基质细胞衍生因子-1通过促进C-kit表达提高小鼠心肌干细胞增殖和迁移能力的研究

目的：探讨基质细胞衍生因子-1（ SDF-1）提高小鼠心肌干细胞（ CSCs ）增殖和迁移能力的机制。方法：从小鼠心肌中分离、培养出CSCs ,并用免疫磁珠法筛选出c-kit （＋） CSCs ,用流式细胞仪检测CSCs表面标志：干细胞因子受体c-kit、干细胞抗原Sca-1。用SDF-1及SDF-1特异性拮抗剂AMD3100干预c-kit（＋） CSCs,qPCR及Western blotting检测c-kit的mRNA和蛋白表达,用CCK-8试剂盒及transwell趋化实验检测细胞增殖和迁移能力。结果：分离、培养出的细胞经免疫磁珠筛选后,流式细胞仪检测c-kit和Sca-1表达均大于80％。 SDF-1干预后, qPCR和Western blotting 结果显示c-kit mRNA 和蛋白表达均增高, CCK-8及transwell趋化实验结果显示SDF-1干预后细胞的增殖及迁移能力明显提高,并且可以被AMD3100拮抗。结论：SDF-1通过促进c-kit表达提高c-kit（＋） CSCs的增殖及迁移能力。     

G-CSF体外诱导新生小鼠心肌干细胞分化的研究

目的了解新生小鼠心肌干细胞（cardiac stem cells，CSCs）在体外的分化潜能，为重建缺血及坏死心肌的临床应用提供依据。方法采用组织块贴壁法体外培养小鼠CSCs，以免疫磁珠细胞分离（MACS）系统纯化原代细胞。纯化所得细胞分别予4个浓度的粒细胞集落刺激因子（G—CSF）进行诱导，应用流式细胞术（FCM）、免疫荧光染色（IFS）鉴定细胞表刊，RT—PCR检测心肌转录因子GATA-4与心肌结构基因B—MHC的表达。结果由组织块培养所得的原代细胞经FCM、IFS检测证实其部分表达Sca-1和CD45。采用MACS成功得到高纯度的细胞，行FCM、IFS鉴定其表型为Sca-1＋／CD45-，RT—PCR检测显示其表达GATA-4，不表达β-MHC。纯化的细胞予诱导后培养3周，整个培养过程未见单个或成团细胞的自发搏动。诱导后3周各组细胞再次经FCM检测见Sca-1的表达均比诱导前减弱，RT—PCR检测见诱导后的细胞仍然不表达B—MHC。结论应用MACS后成功得到高纯度的表型为Sca-1＋／CD45-的CSCs；CSCs Sca-1的表达量可能随培养时间的延长而下降；G—CSF未能将CSCs诱导分化为心肌细胞。     

心肌球培养基血清浓度优化研究

目的 通过比较含有不同胎牛血清浓度的心肌球培养基分离培养大鼠心肌干细胞(CSCs)的效果,探讨最优的心肌干细胞血清培养浓度.方法 选取15只健康新生Wistar大鼠(出生1天龄),无菌条件下取出心脏,经胰酶和Ⅱ型胶原酶反复消化后,种植于培养瓶中,应用含20%胎牛血清的完全培养基培养组织块源性心脏祖细胞(CPCs),将所得的培养外植物源性细胞(EDCs)随机分为A、B、C 3组,各组5瓶细胞(25 mL塑料培养瓶),分别应用含10%、11%、15%不同浓度胎牛血清的心肌球生长培养基培养,培养至第三代CSCs时行细胞表面抗原C-kit染色,鉴定C-kit阳性CSCs占所获得细胞的比率,比较所得的细胞数量,生长周期和生长曲线.结果 从新生大鼠心肌组织中成功分离培养出CSCs,C-kit阳性率87%.培养后所得细胞数量以细胞倍增水平(PDL)表示,各组细胞PDL呈匀速递增,PDL水平和其递增速率(生长曲线所示)比较:B组>C组>A组.应用含11%胎牛血清的心肌球生长培养基培养EDCs获得的CSCs,与其他两组相比,具有生长周期短(P<0.05),生长数量多的特点(P<0.05).结论 含11%胎牛血清浓度是心肌球生长培养基培养原代大鼠心肌干细胞的最优血清培养浓度.     

新生小鼠心肌干细胞与心肌细胞共培养诱导分化试验

目的了解心肌条件培养液有无诱导心肌干细胞(cardiac stem cells,CSCs)分化为心肌细胞的作用,CSCs与心肌细胞接触能否影响CSCs向心肌分化。方法用免疫磁珠分选原代CSCs,得到纯化的c-Kit~+ CSC。分3组培养:条件液组用心肌条件培养液诱导CSCs 21 d,混合组分别用PKH 26或DAPI标记CSCs后与心肌细胞混合培养8 d,空白组无干预培养21 d,观察CSCs形态变化。各组完成培养后,用免疫组化法鉴定肌钙蛋白Troponin-T和缝隙连接蛋白connexin 43表达。结果心肌条件培养液不能有效诱导CSCs表达心肌细胞特异蛋白Troponin-T和connexin 43,未见自发搏动细胞。CSCs与心肌细胞接触后,两者同步搏动。CSCs可表达Troponin-T和connexin43。结论心肌条件培养液无诱导CSCs向心肌细胞分化的作用,心肌细胞与CSCs接触能有效诱导CSCs向心肌细胞分化。     

成人自体心肌干细胞体外高效扩增及特异性鉴定

[目的]建立一种稳定、高效的成人自体心肌干细胞体外培养扩增及特异性鉴定方法。[方法]手术中取下的心脏组织标本,通过胶原酶消化的方法获得细胞,使用自体血清进行贴壁培养和传代的方法纯化细胞,细胞增殖至3代后进行RT-PCR基因表达检测,流式细胞表面标记检测及染色体核型分析的鉴定。[结果]通过本实验的方法可以在成人心肌组织中分离和纯化心肌干细胞,并在体外可大量增殖,至3代细胞可增殖至5×107。RT-PCR鉴定其具有全能干细胞因子Nanog、Oct-4、Sox-2、Rex-1的mRNA表达,及心肌转录因子Nkx2.5和GATA4的mRNA和蛋白表达;表达间质干细胞表面标记CD29、CD90、CD105;不表达造血干细胞表面标记CD45和人免疫抗原HLA-DR;且培养后46条染色体无移位和缺失等染色体突变。[结论]通过本研究确立了一种稳定、高效的成人自体心肌干细胞体外培养,扩增和特异性鉴定的方法,为自体心肌干细胞移植技术的临床应用奠定重要的基础。     

Nestin阳性细胞在小鼠心肌组织中的表达及分布特征

[目的]了解Nestin在小鼠正常和损伤心脏组织中的表达及分布特征,探讨Nestin能否作为心肌干细胞的标志物.[方法]通过倒置荧光显微镜观察、RT-PCR和实时荧光定量PCR检测,分析Nestin在胚胎期13.5 d、出生后1d、7d、1月、3月的Nestin-GFP转基因小鼠心脏组织中的表达情况;建立小鼠心肌梗死模型,观察损伤后心肌组织中Nestin的表达情况;利用免疫荧光染色法检测小鼠心脏组织中Nestin与多种干细胞标记物的共表达关系.[结果]胚胎13.5 d Nestin表达主要集中于大脑、脊髓、视网膜等部位,但在心脏组织中也可观察到Nestin的绿色荧光,小鼠出生后Nestin的表达随着小鼠年龄的增加而逐渐减少,并且RT-PCR、Q-PCR的结果显示Nestin表达同样呈递减趋势.在梗死部位的心肌组织中可见Nestin阳性的细胞较正常组织显著增多.可见Sca-1、c-kit、Isl-1、Nkx2.5在心肌组织中广泛表达,但是未与Nestin共表达,而Nestin在正常与损伤组织均可与musashi-1、vimentin共表达.[结论]Nestin与心脏发育成熟有密切的关系,可能为神经外胚层来源的一类心肌干细胞.     

成年小鼠心脏干细胞的体外分离及表型鉴定

目的 建立稳定的小鼠心脏干细胞（cardiac stem cells,CSCs）分离方法,并对体外培养的CSCs进行生物学特性鉴定.方法 选用健康成年CD1小鼠,在无菌条件下取心脏并剪碎,并用Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶反复消化,采用差速离心法去除混合细胞悬液中的心肌细胞,结合免疫磁珠分选法纯化c-kit＋ CSCs后,进行流式细胞仪表面标记鉴定.结果 酶消化法和磁珠分选法结合成功分离并纯化了成年小鼠c-kit＋ CSCs.磁珠分选前,流式细胞仪表面标记鉴定c-kit＋ CD34-CSCs为4.62％;经磁珠分选后c-kit＋ CD34-CSCs可达70.23％.结论 酶消化法结合磁珠分选法能成功分离纯化成年小鼠c-kit＋ CSCs,且能用于后续体外培养.体外培养时c-kit＋ CSCs相对于其它表型标记的心脏干细胞更加稳定,具有较强的扩增能力.相对于心脏组织块培养法,酶消化法可在短期内获得高纯度的c-kit＋ CSCs,更有助于心脏干细胞相关信号通道的体外实验研究.     

胎儿肝脏间充质干细胞移植治疗心肌梗死的实验研究

目的:研究来源于胎儿肝脏的间充质干细胞(FMSCs)移植到大鼠心肌梗死模型中的存活及分化情况.方法:从平均胎龄为9周的胎儿肝脏中分离培养出FMSCs,将该细胞移植到大鼠梗死心脏模型中,分别于移植后第7及第14天时取出心脏,通过荧光原位杂交及免疫组化的方法检测移植细胞的存活及心肌分化情况.结果:FMSCs具有稳定的抗原表达谱,阳性表达CD29、CD44、CD166、CD105、SH3、SH4,不表达造血干细胞表面标志抗原如CD14、CD34、CD45.荧光原位杂交显示,将细胞移植到大鼠心肌梗死模型中7天后,有较多细胞在心肌组织中存活;但至移植后第14天,移植细胞从心肌组织中消失.免疫组化染色未发现存活的植入细胞发生向心肌方向的分化.结论:本实验成功分离培养出了FMSCs,将其移植到梗死心肌模型中能短暂存活,但不发生向心肌方向的分化.     

心脏干细胞在急性心肌梗死中的旁分泌作用

现代社会的快节奏生活增加了急性心肌梗死的发病率,传统的药物及介入治疗虽可改善急性心肌梗死的症状,降低其短期病死率,但病程的不可逆转最终会致患者死亡。干细胞移植治疗的出现从根本上解决了这一问题,而心脏干细胞(CSCs)作为治疗心肌梗死的治疗方法之一,它的治疗效果倍受期待。CSCs除了可分化心肌细胞、平滑肌细胞及内皮细胞外,还可通过分泌各种细胞活性因子来改善受损的心肌,并提高心脏的收缩功能,为CSCs治疗心肌梗死提供了新的角度。     

干细胞用于心脏再生的研究进展

[目的]主要综述心肌细胞的再生潜力及所涉及的可能机制的研究成果。[方法]通过心脏干细胞CSCs，造血干细胞HSCs，心肌细胞去分化与心肌再生的关系及其可能涉及的机制等各方面来综述心脏再生能力。[结果]c—kit阳性的CSCs自我更新，在试管内和活体内均可产生分化细胞；在生理状态下及损伤后c—kit阳性的CSCs都具有克隆性和多向分化的潜能。造血干细胞可以转分化并生成心肌细胞和冠状血管，用于人类的细胞疗法。去分化细胞维持和改善受损心脏的心室功能的作用十分有限。[结论]心脏干细胞CSCs和造血干细胞HSCs在扭转慢性缺血性和非缺血性心脏衰竭中发挥重要的作用。     

新生小鼠心肌干细胞培养与分化的研究

目的了解新生小鼠心肌干细胞原代和传代的培养及其分化潜能，为缺血及坏死心肌重建的临床应用提供科学依据。方法在无菌超净台中剪取新生小鼠心脏组织，经胰酶反复消化后，弃去消化液，所得剩余组织块用胶头滴管反复吹打后离心，加入培养液培养，待其长满培养瓶后进行传代，传代培养约1周可见搏动的心肌细胞，也可见成团细胞的同步收缩。结果采用改良后的方法从消化后的心肌组织块中成功培养得到原代细胞，进行免疫荧光染色、流式细胞仪鉴定其表型为c—kit、sea-1阳性的细胞，表面不表达CD34、CD8、肌球蛋白重链（MHCⅡ）。细胞经传代培养1周左右，开始出现搏动，也可见成团细胞的同步收缩。再次经免疫荧光染色、流式细胞仪鉴定其表型为c-kit、sea-1阴性，MHCⅡ阳性的细胞，仍然不表达CD34、CD8。结论在原方法的基础上，通过对其进行改良，从心脏中成功分离得到纯度更高、活性更好的心肌干细胞，其表型为c-kit^＋、sea-1^＋、CD34^-、CD8^-、MHCⅡ^-，经过传代培养之后，分化为搏动的心肌细胞，细胞表面标记变为c-kit^-、sca-1^-、CD34-、CD8^-，并表达心肌结构蛋白MHCⅡ。     

骨髓基质干细胞定向分化成心肌样细胞的基础研究

目的：骨髓基质干细胞在体外能定向分化成心肌样细胞。本研究旨在将分离出来的骨髓基质干细胞标记后注射到心壁内，观察其能否分化成心肌样细胞。方法：将骨髓基质干细胞体外培养扩增后用Brd U标记，将标记后的骨髓基质干细胞注射入结扎冠状动脉左前降支远端的大鼠左心室壁内，假手术组仅注射等量的培养液(元细胞)。结果：反复传代可获得大量纤维状的骨髓基质干细胞，Brd U对骨髓基质干细胞的标记率约为41．4l％。手术组细胞注射部位心脏组织中部分细胞内可见抗心室肌肌凝蛋白重链单克隆抗体(MHC)、抗Brd U抗体及抗心房利钠肽抗体、抗Brd U抗体双染色阳性颗粒，假手术组仅为单染色阳性颗粒。结论：移植的骨髓基质干细胞能在心脏提供的特殊微环境下分化成心肌样细胞。     

内皮祖细胞在冠心病治疗中的研究进展

近几年研究表明,成人外周血中含有与胚胎血管母细胞相似属性的骨髓源性细胞,它有分化为成熟内皮细胞的潜力,统称为内皮祖细胞(EPCs)。心肌缺血损伤后,EPCs能够归巢到心肌缺血区血管新生部位,促进其血管再生,而且它也能够分化为心肌细胞和平滑肌细胞。越来越多的实验和临床研究结果显示EPCs治疗冠心病安全可行,并且是有效的。现就EPCs的生物学特征及其在冠心病中的研究现状和面临的问题予以综述。     

胚胎干细胞移植在心肌修复中的应用

心脏疾病以高发病率和高病死率著称,严重威胁人类生存及生活质量。最近的研究显示ESC来源的心肌细胞可以在多种动物模型中修复陈旧心肌梗死。这些研究为治疗心脏疾病提供了新颖的组织工程模式。本文主要对近期在心肌损伤动物中胚胎干细胞移植的实验结果进行综述。     

胚胎心肌干细胞体外的分化※

目的鸡胚原肠胚形成期含有心肌干细胞（cardiac stem cell, CSC）的生心区原条组织离体后体外培养,使其增殖分化成具有舒缩功能的心肌组织。方法 改良滤纸鸡胚胎整体培养法取胚,37℃孵箱孵育,待胚胎发育到原肠胚的HH4期,无菌环境内选择性离体胚胎生心区原条组织（原条组织的前25%～40%）于10%FBS DMEM-F12培养基中培养,2 ～5 d后得到局部跳动的细胞组织,通过原位杂交、免疫组织化学、DiI示踪和细胞的超微结构鉴定是否分化为心肌组织。结果 FGF8特异性表达于心管和神经管;N-cadherin特异性表达于心管、神经管和体节;DiI标记的细胞迁移参与心管的形成;细胞的超微结构显示心肌组织特有的结构--闰盘。结论 CSC体外培养可以定向分化发育成心肌组织,为进一步研究心肌细胞的发育分化和生理药理学实验提供了良好的平台。     

心肌梗死后心肌组织内环境对移植干细胞心肌内存活、分化影响

近年实验研究与初步临床研究表明,包括骨髓间充质干细胞等干细胞移植治疗急性心肌梗死,可减少心肌梗死体积,促进心肌梗死区域血运重建,增加有功能的心肌细胞数量,并改善心功能,为心肌梗死的治疗开辟了一条新途径。但干细胞移植治疗心肌梗死总体疗效有限,其重要原因之一是移植干细胞在心肌内存活率低、定向分化不足。近期国内外研究证实,心肌梗死后心肌组织内环境是移植干细胞在心肌内存活、分化的重要影响因素。     

异体心肌细胞移植研究现状

心肌细胞移植为病损心脏的细胞重建及衰竭心脏的功能恢复提供了一种全新的治疗措施。目前自体心肌细胞移植研究和综述较多,异体心肌细胞移植综述则较少。异体心肌细胞移植在治疗各种心脏疾病时发挥同等重要的作用,且异体心肌细胞移植可以提供更充足的细胞源,进一步缩短治疗时间。但异体心肌细胞移植仍处在动物实验阶段,还有许多问题需待解决。