缺氧对培养的猪肺动脉内皮细胞胞浆游离钙的影响

本文应用荧光探针Fura-2/AM测定胞浆游离钙浓度([Ca~(2+)]i)技术,观察培养的猪肺动脉内皮细胞[Ca~(2+)]i在缺氧时变化。实验发现:向细胞悬液中充氮气造成缺氧时,肺动脉内皮细胞[Ca~(2+)]i升高81±21%(P<0.05,n=8)。结果提示肺动脉内皮细胞钙信使系统可能参与缺氧所致血管反应。     

H_2S抑制ATP诱导的大鼠小胶质细胞活化及IL-1β的释放

目的:观察硫化氢(H_2S)供体硫氢化钠(Na HS)对三磷酸腺苷(ATP)损伤的大鼠小胶质细胞通透性、胞内Ca~(2+)浓度([Ca~(2+)]_i)及IL-1β释放的影响,探讨H_2S对ATP-P2X嘌呤信号通路的作用及其神经保护的分子机制。方法:取对数期形态结构及生长分化良好的大鼠小胶质细胞用于实验。Fura-2/AM荧光染料检测各组[Ca~(2+)]_i,细胞内YO-PRO-1荧光强度检测以反映膜的通透性,ELISA检测ATP-细菌脂多糖(LPS)激活的大鼠小胶质细胞IL-1β的释放水平。结果:随着ATP浓度的增加,大鼠小胶质细胞内YO-PRO-1的荧光强度显著增加,而给予Na HS预处理后细胞膜通透性明显降低,对YO-PRO-1的摄取明显减少(P0.05),胞内荧光强度明显减弱(P0.05)。ATP处理大鼠小胶质细胞引起[Ca~(2+)]_i迅速升高后缓慢下降形成持续时间较长的平台期。Na HS预处理虽不能改变[Ca~(2+)]_i的峰值,但可抑制平台期的形成(P0.05)。ATP与LPS联合作用可促进大鼠小胶质细胞IL-1β的生成和分泌,而Na HS预处理可明显逆转这一效应(P0.05)。结论:Na HS可降低ATP诱导的大鼠小胶质细胞膜通透性、Ca~(2+)内流和IL-1β释放,抑制该细胞的激活,提示嘌呤信号通路可能介导H_2S的细胞保护作用。     

CaMK Ⅱ活性对H_2O_2所致SK-N-SH细胞氧化应激损伤的影响

目的:评价钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)活性对过氧化氢所致人源性神经母细胞瘤细胞氧化应激损伤的影响。方法:SK-N-SH细胞生长至对数期时,接种于96孔培养板或6孔培养板,采用随机数字表法,将其分为4组:正常对照组,培养基中添加H_2O_2组(H_2O_2组),培养基中只添加CaMKⅡ活性抑制剂KN93组(KN93组),培养基中同时添加H_2O_2和KN93组(H_2O_2+KN93组),倒置显微镜观察细胞形态学,采用CCK-8法测定细胞活力,采用Fura-2/AM荧光法检测细胞内Ca~(2+)浓度([Ca~(2+)]_i),采用免疫印迹测定CaMKⅡ和磷酸化CaMKⅡ的表达,采用RT-PCR法检测CaMK mRNA表达。结果:与正常对照组比较,H202组细胞体呈圆形的细胞和脱落细胞增加,细胞突起长度缩短,细胞存活率降低,[Ca~(2+)]_i升高,磷酸化CaMKⅡ表达上调,CaMKⅡmRNA表达下调。与H_2O_2组比较,H_2O_2+KN93组脱落细胞明显减少,突起变长,细胞存活率增加,[Ca~(2+)]_i降低,磷酸化CaMKⅡ表达下调,CaMKⅡmRNA表达水平上调。结论:CaMKⅡ增强了H_2O_2诱导的人源性神经母细胞瘤细胞氧化应激损伤。     

TLSFJM对活化T细胞内IP3,Ca^2＋水平和Fos蛋白表达的调节作用

本文应用ABC组化染色、Fura-2/AM标记细胞Ca~(2+)测定法以及阴离子交换树指层析柱分离磷酸肌醇等技术,研究了TLSF_(JM)对活化T细胞内IP3、Ca~(2+)水平以及Fos蛋白表达的调节作用。结果表明,TLSF_(JM)明显抑制PHA活化的PBMC Fos蛋白表达,并对T细胞内IP3、Ca~(2+)水平也有很强的抑制作用。     

异莲心碱对小鼠离体气管平滑肌的舒张作用

目的:研究异莲心碱对高K~+预收缩小鼠离体气管平滑肌(ASM)的舒张作用及其机制。方法:利用张力换能器检测异莲心碱对高K~+诱导的ASM预收缩和Ca~(2+)内流的影响;利用膜片钳技术和钙成像系统分别检测异莲心碱对ASM细胞膜L型电压依赖性Ca~(2+)通道(LVDCC)电流以及细胞内Ca~(2+)浓度([Ca~(2+)]_i)的影响。结果:异莲心碱可显著舒张高K~+预收缩的ASM,且其舒张作用呈现浓度依赖性,当浓度为100μmol/L时最大舒张比达到(95.3±3.9)%。此外,利用膜片钳全细胞记录技术测量LVDCC电流,电流可被异莲心碱完全阻断;在高K~+诱导下气管平滑肌细胞中Fura-2的340/380 nm荧光比值稳定在0.63±0.10,而异莲心碱加入后比值显著下降至0.36±0.05(P0.01);在[Ca~(2+)]_i峰点加入异莲心碱,340/380 nm荧光比值从0.74±0.02迅速降至0.42±0.05(P0.01);异莲心碱抑制高K~+诱导的Ca~(2+)内流引起的ASM收缩。结论:异莲心碱可阻断小鼠离体气管平滑肌细胞LVDCC电流,LVDCC介导的Ca~(2+)内流停止,[Ca~(2+)]_i降低,导致ASM舒张,提示异莲心碱可能是潜在的气管舒张剂。     

去甲肾上腺素调控巨噬细胞Ia抗原表达的钙依赖性

用Fura-2作为荧光探针测定大鼠腹腔巨噬细胞(RPMφ)的细胞内Ca~(2+)浓度([Ca~(2+)]i),用APAAP 桥联酶标法检测RPMφ表面Ia 抗原的表达。结果表明,在细胞外液体不含钙的条件下,10~(?)mol/L的去甲肾上腺素(NE)能使RPMφ的[Ca~(2+)]i 显著升高(P<0.01),使RPMφ表面的Ia 抗原(I-A和I-E)表达显著增加(P<0.01)。磷脂酶C 抑制剂新霉素(2.5mmol/L)本身对RPMφ由的[Ca~(2+)]i 无明显影响,但却能阻断NE 增高RPMφ的[Ca~(2+)]i 的作用,同时也阻断了NE 增加RPM 由表面Ia抗原表达的作用.提示NE 调控巨噬细胞Ia 抗原表达的作用是钙依赖性的,NE 这种作用的细胞内信号转导,则有赖于肌醇脂质信使系统。     

用Fura-2测量单核细胞胞浆游离钙浓度的方法

进入八十年代以来,由于人们对细胞内Ca~(2+)研究的深入,迫切希望有较为可靠的胞浆游离Ca~(2+)浓度([Ca~(2+)]i)测定方法。八十年代以前的众多方法由于存在这样或那样的缺陷,使得[Ca~(2+)]i的精确测定始终未能得到解决。     

PAR-1对动员肺巨细胞癌PLA801D/PLA801C细胞内Ca~(2+)的作用

目的 通过研究PAR-1对肺巨细胞癌细胞高、低转移细胞株PLA801D和PLA801C[Ca~(2+)]I的影响,探讨PAR-1参与调节肺癌细胞转移相关功能的分子机制.方法 激光共聚焦显微镜检测PLA801D和PLA801C细胞[Ca~(2+)]I;将反义和正义PAR-1分别转染至PLA801D(D-)和PLA801C(C+)中;用thrombin和TRAP激活PAR-1,观察PAR-1对D-和C+的[Ca~(2+)]I影响.结果 PLA801D(荧光强度59.55,下同)和PLA801C(35.46)细胞之间的平均[Ca~(2+)]I差异有统计学意义(P<0.01).C+的[Ca~(2+)]I(45.77)明显高于其对照组CV(35.46,P<0.05),D-的[Ca~(2+)]I(48.42)明显低于对照组DV(59.55,P<0.05).C+和CV的[Ca~(2+)]I分别在加入thrombin 80 s和100 s后荧光强度分别达峰值48.19±9.84和45.64±9.87(P<0.05);二者均在加入TRAP60 s后达峰值,分别为111.31±25.00和52.93±11.21(P<0.05).D-和DV的[Ca~(2+)]I在加入thrombin 60 s后达峰值,分别为40.71±5.89和61.07±21.36(P<0.05),二者均在加入TRAP 40 s后达峰值,分别为84.98±11.23和102.58±21.48(P<0.05).结论 PLA801D和PLA801C的转移潜能可能与其细胞的[Ca~(2+)]I有关.激活PAR-1能够上调PLA801D和PLA801C的细胞内Ca~(2+)信号.PAR-1促进肺巨细胞癌转移的机制与上调细胞内Ca~(2+)有关.     

三磷酸肌醇亦可使三磷酸肌醇敏感性钙通道失活

许多细胞外信号通过1,4,5-三磷酸肌醇(IP_3)激活细胞钙贮池膜钙通道使内钙释放和胞浆游离钙浓度[Ca~(2+)]i增加。生理条件下[Ca~(2+)]i不会持续升高,其机制除有细胞膜钙ATP酶作用外,同钙通道失活也有关。曾认为,Ca~(2+)-钙调蛋白复合物及Ca~(2+)可致通道失活,但本实验提示:IP_3本身也     

大麻素抑制背根节神经元ATP诱发的[Ca~(2+)]i升高

目的:观察大麻素对背根节神经元ATP诱发的[Ca~(2+)]i升高的影响及机制。方法:培养SD大鼠背根节神经元,采用激光共聚焦技术检测培养神经元[Ca~(2+)]i的变化。结果:ATP(100μmol/L)经P2X受体介导可导致培养的背根节神经元[Ca~(2+)]i增高(P0.05);大麻素受体激动剂CP55940预孵育10 min可剂量依赖性地抑制背根节神经元ATP所致的[Ca~(2+)]i升高(P0.05);CB1受体(cannabinoid receptor 1,B1R)的拮抗剂AM251(10μmol/L)、CB2受体(Cannabinoid receptor 2,CB2R)的拮抗剂AM630(10μmol/L)均可显著降低CP55940(1μmol/L)的抑制效应(P0.05);腺苷酸环化酶激动剂Forskolin(10μmol/L)可逆转CP55940对ATP的抑制作用(P0.05)。结论:CP55940可显著抑制背根节神经元ATP诱发的[Ca~(2+)]i升高,CP55940的抑制效应可能是由CB1、CB2受体介导抑制背根节神经元PKA活性所致。     

Klotho蛋白减轻低氧/复氧诱导的心肌细胞系H9C2损伤

目的研究Klotho蛋白对低氧-复氧诱导的心肌H9C2细胞系损伤的保护作用及其机制。方法将H9C2心肌细胞分为对照组、低氧/复氧组(1%O_2低氧6 h, 5%CO_2以及95%空气培养箱中复氧2 h)和Klotho蛋白(10μg/mL)干预组。通过酶标仪间接测定细胞内钙离子([Ca~(2+)]_i)水平;CCK8法和TUNEL法分别检测细胞活性及细胞凋亡;分光光度法检测细胞中钠ATP酶(Na~+/K~+-ATPase,NKA)和反向模式钠/钙交换体(Na~+/Ca~(2+)-exchange,NCX)的活性。结果体外培养的H9C2细胞低氧/复氧(6 h/2 h)处理后可明显降低H9C2细胞活性(P0.05);增加细胞内Ca~(2+)水平和凋亡率(P0.05);降低细胞中Na~+/K~+-ATPase的活性(P0.05);增加反向模式Na~+/Ca~(2+)交换体的活性(P0.05);10μg/mL Klotho蛋白处理可明显减轻上述损伤。结论 Klotho蛋白可减轻低氧/复氧诱导下的H9C2细胞内钙超载,最终减少该细胞系细胞的凋亡。     

TRPC1/ORAI1复合体调节HUVECs SOC和ROC介导的Ca~(2+)内流和NO生成

目的研究瞬时受体电位通道1(TRPC1)/钙释放激活钙通道调节分子1(ORAI1)复合体在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)钙池操纵性钙通道(SOC)和受体操纵性钙通道(ROC)介导Ca~(2+)内流和NO生成中的作用。方法取2~3代HUVECs,将构建的TRPC1和ORAI1干扰质粒分别转染入HUVECs。用激光共聚焦显微镜观察细胞转染效果,real-time PCR和Western blot检测TRPC1、ORAI1 mRNA和蛋白的表达及抑制效率。细胞随机分组:特异性质粒转染组即实验组,未转染组即空白对照组及空质粒组(vehicle组),将上述3组细胞分别与CaR激动剂、ROC模拟剂TPA+CaR负性变构调节剂Calhex231、蛋白激酶C(PKC)抑制剂Ro31-8220、经典型PKCs和PKCμ抑制剂Go6967孵育,用荧光探针Fura-2/AM及DAF-FM负载方法同步检测[Ca~(2+)]i和NO。随后将构建的TRPC1和ORAI1干扰质粒同时转染入HUVEC,与CaR激动剂孵育后检测[Ca~(2+)]i和NO,用免疫共沉淀法检测TRPC1和ORAI1的相互作用。结果 1)与对照组相比,TRPC1及ORAI1组,mRNA和蛋白表达均明显降低(P0.05);2)在4种不同处理作用下,TRPC1及ORAI1转染组中细胞内Ca~(2+)浓度变化值和NO净荧光强度值均明显降低(P0.05);3)与对照组及单转染TRPC1及ORAI1组比,共转染组细胞内Ca~(2+)浓度变化值和NO净荧光强度值均明显降低(P0.05);4)TRPC1与ORAI1相互作用形成复合体,且在CaR激动剂的剌激下相互作用增强。结论 TRPC1与ORAI1复合体共同调节CaR经SOC和ROC激活介导的Ca~(2+)内流和NO生成。     

神经细胞损伤与细胞钙稳态失调

神经细胞损伤与细胞内Ca~(2+)稳态失调的关系,是目前神经科学和毒理学共同关注的研究课题之一。本文从方法学角度比较了测定细胞内Ca~(2+)浓度([Ca~(2+)]_i)的主要技术,综述了近3～4年该工作的最新进展。     

活性氧簇介导血管紧张素Ⅱ对延髓神经元胞内游离Ca~(2+)水平的调节作用

目的:探讨活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)介导血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)对延髓神经元胞内游离Ca~(2+)的调节作用及其机制。方法:原代培养延髓神经元;免疫荧光双标法鉴定培养神经元的特征;给予Ang Ⅱ处理后,用二氢乙啶荧光探针法测定神经元ROS水平;同时或单独给予Ang Ⅱ和NADPH氧化酶抑制剂apocynin或自由基清除剂TEMPOL后,Fura-2/AM钙瞬变法记录神经元胞内游离Ca~(2+)的水平;CCK-8法检测神经元活性。结果:原代培养的延髓神经元多数为谷氨酸阳性的神经元;Ang Ⅱ(5μmol/L)可在10 min内显著升高神经元ROS水平(P0.01);给予Ang Ⅱ处理后延髓神经元胞内Ca~(2+)水平显著升高(P0.01);给予apocynin/TEMPOL预处理后,Ang Ⅱ引起的延髓神经元胞内Ca~(2+)的升高则被抑制(P0.05)。实验浓度的Ang Ⅱ对神经元无毒性作用。结论:ROS介导Ang Ⅱ诱导的延髓神经元胞内Ca~(2+)的升高作用,可能是Ang Ⅱ在中枢诱导氧化应激作用的潜在细胞内信号机制。     

缺氧时肺动脉内皮细胞对平滑肌细胞胞浆游离钙的影响

本文应用Ca~(2 ) 荧光探针Fura-2/AM,研究猪肺动脉内皮细胞条件培养液对猪肺动脉平滑肌细胞胞浆游离钙浓度([Ca~(2 )]_i)的影响;同时观察缺氧对肺动脉内皮细胞[Ca~(2 )]_i的直接作用。实验发现:1.常氧培养的内皮细胞培养液可使平滑肌细胞[Ca~(2 )]_i升高,而缺氧培养的内皮细胞培养液较常氧培养的内皮细胞培养液作用显     

内毒素所致DIC时血小板胞浆Ca^2＋浓度变化的研究

本实验观察内毒素在体外对兔血小板胞浆游离钙浓度[Ca~(2+)]i的作用以及用二次注射内毒素法复制DIC模型时对[Ca~(2+)]i的影响。结果表明静息血小板[Ca~(2+)]i为112±24 nM,内毒素可直接作用于血小板,使[Ca~(2+)]i呈剂量依赖性升高。内毒素致DIG时(Ca~(2+)]i可升高三倍。结果提示内毒素可能是通过升高血小板[Ca~(2+)]i而激活血小板。血小板的激活可能是导致DIC的重要发病机制之一。     

ATP处理导致PC12细胞通透性变化及NaHS的干预作用

目的:观察NaHS(H_2S供体)对ATP(三磷酸腺苷)诱导的PC12细胞存活率及膜通透性变化的影响,探讨H_2S对抗ATP致伤作用的可能机制。方法:高分化PC12细胞置于含有高浓度ATP的培养基中3 h制备细胞损伤模型。在ATP处理前30 min,把NaHS或CBX(生胃酮,Pannxin-1通道阻滞剂)加入培养基中,作为预处理。用CCK-8检测细胞存活率,Fura-2/AM荧光染料检测细胞[Ca~(2+)]_i,YO-PRO-1或Lucifer Yellow(荧光黄)荧光染料检测RFU(胞内相对荧光单位),研究NaHS干预后细胞存活率和膜通透性的变化。结果:ATP(3、5mmol/L)处理使PC12细胞存活显著降低,NaHS(200μmol/L)和CBX(10μmol/L)预处理均可显著拮抗ATP(3 mmol/L)诱导的细胞存活率下降。ATP(3、5 mmol/L)可使PC12细胞内[Ca~(2+)]_i明显增加,而NaHS(200μmol/L)和CBX(10μmol/L)预处理可使ATP(3 mmol/L)诱导的胞内[Ca~(2+)]_i的增幅明显降低。ATP(3、5mmol/L)使PC12细胞对YO-PRO-1和Lucifer Yellow通透明显增加,而NaHS(200μmol/L)和CBX(10μmol/L)预处理可显著阻遏ATP诱导的膜通透性增加。结论:Pannxin-1蛋白在ATP诱导PC12细胞膜孔形成中有重要作用,干预膜孔形成可能是NaHS拮抗ATP损伤作用的机制之一。     

内毒素诱导血小板磷脂酰肌醇代谢和胞浆[Ca~(2+)]i的变化研究

磷脂酰肌醇(PIP_2)的分解产物IP_3和DG是细胞内重要信使,IP_3可使胞浆内贮Ca~(2+)释放,引起胞浆[Ca~(2+)]i升高、DG参与PKC的激活。DG生成后被迅速转化为磷脂酸(PA)。本研究从PIP_2代谢变化角度探讨内毒素(ET)引起血小板胞浆[Ca~(2+)]i的变化机理。实验将人血小板制成悬液、用无载体~(32)p标记、薄层层析分离脂质、放射自显影及液闪测定PA的cpm,以与     

降钙素基因相关肽对大鼠胃平滑肌的调控作用

目的:探讨降钙素基因相关肽(CGRP)对大鼠胃平滑肌的调控作用。方法:贴块法原代培养大鼠胃平滑肌细胞,特异性平滑肌肌动蛋白α-actin免疫细胞化学鉴定。实验分CGRPⅠ组(10~(-7)mol/LCGRP)、CGRPⅡ组(10~(-8)mol/L CGRP)、CGRPⅢ组(10~(-9)mol/L CGRP)和干预组(10~(-6)mol/LCGRP 8-37)与空白对照组。图像分析系统测定大鼠胃平滑肌细胞长度;Ca~(2+)荧光指示剂测定细胞内Ca~(2+)浓度;CellTiter-Glo~试剂盒检测细胞内ATP含量。结果:CGRP可舒张胃平滑肌细胞,降低胃平滑肌细胞游离Ca~(2+)浓度及ATP含量。结论:CGRP通过受体介导直接参与胃平滑肌细胞松弛;CGRP可能通过降低胃平滑肌细胞游离Ca~(2+)浓度、ATP含量而发挥其调控作用。     

分离的成年大鼠心肌细胞在缺氧及复氧过程中胞浆游离钙的变化

为了深入探讨钙在心肌缺氧及复氧损伤中的作用,本工作采用Fura-2荧光测钙技术,观测了分离的成年大鼠心肌细胞在缺氧及复氧过程中胞浆游离钙[Ca~(2 )]_i的变化。用酶法分离大鼠心肌细胞,然后Fura-2/AM负载。