬菌体抗体库克隆抗人RBC单链抗体基因

目的用噬菌体抗体库技术克隆抗人红细胞（ＲＢＣ）的单链抗体（ＳｃＦｖ）基因。方法以人ＲＢＣ免疫小鼠，取脾细胞，ＲＴ－ＰＣＲ法扩增ＶＨ和Ｖκ基因，组装到ＳｃＦｖ－噬菌体抗体表达载体中，构建了噬菌体抗体库，以人ＲＢＣ为固相抗原，对该库进行了四轮“吸附－洗脱－扩增”筛选，获得了抗人ＲＢＣ的ＳｃＦｖ基因。结果ＤＮＡ序列分析表明其可变区基因分别属于小鼠ＶＨⅢ亚群和ＶκⅤ亚群。结论所表达的ＳｃＦｖ可与不同人ＲＢＣ结合，与ＡＢＯ血型抗原无关，可用于构建快速血凝诊断的工程抗体     

将抗体库所获抗-HBs Fab转换为全长人IgG

目的 将大肠杆菌表达的抗－乙肝表面抗原（ＨＢｓ）人Ｆａｂ转换为真核表达的全长人ＩｇＧ１。方法 用重叠ＰＣＲ法将人工合成的人Ｖｋ前导序列拼到抗－ＨＢｓ的ＶＨ和ＶＫ上,构建人ＩｇＧ１真核表达载体。转染真核细胞,通过ＥＬＩＳＡ、ＲＴ－ＰＣＲ、免疫印迹检测抗－ＨＢｓ人ＩｇＧ的表达。结果 用轻链和重链同时表达的单一载体在ＣＨＯ细胞中获得了抗－ＨＢｓ人ＩｇＧ的表达。结论 通过噬菌体抗体库所获Ｆａｂ段可经拼接人     

抗HBsAg人IgG表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的 尝试将１株来源于人源性噬菌体抗体库的抗ＨＢｓＡｇ人Ｆａｂ,转换成完整的抗ＨＢｓＡｇ人ＩｇＧ。方法 采用重叠ＰＣＲ方法,在抗ＨＢｓＡｇ人Ｆａｂ和Ｖκ的ＶＨ基因的５’端接上人工合成的人κ链的前导序列,构建表达完整ＩｇＧ１的真核表达载体,转染ＧＨＯ（ＤＨＦＲ＾－）细胞,用ＥＬＩＳＡ、ＲＴ－ＰＣＲ和免疫印迹检测抗ＨＢｓＡｇ人ＩｇＧ的表达。通过ＤＨＦＲ／ＭＴＸ体系及金属离子诱导提高Ｉｇ表达。结果：获得     

从人源单链抗体库中筛出具有抗原结合活性的重链可变区和更小抗体片段

目的：用噬菌体呈现技术结合体外致敏法构建了人源单链抗体库,并用大肠癌相关抗原ＣＡＨｂ３筛选出抗大肠癌噬菌体抗体克隆ＥＬ５Ｄ、ＥＬ６Ｄ和Ｃａ１２,测定３个克隆的核苷酸序列,并研究其免疫活性。方法：采用抗体克隆扩增、测序分析、免疫组化法测定活性。结果：抗体基因插入片段分别为２２０、５００、５００ｂｐ。测序结果表明,ＥＬ６Ｄ和Ｃａ１２属ＶＨ５ＤＪＨ４,仅为ＶＨ结构亚单位,而ＥＬ５Ｄ属Ｖκ的Ｊκ１,仅为ＦＲ３ＣＤＲ３ＦＲ４结构。三者均能与人结直肠癌细胞和组织反应,与其亲本鼠源单抗Ｈｂ３的结合特性一致。３个抗体克隆已列入国际基因库,序号为ＡＦ０５１１６５ＡＦ０５１１６７。结论：短的人源抗体片段具有潜在临床应用价值。     

从人源单链抗体库中筛出具有抗原结合活性的重链可变区和更 …

目的：用噬菌体呈现技术结合体外致敏法构建了人源单链抗体库,并用大肠癌相关抗原ＣＡ－Ｈｂ３筛选出抗大肠癌噬菌体抗体克隆ＥＬ５Ｄ、ＥＬ６Ｄ和Ｃａｌ２,测定３个克隆的核苷酸序列,并研究其免疫活性。方法：采用抗体克隆扩增、测序分析、免疫组化法测定活性。结果：抗体基因插入片段分别为２２０、５００、５００ｂｐ。测序结果表明,ＥＬ６Ｄ和Ｃａ１２属ＶＨ５－Ｄ－ＪＨ４,仅为ＶＨ结构亚单位,而ＥＬ５Ｄ属Ｖｋ的Ｊｋ１,     

MOLECULAR CLONING AND SEQUENCE ANALYSIS OF THE IMMUNOGLOBULIN LIGHT CHAIN VARIABLE REGION GENE OF A MURINE ANTI-HUMAN C1-INH IgG

获得抗体的可变区基因是由鼠源性ＭｃＡｂ制备重组抗体的前提，本实验合成与轻链可变区（ＶＬ）ＦＲ１和ＦＲ４互补的通用引物，由分泌抗人Ｃ１－ＩＮＨＭｃＡｂ的杂交瘤Ｆ７细胞株提取总ＲＮＡ，经ＲＴ－ＰＣＲ扩增出Ｆ７ＶＬ的ｃＤＮＡ片段，并将其克隆入ｐＵＣ１８／１９测序载体，从两端进行双脱氧核苷酸随机终止法的ＤＮＡ序列测定。结果显示：ＶＬｃＤＮＡ是由３０３个碱基组成，编码１０１个氨基酸残基。由国际联机检索进行ＥＭＢＬ和Ｋａｂａｔ基因库扫描发现：Ｆ７ＶＬ仅与Ｉｇ同源，符合小鼠Ｉｇ的ＶＬ基因特征，同源性为６０％～８０％。根据Ｋａｂａｔ分类方法，Ｆ７ＶＬ基因推导的氨基酸序列应归属于小鼠Ｉｇ的ＶＬ基因ＩＶ亚组，是由Ｖｋ－Ｊｋ１重排产生。ＣＤＲ３含有９个氨基酸残基，其中含３个不相同氨基酸残基，ＶＬ大多数的氨基酸变化集中在ＦＲ１和ＣＤＲ１区，Ｆ７ＶＬ符合ＩｇＶＬ氨基酸残基变化的基本特征。Ｃｙｓ２３和Ｃｙｓ８８残基位于Ｆ７ＶＬＣＤＲ１和ＣＤＲ３的起始点，与二硫键形成有关。成功获得Ｆ７ＶＬ基因为进一步构建和表达单链Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体打下了良好的基础。     

丙型肝炎病毒基因重组体免疫诱发小鼠产生抗体的研究

以丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）基因免疫的动物实验方法,将构建的ＨＣＶ基因重组体（ｐＣＤ ＨＣＶ１）,采用不同方法免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,观察其诱发小鼠抗体水平变化。结果：ｐＣＤ ＨＣＶ１经肌肉注射３次免疫小鼠后,比１、２次免疫抗体水平要高;经灌胃、腹腔注射、皮下注射和肌肉注射不同途径免疫小鼠,以肌肉注射免疫效果最佳;不同剂量（１０μｇ、５０μｇ和１００μｇ）３次免疫小鼠,以１００μｇ剂量组诱发小鼠抗体反应最强;用普鲁卡因处理小鼠后再肌肉、皮下注射同剂量ｐＣＤ ＨＣＶ１,抗体水平均比直接注射同剂量ｐＣＤ ＨＣＶ１明显增高。     

CLONING AND SEQUENCE CHARACTERIZATION OF THE RE-ARRANDED VH GENE FROM HYBRIDOMA CELLS SECRETING ANTI-HUMAN C1-INHIBITOR McAb

由分泌抗人Ｃ１－ＩＮＨＭｃＡｂ的杂交瘤Ｆ７细胞株提取总ＲＮＡ，合成与ＶＨ基因ＦＲ１和ＦＲ４互补的通用引物，以ＲＮＡ反转录合成的第一链ｃＤＮＡ为模板，ＰＣＲ法克隆出Ｆ７ＶＨ基因的ＤＮＡ片段。将分离获得的目的ＤＮＡ片段亚克隆入ｐＵＣ１８／１９测序载体，从两头进行双脱氧核苷酸随机终止法的ＤＮＡ序列测定。结果显示：ＶＨ基因是由３３３个碱基组成，编码１１１个氨基酸残基。通过国际联机检索进行ＥＭＢＬ和Ｋａｂａｔ基因库扫描发现，Ｆ７ＶＨＤＮＡ仅与Ｉｇ同源，符合小鼠Ｉｇ的ＶＨ基因特征；同源性为６０％～８５％，应归属于Ｉｇ的ＶＨ基因。根据Ｋａｂａｔ分类方法，Ｆ７ＶＨ基因推导的氨基酸顺序属于小鼠Ｉｇ的ＶＨ基因的Ⅱ（Ａ）亚组，是由ＶＨ－Ｄ－ＪＨ３重排产生；其框架区的９和６７位点为脯氨酸（Ｐｒｏ）和赖氨酸（Ｌｙｓ）（非芳香族氨氨酸），符合Ⅱ（Ａ）亚组框架残基结构模式；其ＣＤＲ３区含有７个氨氨酸残基，表明Ｃ１－ＩＮＨ抗原表面结构并不复杂；ＦＲ２和ＦＲ３的２２和８９位点为半胱氨酸残基（Ｃｙｓ），与ＶＨ片段二硫键形成有关。成功获得Ｆ７ＶＨ基因为进一步构建和表达单链Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体打下良好的基础。     

抗皂角毒、表皮生长因子受体双功能抗体的制备与体外效应的研究

目的：研究制备抗皂角毒和表皮生长因子受体双功能抗体,用以导向皂角毒杀伤肿瘤细胞。方法：在制备ＥＱ７５、ＣＹ１２．１４单克隆抗体细胞株的基础上,通过杂交杂交瘤技术制备双功能抗体细胞株。结果：双功能抗体（ＥＱ７５×ＣＹ１２．１４）与单用皂角毒杀伤肿瘤细胞（Ａ４３１）的ＩＣ５０分别为１０－９．６、１０－８．４ｍｏｌ／Ｌ。结论：双功能抗体（ＥＱ７５×ＣＹ１２．１４）杀伤肿瘤细胞（Ａ４３１）,以ＩＣ５０值计算,有效率为单用皂角毒的１５倍左右。     

ELISA测定德国小蠊卵黄蛋白含量方法的建立

本文采用蒸馏水沉淀法提取了德国小蠊卵黄蛋白，免疫家兔，并将所得抗血清经雄虫血淋巴吸收，获得抗卵黄蛋白特异抗体，用ＤＥＡＥ－纤维素批次法纯化抗体ＩｇＧ，并用辣根过氧化物酶标记，建立ＥＬＩＳＡ直接法测定卵黄蛋白含量的方法。     

nNOS片段在大肠杆菌中的表达及特异性抗体的制备

目的：为了制备ｎＮＯＳ特异性抗体。方法：用ＰＣＲ的方法克隆出ｎＮＯＳ７０８￣８８１ａａ片段的编码基因并将之插入ｐＥＴ２８ａ原核表达载体。成果：成功地在大肠杆菌中获得高效表达。经ＨｉｓＴａｇ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ和电泳回收法得到纯蛋白,将此蛋白免疫兔,制备出ｎＮＯＳ特异性抗体,抗体效价可达：８０００。利用该抗体成功地检测了正常肌肉和ＤＭＤ肌肉中ｎＮＯＳ的含量变化,证实ＤＭＤ肌肉中ｎＮＯＳ的含量明显低于     

活化淋巴细胞及其染色质诱导IgG1亚类抗双链DNA抗体生成

目的：抗双链ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）抗体的诱生机理不明，试图研究诱导该自身抗体产生的自身抗原。方法：取体外活化的Ｂａｌｂ／ｃ小鼠脾细胞及其染色质免疫同系小鼠，用ＥＬＩＳＡ方法检测ＩｇＧ类双链ＤＮＡ抗体及其ＩｇＧ亚类。结果：水同原因活化的脾细胞及其染钯质均可诱导ＩｇＧ类抗双链ＤＮＡ抗体产生，且抗体均为ＩｇＧ１亚类。结论：活化淋巴细胞及其活性染色质是诱导双链ＤＮＡ抗体生成的自身免疫原。     

重组人宋内痢疾杆菌脂多糖抗独特型抗体重链可变区基因的高效表达及纯化

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）从人源噬菌体抗体库中筛选出的宋内痢疾杆菌脂多糖抗独特型抗体基因扩增了重链可变区基因，将其克隆到表达载体ｐＧＥＸ２Ｔ内，转化大肠杆菌ＤＨ５α，获得高效表达，表达量占全菌总蛋白质的４０％左右，表达出的融合蛋白分子量为４×１０４，以包涵体形式存在。将此融合蛋白包涵体变性、复性后通过谷胱甘肽亲和层析柱（ＧＳＴＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ柱），得到电泳纯的融合蛋白，每升培养物能纯化到２０～３０ｍｇ融合蛋白。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析证明宋内痢疾杆菌脂多糖鼠单抗（５Ｂ１２）能特异地结合到分子量４×１０４的融合蛋白的带上。ＥＬＩＳＡ试验显示融合蛋白与宋内痢疾杆菌脂多糖单抗（５Ｂ１２）有结合活性，而与无关单抗，如大肠杆菌Ｊ５株单抗（Ｅ３）、炭疽杆菌单抗（Ｆ８ＦＡ）、鼠伤寒沙门氏菌单抗（Ｍ４６７）及乙肝病毒单抗（Ｍ１１）不结合。     

抗丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3单链抗体的制备及免疫组织化学研究

目的 研制抗丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS3的人源噬菌体单链抗体,并探讨其在临床诊断中的应用价值。方法 以重组的丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3为固相抗原,利用亲和筛选的原理,从噬菌体抗体库中经过5轮“吸附－洗脱－扩增”的筛选过程及酶联免疫吸附试验（ELISA）、斑点免疫杂交试验和DNA序列分析,获得HCV NS3的人源单链抗体;用该抗体与不同来源的HCV NS3抗原进行反应;对10例石蜡包埋的丙型肝炎患者肝组织进行免疫组化鉴定。结果 ELISA结果表明,所制备的HCV NS3人源单链抗体能与不同来源的HCV NS3抗原特异性结合（吸光度A值为1.38）;免疫组化结果表明,该抗体能够特异性识别丙型肝炎患者肝组织HCV NS3抗原,与正常肝组织及乙型肝炎病毒（HBV)的表面抗原均无交叉反应。结论 此法制备的单链抗体亲和性好,特异性强,且制备方法简便,周期短,可用于HCV NS3病原的检测。     

汽车驾驶员腰椎保护带的振动防护效应测试及其生物力学作用分析

通过对汽车驾驶员腰部振动的测试 ,了解腰椎保护带对振动的防护效应并对其生物力学作用进行分析。以日本产五十铃八吨载重卡车 (TDG72 )为测试车型。在装载六吨货物以三种不同车速 (10、30、6 0 km/ h)行进在柏油公路时 ,分别在佩带和不佩带腰椎保护带的情况下 ,对驾驶员腰椎部位垂直振动和水平纵向振动进行实时测量 (传感器安置于裤腰带和保护带的背外侧 )。结果显示 :1驾驶员腰部振动频率多为 10 Hz以下 ,属低频振动 ;2垂直振动大于水平纵向振动 ;3系腰椎保护带时的振动测量值大于不系腰椎保护带的测量值。由于腰椎保护带改变了脊柱的生物力学和振动特性 ,从而起到了保护腰椎的作用。我们认为它是防治汽车驾驶员腰痛的良好方法之一。     

心音图运动试验的精密度和准确度的分析

“心音图运动试验”(PCGET)是新近提出的一项心肌收缩能力以及心血管病人和健康人的心力储备评估方法。为了验明 PCGET方法的可信度 ,我们进行了该方法的精密度和准确度的研究。对 30个志愿者进行了PCGET,不同检查者对同一受试者同一心动周期中 S1幅值测量时 ,检查者 A的一组数据的 x± s=5 .0 5 0 .0 45 1,检查者 B的一组数据的 x± s=4.95± 0 .0 34 6 ,F=1.6 99,P>0 .0 5。不同检查者对同一受试者同一心动周期测量时 ,检查者 A的一组数据的 x± s=0 .789± 0 .0 0 18,检查者 B的一组数据的 x± s=0 .787± 0 .0 0 17,F=1.16 7,P>0 .0 5。对 PCGET运动前后心脏变力性状态评估的准确度为 10 0 %。结果表明 ,PCGET的精密度和准确度高 ,可作为心力储备的无伤性、简便、经济的量化测评方法。     

家蝇实验种群生殖,存活及生命表的研究

在最适宜的综合实验条件下，采用定量研究的方法，对家蝇实验种群的生殖、存活和生命表进行了研究，求出家蝇各生长阶段的发育历期（卵为０．５±０．０８００ｄ；幼虫为４．５±０．５０００ｄ；蛹为５．５±０．５０００ｄ；一世代为１５．５±１．５５６６ｄ），成活率（卵为９４．８２５１％；幼虫为８９．３２３８％；蛹为９５．２３７７％；一世代为８１．０２８９％），生殖特性（最大产卵量为１８４个／次／雌，平均产卵次数为８±７．８３７７次；终生产卵数为６８７±４１６．５８５８个）和存活特性（雌性最大寿命为７７ｄ；雄性最大寿命为６３ｄ；雌性平均寿命为３７．４９６３ｄ；雄性平均寿命为２６．８３９８ｄ）。我们也求出了家蝇整个生命中各天的死亡数和产卵数，绘制了家蝇实验种群生命表。我们研究获得的各项结果为家蝇的消灭和开发提供了科学的理论依据。