大鼠脑缺血/再灌注过程中葡萄糖转运体1在缺血半影区的表达

目的:研究局灶性脑缺血大鼠在不同缺血时间和不同再灌注时间的脑梗塞体积比、皮质半影区葡萄糖转运体1(GLUT1)转录水平和蛋白水平的表达。方法:用线栓法复制大鼠局灶性脑缺血模型,用KontronIBAS2.5全自动图像分析系统进行图像分析脑梗塞体积比;剥取缺血半影区皮质组织,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR),测定GLUT1mRNA水平的变化;用免疫组织化学半定量测定GLUT1蛋白水平的变化。结果:脑缺血1h后再灌注脑梗塞体积明显小于缺血3h再灌注。GLUT1mRNA自1h即开始升高,24h到达高峰,1周时仍高于假手术对照组;缺血3h再灌注组在3h开始升高,24h到高峰,1周后仍高于正常,但升高幅度不及MCAO1h/R组。MCAO1h/R组GLUT1蛋白水平自3h开始升高,24h达到高峰,1周时接近正常;MCAO3h/R组GLUT1在3h下降,继之升高,24h到高峰,1周时接近正常。结论:GLUT1在缺血半影区的表达上调,可能是机体对缺血损伤的保护性反应。     

降钙素基因相关肽对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑cAMP反应元件结合蛋白mRNA表达的影响

目的 探讨外源性降钙素基因相关肽(CGRP)对局灶性脑缺血再灌注大鼠海马和顶叶皮质cAMP反应元件结合蛋白(CREB)mRNA表达的影响.方法 用线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,应用原位杂交和图像分析技术检测大鼠缺血侧海马CA1区和顶叶皮质CREB mRNA表达.结果 假手术组右侧海马CAl区和顶叶皮质CREB mRNA有明显表达,缺血再灌注组右侧海马CAl区和顶叶皮质CREB mRNA阳性产物吸光度值减少,CGRP组缺血侧海马CAl区和顶叶皮质CREB mRNA表达的吸光度值比缺血再灌注组增高(P＜0.05).结论 CGRP上调局灶性脑缺血再灌注大鼠海马和顶叶皮质CREB mRNA的表达,CGRP对缺血神经元的保护作用可能通过激活CREB的转录与翻译,从而启动一系列信号通路来实现.     

神经生长因子及降钙素基因相关肽对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑环磷酸腺苷反应元件结合蛋白mRNA表达的影响

目的:探讨外源性神经生长因子(NGF)及降钙素基因相关肽(CGRP)对局灶性脑缺血再灌注大鼠海马和顶叶皮质环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)mRNA表达的影响。方法:用线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,应用原位杂交和图像分析技术检测大鼠缺血侧海马CA1区和顶叶皮质CREB mRNA的表达。结果:缺血再灌注组右侧海马CA1区和顶叶皮质神经元CREB mRNA表达比假手术组减少,NGF组及CGRP组的CREB mRNA表达均高于缺血再灌注组,NGF与CGRP联合应用时CREB mRNA的表达分别高于NGF组和CGRP组。结论:NGF及CGRP上调局灶性脑缺血再灌注大鼠海马和顶叶皮质CREB mRNA的表达,NGF与CGRP联合应用则作用更强,NGF和CGRP对缺血神经元的保护作用可能是通过激活CREB基因转录与翻译,从而启动一系列信号通路来实现。     

3-硝基丙酸预处理对脑缺血耐受模型GLUT1和GLUT3表达的影响

目的: 探讨3-硝基丙酸(3-NPA)预处理对大鼠局灶性脑缺血半暗带区不同再灌注时点GLUT1和GLUT3 mRNA及蛋白水平表达的影响。方法: 雄性SD大鼠40只,随机分为假手术组(sham组,n=4)、预处理对照组(3-NPA组,n=4)、大脑中动脉缺血组(M组,n=16)、3-NPA 预处理组(IPC组,n=16)。M组和IPC组按再灌注时间(4 h、12 h、24 h及48 h)不同又分为4个亚组,每组动物4只。将大鼠在相应时点断头取脑,取缺血侧(左侧)冠状面中间1/3皮质,分别采用RT-PCR和Western blotting方法检测GLUT1、GLUT3 mRNA和蛋白水平表达情况。结果: IPC组GLUT1 mRNA表达在缺血再灌注后4 h开始升高,48 h最大,显著高于sham组和M组相应时点。IPC组GLUT3 mRNA表达在24 h增高,48 h最高,与M组相应时点24 h、48 h及sham组比较显著增高。IPC组比M组的GLUT1蛋白、GLUT3蛋白表达增高,有显著差异(F=5.848,P<0.05;F=6.295,P<0.05),尤以缺血再灌注后48 h两者差异最明显。结论: 3-NPA预处理能诱导脑缺血耐受,其机制可能是上调GLUT1和GLUT3 mRNA及蛋白表达水平,维持脑组织的能量供给。     

NGF对局灶性脑缺血再灌注后大鼠海马CHOP mRNA及蛋白表达的影响

探讨NGF对局灶性脑缺血再灌注后大鼠海马神经元CHOPmRNA及蛋白表达的影响。用线栓法制作大鼠右侧大脑中动脉阻塞再灌注模型(MCAO),应用原位杂交方法检测CHOPmRNA的表达;应用免疫组织化学SABC法检测CHOP蛋白表达;应用显微图像分析系统进行分析。结果显示:假手术组大鼠海马CHOPmRNA及蛋白表达极少;缺血组较假手术组CHOP表达mRNA和蛋白均显著增加(P<0.01),缺血再灌注3h后CHOPmRNA表达明显增加,24h达高峰,48h开始显著下降,72h接近对照组水平,CHOP蛋白在缺血再灌注12h时明显表达增高,24h达到高峰,72h显著下降,但仍高于对照组水平(P<0.01);在缺血再灌注12、24、48h,NGF组CHOPmRNA及蛋白表达明显低于缺血组(P<0.01)。本研究表明,外源性NGF能显著抑制局灶性脑缺血再灌注后CHOPmRNA及蛋白表达,提示NGF可能对脑缺血再灌注损伤后的海马神经元有保护作用。     

脑缺血再灌注损伤后大鼠脑皮质TNF-α及其mRNA的时程变化

为了观察大鼠脑缺血再灌注损伤后大脑皮质TNF-α及其mRNA表达的时程变化,本实验采用大脑中动脉线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,用免疫组化染色法检测不同再灌注时间大脑皮质TNF-α的蛋白表达水平,以及用逆转录-多聚酶链反应法(RT-PCR)检测脑皮质内TNF-αmRNA的表达情况。结果显示:脑缺血1h,再灌注12h后大脑皮质内TNF-α及其mR-NA的表达开始升高,24h后达到高峰,随后逐渐下降。两组大脑皮质TNF-α及其mRNA的表达水平差异有统计学意义(P<0.01),模型组的TNF-α及其mRNA的表达水平明显高于假手术组。本研究结果表明,TNF-α在大鼠脑缺血再灌注损伤的调节过程中发挥重要作用。     

NGF对局灶性脑缺血再灌注大鼠海马和顶叶皮质内CREB mRNA表达的影响

探讨外源性神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)对局灶性脑缺血再灌注大鼠海马和顶叶皮质内的cAMP反应元件结合蛋白(cyclicAMPresponseelementbindingprotein,CREB)mRNA表达的影响。用线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,运用原位杂交和图像分析技术检测大鼠缺血侧海马CA1区和顶叶皮质内CREBmRNA的表达。结果显示:缺血再灌注组缺血侧海马CA1区和顶叶皮质CREBmRNA阳性反应产物平均光密度(OD)比假手术组减少(P<0.05),NGF组CA1区和顶叶皮质内的CREBmRNA阳性产物平均光密度高于缺血再灌注组(P<0.05)。本研究结果提示NGF可以上调局灶性脑缺血再灌注大鼠海马和顶叶皮质缺血神经元CREBmRNA的表达,NGF对缺血神经元的保护作用可能通过激活CREB的转录与翻译,从而启动一系列信号通路来实现。     

局部亚低温对大鼠局灶性脑缺血-再灌注模型NKCC1 mRNA水平的影响

目的:观察局部亚低温对大鼠局灶性脑缺血-再灌注模型NKCC1 mRNA表达水平的影响,探索局部亚低温的脑保护机制.方法:雄性Wistar大鼠50只,随机分成常温组和亚低温组.应用"线栓法"实现大鼠右侧大脑中动脉阻塞,2h后拔出线栓进行再灌注,于再灌注3h、12h、24h和72h处死大鼠.应用RT-PCR方法观察NKCC1 mRNA水平的变化.结果:与假手术亚组相比,缺血-再灌注亚组大鼠缺血区皮质NKCC1 mRNA水平明显升高,开始于再灌注3h,12h～24h达到高峰,72h开始下降,亚低温组各再灌注时间点NKCC1 mRNA水平均低于常温组中相应亚组的水平.结论:局部亚低温通过抑制缺血-再灌注过程中NKCC1 mRNA水平的上调发挥脑保护作用.     

丹参酮ⅡA对脑缺血再灌注大鼠顶叶皮质caspase-3和Akt表达的影响

目的探讨丹参酮ⅡA对局灶性脑缺血再灌注大鼠顶叶皮质半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)和蛋白激酶B(Akt)表达的影响。方法选取36只健康雄性大鼠,随机分为假手术组(Sham,12只),缺血再灌注组(I/R,12只)和丹参酮ⅡA治疗组(TanⅡA,12只),用线栓法阻塞大鼠右大脑中动脉制作局灶性脑缺血再灌注模型,脑缺血2h再灌注24h后,应用免疫组织化学方法与Western blot方法检测大鼠手术侧顶叶皮质caspase-3和Akt的表达。结果与Sham组相比,I/R组大鼠顶叶皮质caspase-3蛋白的阳性表达水平显著升高,而Akt蛋白的阳性表达水平则显著降低(P0.05);而与I/R组相比,TanⅡA组大鼠顶叶皮质caspase-3蛋白的阳性表达水平显著降低,Akt蛋白的阳性表达水平则显著升高(P0.05)。结论丹参酮ⅡA降低脑缺血再灌注大鼠顶叶皮质caspase-3的表达水平,上调Akt的表达。     

人工麝香对大鼠局灶性脑缺血再灌注后大脑MMP-9 mRNA及其蛋白表达的影响

目的观察人工麝香对大鼠脑缺血再灌注后脑组织基质金属蛋白酶-9（MMP-9）mRNA及其蛋白表达的影响。方法采用SD大鼠制作大脑中动脉局灶性脑缺血再灌注模型,用高、中、低浓度人工麝香治疗缺血2h再灌注24、48h大鼠。应用实时荧光定量PCR法检测缺血再灌注脑组织MMP-9 mRNA的表达水平,免疫组化方法检测脑组织MMP-9蛋白表达量。结果与假手术组相比,各组在缺血再灌注不同时间段脑组织MMP-9 mRNA及MMP-9蛋白表达水平均升高（P〈0.05）,其中,以模型组MMP-9 mRNA及MMP-9蛋白表达水平最高（P〈0.01）,高、中浓度人工麝香治疗组MMP-9 mRNA及MMP-9蛋白表达水平最低（P〈0.05）;与模型组相比,高、中浓度人工麝香治疗组脑组织MMP-9 mRNA及MMP-9蛋白表达水平降低最为显著（P〈0.01）。结论人工麝香能降低大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑组织MMP-9 mRNA及MMP-9蛋白的表达水平。人工麝香可能通过抑制缺血再灌注后大鼠脑组织MMP-9的表达,降低脑组织血脑屏障基底膜细胞外基质的降解和血脑屏障（BBB）的通透性,减轻脑缺血后脑水肿。     

益气活血方和补肾生髓方对局灶性脑缺血再灌注大鼠缺血半暗带Notch-1和Jagged1表达的影响

目的:探讨益气活血方和补肾生髓方对脑缺血再灌注大鼠缺血半暗带Notch-1和Jagged1蛋白表达的影响。方法:线栓法制作局灶性脑缺血再灌注大鼠模型。随机分为假手术组、模型组、益气活血方防治组和补肾生髓方防治组。脑缺血2h,分别再灌注1周、2周、3周,采用免疫组化SABC法检测Notch-1和Jagged1蛋白表达的阳性总面积和平均吸光度。结果:在缺血侧额顶叶皮质缺血半暗带,再灌注各时点,模型组Notch-1和Jag-ged1蛋白表达的阳性总面积和平均吸光度显著高于假手术组(P0.05或P0.01),2种中药复方组再灌注各时点Notch-1和Jagged1蛋白表达的阳性总面积和(或)平均吸光度显著低于模型组(P0.05或P0.01)。结论:2种复方能通过降低缺血半暗带Notch-1、Jagged1蛋白表达,抑制Notch信号转导通路。     

小鼠脑缺血时自噬相关基因5的抗损伤作用

 目的: 观察自噬相关基因5(Atg5)在小鼠脑缺血再灌注损伤中的抗损伤作用。方法: 将雄性BALB/c小鼠随机分为假手术(sham)组、缺血再灌注(I/R)组、Atg5 siRNA组和control siRNA组。I/R组采用大脑中动脉阻塞(MCAO)60 min后再灌注24 h。Atg5 siRNA组和control siRNA组将5 μL Atg5 siRNA或scrambled siRNA在MCAO前24 h侧脑室注射。实时荧光定量PCR和Western blot检测Atg5的表达;2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法检测抑制Atg5对缺血再灌注损伤后脑梗死面积和水肿率的影响;神经行为学评分法检测抑制Atg5对缺血再灌注损伤后神经症状的影响。结果: MCAO后再灌24 h,缺血半影区Atg5 mRNA和蛋白水平显著增高(P<0.05);Atg5 siRNA明显降低缺血再灌后Atg5 mRNA和蛋白的表达(P<0.05);侧脑室给予Atg5 siRNA能显著增加脑梗死面积和水肿率,并加重神经行为学损伤(P<0.05)。结论: 沉默Atg5加重小鼠脑缺血再灌损伤,提示MCAO后诱导的 Atg5 可减轻小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤。     

阿托伐他汀对大鼠缺血再灌注脑组织中NADPH氧化酶源性超氧阴离子的抑制作用

目的：脑组织在缺血再灌注的早期，超氧阴离子的大量生成加重了脑组织损伤，本实验研究阿托伐他汀对缺血再灌注脑组织保护作用的可能机制。方法:成年雄性Sprague-Dawley大鼠经线栓法阻断大脑中动脉建立脑缺血再灌注模型，再灌注前经腹腔给予阿托伐他汀（立普妥）治疗。脑梗死灶体积用四唑氮蓝染色后测量；NADPH氧化酶酶活性和超氧阴离子水平使用光泽精增强化学发光法定量测定；NADPH氧化酶膜亚基gp91phox、膜易位亚基p47phox和小GTP酶Rac-1蛋白的表达用蛋白质印迹分析。结果:缺血半暗区的NADPH氧化酶活性和超氧阴离子水平增高，于再灌注2 h达到高峰，但缺血中心区的NADPH氧化酶活性和超氧阴离子水平无明显增高。阿托伐他汀预治疗能抑制再灌注2 h后缺血半暗区的NADPH氧化酶活性和超氧阴离子增高，减少膜亚基gp91phox蛋白的表达和预防细胞质亚基p47phox蛋白易位至细胞膜。结论:阿托伐他汀对缺血再灌注脑组织NADPH氧化酶源性超氧阴离子的抑制作用，是其脑保护作用机制之一。     

肢体缺血后适应对小鼠脑缺血再灌注损伤的影响及机制

目的:建立小鼠脑缺血后进行短暂肢体缺血提高脑缺血耐受模型,确定肢体缺血后适应对脑缺血时程的影响及热休克蛋白70(HSP70)的作用,探讨肢体缺血后适应(LIPostC)对脑缺血/再灌注损伤抑制作用和机制。方法:复制小鼠大脑中动脉闭塞模型(MCAO),第1批实验将小鼠分为9组:假手术组、脑缺血/再灌注组(缺血时间分别0.5 h、1 h、1.5 h、2 h组),脑缺血/再灌注+短暂肢体缺血(LIPostC)组(0.5 h+LIPostC、1 h+LIPostC、1.5 h+LIPostC、2 h+LIPostC组)。分别观察小鼠运动行为变化;TTC染色测量脑梗死体积;HE染色观察脑组织损伤程度;TUNEL法检测神经元凋亡程度。第2批实验将小鼠随机分为4组:假手术组、脑缺血/再灌注组、MCAO+LIPostC组和MCAO+LIPostC+quercetin组(缺血时间为2 h)。术后24 h用Western blotting法检测脑皮质中HSP70蛋白表达和神经功能评分。结果:脑缺血时程影响小鼠运动行为和脑损伤程度,随脑缺血时间延长,小鼠的脑再灌注损伤程度加重,其行为缺陷和脑病理变化明显;缺血2 h组脑损伤程度比缺血1.5 h组和缺血1 h组严重(P0.05)。脑缺血后不同时间施加LIPostC显示不同程度的神经保护作用。LIPostC各组与相对应的I/R组比较,其脑再灌注损伤程度呈现不同程度减轻,行为学评分降低、脑梗死体积减小,脑皮质损伤减轻,TUNEL阳性凋亡细胞数目减少。脑缺血2 h再灌注损伤较重,但LIPostC仍具有明显的脑保护作用。以2 h脑缺血小鼠为模型进行机制研究,结果表明,LIPostC可提高缺血脑组织HSP70蛋白表达,改善神经功能,HSP70抑制剂quercetin可削弱LIPostC的这种脑保护作用。结论:LIPostC可抑制MCAO小鼠的脑缺血再灌注损伤,促进缺血脑区HSP70表达和改善神经功能。HSP70在LIPostC提高MCAO小鼠的脑缺血耐受机制中发挥重要作用。     

神经调节素治疗小鼠脑缺血再灌注损伤的机制(英)

目的：研究神经调节素-1β(NRG-1β)对小鼠脑缺血再灌注后神经行为功能、脑geng梗死体积、脑组织含水量、神经细胞凋亡以及胶质细胞水通道蛋白-4（AQP-4）表达的影响和神经保护作用机制。 方法:应用线栓法建立小鼠大脑中动脉闭塞再灌注（MCAO/R）模型,经颈内动脉微量注射NRG-1β(2 μg/kg) 干预治疗,Bederson法评价动物的神经行为功能,氯化三苯基四氮唑（TTC）染色观察脑梗死体积,干湿重法测定脑组织含水量,免疫荧光染色检测神经细胞凋亡,免疫组织化学检测AQP-4的表达。结果:脑缺血再灌注损伤后,动物均表现神经行为功能障碍,缺血侧出现脑梗塞病灶,脑组织含水量、神经细胞凋亡数量和胶质细胞AQP-4表达均高于假手术对照组。与MCAO/R组相比较,MCAO/R+NRG-1β治疗组缺血24h动物神经行为功能损伤明显改善、凋亡神经细胞数明显减少、脑梗塞体积显著缩小,P<0.05;但脑组织含水量和AQP-4表达与MCAO/R组比较无显著差异,P>0.05。缺血再灌注22 h、46 h和70 h组,上述5项指标较相应的MCAO/R组均有显著差异,P<0.05。结论:NRG-1β可能通过下调脑缺血再灌注损伤诱导的胶质细胞AQP-4表达和抑制细胞凋亡,以减轻脑水肿和缩小梗死体积,从而改善动物的神经行为功能。     

Pretreatment with simvastatin upregulates expression of BK-2R and CD11b in the ischemic penumbra of rats

Inhibitors of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductases, collectively known as statins, have been shown to minimize cerebral ischemic events in patients. We assessed the mechanisms of simvastatin pretreatment in preventing cerebral ischemia/reperfusion injury in rats using a model of middle cerebral artery occlusion (MCAO). Rats were pretreated with simvastatin 14 days prior to MCAO induction. At 3, 24, and 48 hours after reperfusion, bradykinin levels in the ischemic penumbra were assayed by ELISA, mRNA levels of bradykinin B2 receptors (BK-2Rs) and CD11b were measured by fluorescent quantitative real-time PCR (RT-PCR), and co-expression of microglia and BK-2Rs was determined by immunofluorescence. Simvastatin had no effect on bradykinin expression in the ischemic penumbra at any time point. However, the levels of BK-2R and CD11b mRNA in the ischemic penumbra, which were significantly decreased 3 hours after ischemia-reperfusion, were increased in simvastatin-pretreated rats. Moreover, the co-expression of BK-2Rs and microglia was confirmed by immunofluorescence analysis. These results suggest that the beneficial effects of simvastatin pretreatment before cerebral ischemia/reperfusion injury in rats may be partially due to increased expression of BK-2R and CD11b in the ischemic penumbra.     

小鼠脑皮质p-Akt、p53在缺血再灌后处理脑保护机制中的作用

目的 观察p-Akt、p53在小鼠局灶性脑缺血再灌注(I/R)及缺血后处理(IPO)后在脑皮质区的表达规律,探讨p-Akt、p53与IPO保护作用的关系.方法 采用线栓法制备大脑中动脉栓塞的局灶性脑缺血模型,将272只小鼠随机分为假手术(Sham)组、缺血再灌(I/R)组、PI-3K/Akt抑制剂LY294002(LY)组和缺血后处理(IPO)组.I/R组、LY组与IPO组均实施缺血90min之后再灌注,IPO组在持续再灌前采取再灌15s、缺血15s、再灌15s的循环,共3个循环.于再灌后30min、1h、3h、6h、24h、48h分别取材,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法测定脑梗死体积;免疫组织化学法观察p-Akt,p53蛋白的表达及分布;免疫印迹法检测皮质区p-Akt和p53蛋白表达量.结果 Sham组、I/R组和IPO组的非缺血脑半球皮质p-Akt有微量表达.与Sham组相比,I/R组再灌后30min缺血区皮质p-Akt增加,1h达高峰,6h逐渐降低,24h降至Sham组水平并持续;p53再灌后6h增加,24h达高峰,48h回落.各相应时间点IPO组较I/R组p-Akt增高(P＜0.05),p53降低(P＜0.05).LY组p-Akt低于I/R组(P＜0.05),p53高于I/R组(P＜0.05).顶叶脑组织的免疫印迹分析结果与免疫组织化学结果规律一致.结论缺血后处理对缺血再灌注性脑损伤有保护作用,其机制与降低p53表达及增强p-Akt表达有关.     

局灶性脑缺血预处理上调大鼠梗死区周围巢蛋白的表达

目的 观察局灶性脑缺血预处理(IP)对巢蛋白(NESTIN)表达的影响,探讨NESTIN与脑缺血耐受(BIT)的关系及可能的内源性神经保护机制.方法 45只SD雄性大鼠随机分为脑缺血预处理(CIP)组、大脑中动脉阻塞(MCAO)组、假手术(sham)组.采用TTC染色测定脑梗死体积,光镜下观察脑组织病理改变,免疫组织化...     

大鼠脑缺血再灌流后基质金属蛋白酶-2和9的表达

目的：探讨大鼠局灶性脑缺血再灌流后基质金属蛋白酶(MMP)-2和-9(MMP-9)表达的变化规律与脑水肿的关系。方法：用线栓法制作大鼠左侧大脑中动脉阻塞再灌流模型(MCAO),用免疫组化技术分别观察脑缺血再灌流不同时间点MMP-2和MMP-9的表达。结果：(1)脑缺血再灌流后24h可见MMP-2阳性细胞开始出现,3～7d时阳性细胞数达高峰,显色最深,至14d时仍有表达,略高于假手术组。(2)脑缺血再灌流后6h缺血区内MMP-9阳性细胞开始出现,12h明显增高,至2d达高峰,3d后阳性细胞数开始减少,至14d时恢复到基础水平,各相邻时间点比较差异显著。结论：脑缺血再灌流后,病变区MMP-2和MMP-9表达增加,二者在脑缺血再灌流后脑水肿方面起重要作用。