多重PCR快速鉴定鼠疫耶尔森氏菌

目的　建立鼠疫耶尔森氏菌多重PCR鉴定系统 ,用于鼠疫耶尔森氏菌的快速鉴定。方法　针对分别存在于pFra、pRst质粒上毒力基因caf1和pla ,以及一段 2 76bp染色体序列 3a分别设计引物。采用多重PCR技术 ,同时检测caf1、pla、3a三个靶序列。结果　应用该多重PCR反应体系 ,对我国鼠疫耶尔森氏菌 17个生态型及新发现的青海田鼠鼠疫疫源地菌株的多重PCR扩增结果表明 ,实验菌株中除 2株分别缺失pFra、pPst质粒而扩增出 2条产物带外 ,其余 5 2株均扩增出预期的 3条产物带 ,相关菌株均阴性 ,其检测灵敏度为 1× 10 -4ngDNA。 结论　该方法用于鼠疫耶尔森氏菌的鉴定简便、快捷 ,具有很高的特异性和敏感性 ,为鼠疫耶尔森氏菌的快速鉴定提供了有力手段     

基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR快速检测鼠疫耶尔森氏菌

目的 实现荧光定量PCR技术在鼠疫现场和基层的应用。方法 本试验将已建立的基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR方法应用于我国各鼠疫疫源地野生菌株的检测,进行特异性评价。选取分布于我国境内不同鼠疫疫源地野生鼠疫耶尔森氏菌株、鼠疫减毒菌株、耶尔森菌属近缘菌株假结核菌及小肠结肠炎菌进行荧光定量PCR检测。结果 55株鼠疫耶尔森氏菌及鼠疫减毒菌株扩增阳性,假结核耶尔森氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌无阳性扩增,冻干试剂在室温25 ℃和37 ℃条件下可保存6个月,敏感性与冷冻保存无差异,核酸扩增诊断可在1 h内完成。结论 应用基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR方法对我国各鼠疫疫源地55株鼠疫耶尔森氏菌检测呈现高度特异性,本试验冻干试剂具有可室温保存、便于运输、检测结果精准、快速等特点,具有较好的鼠疫现场应用前景。     

荧光定量PCR快速检测炭疽芽孢杆菌的实验研究

目的利用LightCycler建立一种简便、特异的实时荧光定量PCR检测方法,用于炭疽芽孢杆菌的快速检测。方法采用SYBR GreenⅠ随机掺入法,利用本实验室建立的实时荧光定量PCR反应体系,根据炭疽芽孢杆菌荚膜和水肿因子设计引物,同时检测两个毒力相关质粒的存在,检测其灵敏度和特异性,并以盲测试验进行验证;在此基础上鉴定14株炭疽芽孢杆菌,并测试该法检测土壤模拟污染标本的灵敏度,实验中设置内对照以排除假阴性结果的存在。结果炭疽杆菌基因组DNA的检测灵敏度可达每反应体系0.53pg,两个克隆株提取质粒的检测限分别为每反应体系12拷贝、140拷贝;检测14株炭疽芽孢杆菌及29株非炭疽芽孢杆菌的PCR扩增结果表明,炭疽芽孢菌DNA均出现特异的扩增结果,29株对照菌的DNA均为阴性;土壤模拟污染标本检测灵敏度可达每反应体系36个芽孢;20次重复实验结果表明其平均值与标准差为14.602±0.640。结论该方法检测炭疽芽孢杆菌具有简便、快捷、灵敏度高和特异性好的特点,为临床诊断、环境监测、卫生防疫等方面,快速检出炭疽芽孢杆菌提供了有利的手段。     

鼠疫耶尔森氏菌inv基因中IS1541的研究及应用

目的　了解鼠疫耶尔森氏菌 inv基因中 IS15 41的插入情况 ,为鼠疫耶尔森氏菌的鉴别诊断提供依据。方法　 PCR反应及 Southern杂交分析。结果　对来自不同疫源地的 5 0株鼠疫耶尔森氏菌的 inv基因中部分序列进行扩增 ,均可扩出一条长为 10 0 0 bp的片段 ,用 IS15 41作探针 ,对其进行 Southern杂交分析 ,杂交结果无差别 ,而对照菌株除假结核耶尔森氏菌扩出一条长约 30 0 bp左右的片段外 ,其它均为阴性。结论　鼠疫耶尔森氏菌 inv基因高度同源 ,其间均有 IS15 41插入 ;该方法有助于鼠疫耶尔森氏菌与其它菌株的鉴别诊断     

基于DPO引物特异性检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的PCR方法

目的 引入一种设计简易、特异性强、退火温度范围宽的双启动寡核苷酸引物（dual-priming oligonucleotide,DPO）设计,建立基于DPO引物特异性检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的PCR方法.方法 以小肠结肠炎耶尔森氏菌16S 23SrRNA基因为靶基因,设计一对DPO引物,经过PCR反应体系优化,建立小肠结肠炎耶尔森氏菌DPO-PCR检测方法.测定了检测灵敏度,以常规PCR方法作为参照,分析DP＆PCR方法的特异性及退火温度.结果 建立的小肠结肠炎耶尔森氏菌DPO-PCR检测方法的灵敏度为1.43×102 CFU/mL;与常规PCR方法相比,DP＆PCR方法在49～69℃退火温度范围内均能保持高效率扩增;特异性强,所测试17种病原菌中,仅小肠结肠炎耶尔森氏菌为阳性结果,且无非特异性扩增.结论 DPO-PCR方法不需要对引物参数特别是退火温度进行优化,特异性强,为致病微生物的快速准确检测提供了新方法.     

从动物和土壤中直接检测鼠疫耶尔森氏菌

目的　探讨用防污染的 PCR- EL ISA(U DPE)技术检测人为污染的土壤和感染的动物标本的可行性。方法　根据鼠疫耶尔森氏菌 Cafl和 Pla基因分别设计了 3条引物 ,组合成 3对引物 ,建立 U DPE检测技术。结果　利用该实验体系可以检出每克土壤中 10 0 0个鼠疫耶尔森氏菌的污染。比检测纯细菌的敏感性低 2 0 0倍 ,说明土壤中有抑制 PCR反应的因子。对 2 0只实验组动物 40份标本 (肝脏和脾脏 )的培养、U DPE和 PCR-电泳检测表明 ,3种方法的检出吻合率为 10 0 % ,均能从 40份标本中检出靶细菌 ,而用 3种方法检测对照组动物的 2 0份肝脏和脾脏均为阴性。结论　利用 UDPE技术可以被用于动物脏器中鼠疫耶尔森氏菌的检测     

广东省鼠疫静息期3种耶尔森氏菌鼠疫PCR检测

目的应用PCR试验对广东省3种耶尔森氏菌进行鼠疫的特异性基因检测。方法应用含内部对照PCR技术,以鼠疫菌特异基因fra、pla的2对引物进行PCR实验。结果假结核菌1株、11株小肠结肠炎菌O∶3、5株O∶9、1株中间型,结果全为阴性。结论该试验菌没有鼠疫菌的特异性基因fra、pla,可以进一步说明从1973～1986年雷州半岛用鼠疫IHA、RIHA从鼠类检出的阳性材料是特异的。     

随机扩增多态性DNA技术检测不同地区田鼠型鼠疫耶尔森氏菌基因结构

目的　了解不同地区田鼠型鼠疫耶尔森氏菌 (以下简称鼠疫菌 )之间的亲缘关系和基因类型。方法　随机扩增多态性DNA(RAPD)技术。结果　扩增的 13株田鼠型鼠疫耶尔森氏菌在凝胶电泳所显示的条带 ,除 3株菌缺少部分条带外 ,其余菌株基本相同。结论　青海田鼠型鼠疫耶尔森氏菌和布氏田鼠型鼠疫耶尔森氏菌具有相似性 ,在遗传学上属于同源。     

云南鼠疫耶尔森氏菌脂肪酸成分分析

目的利用脂肪酸成分分析方法获得云南鼠疫耶尔森氏菌菌株脂肪酸组成的本底资料,并建立云南鼠疫耶尔森氏菌菌株的数据库。方法选择历年来从云南不同疫源地分离到的146株鼠疫耶尔森氏菌进行了菌体脂肪酸成分分析。结果云南鼠疫耶尔森氏菌菌株的主要脂肪酸成分为16∶0酸,环式17∶0酸,3羟基14∶0酸和ω7 c16∶1酸以及十八碳单烯酸,与宋亚军等的分析结果一致,与M ID I公司Sherlock系统的菌库中的数据存在一些差异。结论建立云南鼠疫耶尔森氏菌菌株的脂肪酸组成数据库。     

胶体金标记免疫层析法检测O∶9型小肠结肠炎耶尔森菌

目的建立一种简便快速的胶体金标记免疫层析(GICA)条用于检测标O∶9血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌。方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记抗小肠结肠炎耶尔森菌单克隆抗体,以硝酸纤维膜作为抗小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体的包被载体,制成GICA检测条。被检小肠结肠炎耶尔森菌与检测卡上金标记抗体(Au-Ab)结合后,利用硝酸纤维膜的层析作用,与膜上的固相抗体结合形成可见的红色条带。结果GICA小肠结肠炎耶尔森菌检测条灵敏度可达104~105CFU/ml,与其他所选择肠杆菌科细菌均未发现交叉反应,仅与布鲁菌出现交叉。检测了50株O∶9血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌,符合率为100%。结论GICA小肠结肠炎耶尔森菌检测条对小肠结肠炎耶尔森菌特异性强;简便快速,不需任何仪器设备;结果易于判断,可望用于标本快速筛查。     

嗜水气单胞菌实时荧光三重TaqMan PCR快速检测体系的建立

目的 建立针对嗜水气单胞菌的高灵敏、高特异的实时荧光三重TaqMan聚合酶链式反应（PCR）快速检测体系。方法 根据嗜水气单胞菌的16S rDNA、气溶素基因（aerA）和丝氨酸蛋白酶基因（ahp）的特异性序列设计引物及TaqMan探针,利用高通量实时荧光PCR检测平台探讨该检测体系的灵敏度;用29种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌评价该检测体系的特异性。 结果 实时荧光三重TaqMan PCR快速检测体系对嗜水气单胞菌重组质粒的检测灵敏度为1×102拷贝/反应体系;对嗜水气单胞菌基因组的检测灵敏度为5×10-2 pg/反应体系;该体系的特异性引物探针在检测29种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌时未出现假阳性,整个反应在2h内完成。 结论 本研究建立的实时荧光三重TaqMan PCR检测体系可作为嗜水气单胞菌灵敏、特异、快速的检测方法,并同时评价嗜水气单胞菌的致病潜力。     

阪崎肠杆菌实时荧光双重TaqMan PCR快速检测体系的建立

目的建立针对阪崎肠杆菌的高灵敏、高特异的实时荧光双重TaqMan聚合酶链式反应（PCR）快速检测体系。方法根据阪崎肠杆菌基因组16SrRNA～23SrRNA的内部转录间隔区（ITS）基因和外膜蛋白A（OmpA）基因的特异性序列设计引物及TaqMan探针,利用高通量实时荧光PCR检测平台探讨该检测体系的灵敏度;用50种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌评价该检测体系的特异性。结果实时荧光双重TaqMan PCR快速检测体系对阪崎肠杆菌重组质粒的检测灵敏度为1×102拷贝/反应体系;对阪崎肠杆菌基因组的检测灵敏度为4×10-1pg/反应体系;该检测体系在检测50种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌时未出现特异性扩增,整个反应在2h内完成。结论本研究建立的实时荧光双重TaqMan PCR检测体系可作为阪崎肠杆菌灵敏、特异、快速的检测方法,并同时检测阪崎肠杆菌的致病力。     

四种单增李斯特菌常用核酸检测方法的评价与应用

目的 应用聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光PCR(Real-time PCR)、环介导等温扩增(LAMP)和多交叉置换扩增(MCDA)4种核酸检测方法,对单增李斯特菌进行检测,探索特异、灵敏、高效,且适用于肉类样本中单增李斯特菌检测的核酸检测方法。方法 比较文献报道的以单增李斯特菌特异性基因lmo0733作为靶标的4种核酸检测方法,评价这4种方法在特异性、灵敏度、检出速率方面的差异,并应用于单增李斯特菌模拟样本和猪肉样本中单增李斯特菌的检测。结果 传统PCR、Real-time PCR、LAMP和MCDA方法都能准确检测单增李斯特菌,其中MCDA方法检测下限为10 fg/反应,且能在30 min内完成对样本核酸的检测,灵敏度和检出速率优于其它3种核酸诊断方法;MCDA方法对于模拟样本和实际样本的检测效率优于其它3种核酸检测方法和传统分离培养方法,能够提高样本检测的阳性率。结论 MCDA方法作为一种特异、灵敏和高效的核酸检测方法,可用于肉制品中单增李斯特菌检测时的快速筛查,并能提高传统分离培养方法对标本中单增李斯特菌的阳性检出率。     

一种选择敏感培养基对腐败材料检测鼠疫耶尔森氏菌检测的应用效果北大核心CSCD

目的研制并筛选适合从腐败材料分离鼠疫菌的选择敏感培养基,对其性能进行评价。方法以自制赫氏消化液为基础,加入刺激鼠疫菌和抑制杂菌生长的生化试剂配制成2种选择敏感培养基,以常见致病菌株、耶尔森氏菌属中与鼠疫菌近源的假结核耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌评估2种培养基的敏感性和特异性;应用以上培养基分离野外腐败动物材料的鼠疫菌,评价几种选择培养基的应用效果。结果1号培养基(4%十二烷基硫酸钠选择培养基)对鼠疫菌检测的特异性高、敏感性强,培养24 h鼠疫菌发育为典型成熟菌落,应用该培养基从腐败动物材料中分离鼠疫菌阳性检出率与龙胆紫选择培养基一致。结论4%十二烷基硫酸钠选择培养基分离鼠疫菌效果优于龙胆紫选择培养基,可用于野外腐败动物材料的鼠疫菌快速检验。     

中东呼吸综合征冠状病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种快速、敏感、特异的实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法,用于中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的检测。方法根据中东呼吸综合征冠状病毒S蛋白基因的保守序列设计并合成一对引物及一条特异性TaqMan探针。通过条件优化,以10倍系列稀释重组质粒为标准品,进行Real-time PCR扩增,绘制标准曲线,并进行重复性、准确性、特异性及敏感性检测。结果建立的Real-time PCR方法检测中东呼吸综合征冠状病毒所绘制标准曲线的相关系数0.99,灵敏度为1.00×101拷贝,高于常规PCR方法(1.00×102拷贝);用该方法检测中东呼吸综合征冠状病毒基因为阳性,其他6种对照呼吸道病原体及冠状病毒基因检测均呈阴性;批内、批间重复试验的变异系数均1%。结论建立的中东呼吸综合征冠状病毒Real-time PCR检测方法灵敏、特异、重复性好,可用于中东呼吸综合征冠状病毒感染的快速诊断和流行病学调查。     

实时PCR在大肠杆菌O157∶H7快速检测中的应用

目的建立一种快速、敏感、特异的大肠杆菌O157∶H7的定量检测方法。方法根据GenBank公布的O157∶H7大肠杆菌rfbE基因序列,应用分子生物学软件进行序列比对,在该基因的保守区设计引物和TaqMan探针,对荧光定量PCR反应条件进行优化,建立实时荧光定量PCR检测大肠杆菌O157∶H7的反应体系,并对该法的特异性、敏感性和重复性进行了评价。结果所有大肠杆菌O157∶H7菌株的检测结果均为阳性,而所有其它菌株检测结果均为阴性;该方法检测的灵敏度可达1cfu/μL,重复性检测的变异系数均小于5%。在模拟污染牛奶中,可检出1×102cfu/μL的细菌。从细菌核酸提取至完成检测约需3h。结论本研究建立的基于Taqman探针技术的实时PCR检测体系具有快速、灵敏度高、特异性强等优点,可用于大肠杆菌O157∶H7食物中毒的快速诊断和食品微生物检测,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

细粒棘球绦虫TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的 为建立高效、特异的细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)检测方法。方法 本研究设计了一组基于Eg线粒体基因的特异性引物和TaqMan探针,通过反应体系及条件的优化,建立了Eg荧光定量PCR检测方法。结果 该方法线性关系好,灵敏度高,在10⁹~10²拷贝/μL相关系数达0.998,灵敏度达10²拷贝/L;在特异性试验中,与其他病原虫株无交叉反应,特异性较好;重复性试验变异系数均低于3%。应用该方法对50份临床样品进行检测,发现6份为Eg感染阳性。结论 由此可见,建立的荧光定量PCR方法可快速、灵敏、特异地检测细粒棘球绦虫,具有一定的实际应用价值。     

TaqMan-MGB荧光定量PCR快速检测结核分枝杆菌katG基因突变

目的 建立一种特异、灵敏、快速检测结核分枝杆菌katG基因突变的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。方法 根据结核分枝杆菌katG基因主要发生315位点突变的特点,设计一对特异性TaqMan-MGB探针和引物,通过反应条件优化,建立荧光定量PCR方法;用克隆到PMD18-T载体上katG基因阳性标准品及不同菌株来评价该方法的特异性、敏感性和重复性。结果 灵敏度高,检测目的基因的最低检测下限10copies/μl,比常规PCR灵敏高100倍;特异性高,检测16株非结核分枝杆菌标准株和7种常见呼吸道感染细菌的标准株均为阴性;与测序法相比,野生型和突变型探针的敏感性和特异性均为100%。重复性好,批内批间CT值变异系数均小于1%。结论：TaqMan-MGB荧光定量PCR的方法能特异、灵敏、快速检测结核杆菌菌株katG 315位点突变。     

TaqMan-rRT-PCR检测猪霍乱沙门菌方法的建立和实验室评价

目的 基于猪霍乱沙门菌血清型特异性基因,建立TaqMan逆转录实时聚合酶链反应(TaqMamrRT-PCR)检测猪霍乱沙门菌的方法.方法 利用基因组序列比对筛选到猪霍乱沙门菌特有的基因SC0358,通过普通PCR及利用多种血清型沙门菌及非沙门菌菌株共计145株,评价该方法的菌株特异性,针对该基因设计TaqMan-rRT...