临床病毒性脑炎标本的博尔纳病病毒核酸检测

目的 探讨临床病毒性脑炎(viral encephalitis,VE)患者与博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)感染的关系,分析BDV感染的病毒性脑炎患者临床特征.方法 用荧光定量巢式逆转录聚合酶链反应(FQ-nRT-PCR)方法检测病毒性脑炎患者及非感染性疾病施行蛛网膜下腔阻滞麻醉的手术患者脑脊液单个核细胞(cerebrospinal fluid mononuclear cell,CSFMC)中BDV p24基因片段,同时用β-肌动蛋白(β-actin)作为内参照,脑脊液(CSF)阳性标本基因测序分析并总结出临床特征.结果 32例病毒性脑炎脑脊液标本BDV p24基因片段检出率为12.5%(4/32),拷贝数＞102/μl.对其中一份CSF阳性标本测序后,与BDV标准病毒株Ⅴ和马源的BDV病毒株H1766序列比较同源性分别为95.35%和98.84%.在4个位点出现基因突变(nt1649 T→C、nt1656 G→A、nt1670 C→T、nt1676 C→T).该目的基因片段与马源的BDV病毒株亲缘关系最近.阳性脑炎患者主要以精神行为异常为临床特征.结论 贵州省遵义市部分病毒性脑炎的发生与BDV感染有关,主要以精神行为异常为临床特征.     

新疆伊犁地区动物脑组织博尔纳病病毒p24基因片段的检测

目的 了解新疆伊犁地区动物脑博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)感染现状,分析该病毒的种系来源,预防我国BDV大规模暴发流行.方法 采用巢式逆转录实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)的方法,对新疆地区200匹马、75头驴和100只牧羊犬脑组织标本进行BDVp24基因片段的检测.并对阳性标本进行BDV p40基因片段扩增电泳,同时排除GFP-p24和pMD-19质粒污染,最后克隆测序,进行基因同源性和氨基酸序列分析并分析BDV种系发生.结果 3例伊犁马、4例伊犁驴和9例牧羊犬的脑组织标本BDV p24检测阳性,阳性率分别为1.5%、5.3%、9.0%;BDV p40基因片段检测和质粒标准品GFP-p24、pMD-19检测均为阴性;BDV p24扩增产物序列与He/80株的同源性为100%.结论 新疆伊犁地区马、驴和狗可能存在BDV脑内的自然感染,该地区BDV流行株与He/80株存在同源性.     

博尔纳病病毒ORFⅠ基因中部片段的检测

目的　通过对中国神经精神病人外周血单个核细胞 (PBMC)中博尔纳病病毒 (BDV)ORFⅠ中部片段的检测 ,了解BDVORFⅠ基因中部片段是否为检测BDV感染敏感的标记物。方法　用套式逆转录聚合酶链反应 (nestedRT PCR)同时检测 60例BDV感染阳性或阴性的神经精神病人以及 60例健康献血者的PBMC中BDVORFⅠ (P40 )基因中部片段。结果　 4例BDV感染阳性的神经精神病人的检测结果均为阳性。结论　该研究结果提示 ,感染人体的BDV在病毒ORFⅠ基因片段的中间部分存在着高度的保守性 ,该片段可能是证实BDV感染的另一敏感性的标记物     

感染人体的博尔纳病病毒ORFⅠ基因前部片段的检测

目的感染人体的博尔纳病病毒（ＢＤＶ）第一开放阅读框架（ＯＲＦⅠ）基因前部片段的检测至今尚未见报道。通过对先期实验已证实存在ＢＤＶ感染的人体标本和来源于感染动物的病毒标准品进行检测，拟了解感染人和动物的该病毒片段是否存在差异。方法用套式逆转录／多聚酶链反应（ｎｅｓｔｅｄＲＴ－ＰＣＲ）同时检测１２例ＢＤＶ感染的精神病人和健康献血者的周围血单核细胞和１００ｐｇ／μｌ的ＢＤＶ－ＭＤＣＫ标准病毒株中ＢＤＶＯＲＦⅠ（ｐ４０）基因前部片段。结果１２例人体标本的检测全部呈阴性，而病毒标准品呈阳性结果。结论该研究结果提示，感染人体的ＢＤＶ与来源于动物的ＢＤＶ相比较可能在病毒ＯＲＦⅠ基因片段的前面部分存在着较大的变异或前部片段缺失。该现象值得今后进一步研究。     

抗博尔纳病病毒核蛋白单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备并鉴定鼠抗博尔纳病病毒核蛋白单克隆抗体。方法重组核蛋白免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行常规融合,用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤并进行有限稀释法克隆和亚克隆,建立分泌抗核蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,纯化单克隆抗体并进行效价测定和特异性鉴定。结果建立了1株能稳定分泌抗核蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为2F6E8,重链为IgG2a,轻链为κ。ELISA法测得腹水的效价高达1∶32 000以上。Western-blot和间接免疫荧光实验证实该单克隆抗体能特异性结合重组核蛋白及天然核蛋白。结论成功制备了效价高、特异性好的抗核蛋白单克隆抗体,为建立博尔纳病病毒血清免疫学检测方法奠定了基础。     

博尔纳病病毒感染对新生大鼠脑内单胺类受体基因转录的影响

目的分析博尔纳病病毒(BDV)感染对新生大鼠脑内单胺类受体基因转录的影响。方法选择病毒滴度为2·0×106FFU/ml的BDV病毒液对新生大鼠进行颅内接种,接种量为10μl/只新生大鼠。30d后用RT-PCR和间接免疫荧光方法确定BDV感染情况;并采用半定量RT-PCR方法检测BDV感染大鼠脑组织中多巴胺2(D2)受体和5-羟色胺2α(5-HT2α)受体基因的mRNA转录情况。结果病毒接种后新生大鼠的BDV感染阳性率为88·89%。病毒感染大鼠脑组织中5-HT2α受体和D2受体基因的mRNA转录水平均明显低于对照组,差异有统计学意义。结论BDV感染可以明显抑制新生大鼠脑组织中D2受体和5-HT2α受体基因的mRNA转录,提示单胺类受体基因的转录与表达参与BDV感染的致病过程。     

不同试剂盒对乙脑病毒RNA提取效能的比较

目的比较常见的3种商售RNA提取试剂对乙脑病毒检测的相对效率、耗时和成本,为实验室应用及检测结果的评价提供依据。方法对乙脑病毒参考株悬液作10^-1～10^-4系列稀释,选用QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit、Sangon生物公司的RNA提取试剂盒和Invitrogen公司的Trizol试剂3种核酸提取方法提取上述样本RNA．用TaqMan实时荧光定量反转录聚合酶链反应对其提取效率进行评价,并比较3种试剂（盒）的耗费时间和价格。结果对不同稀释度乙脑病毒样本的检测,均以QIAGEN公司QIAamp Viral RNA Mini Kit检测的敏感度最高。以该试剂盒的提取效率为100％,则Invitrogen和Sangon生物公司RNA提取试剂（盒）的提取效率分别为77．4％～86．8％和64．2％～74．1％。3种试剂（盒）对cDNA起始模板量的估计也有明显的影响,差别达到1～3个数量级,以QIAGEN公司的试剂盒最敏感。3种试剂（盒）提取RNA耗时分别为60min、100min和70min,价格效率比分别为46元、23元和20元。结论RNA提取试剂可影响JEV荧光定量PCR检测的结果,各实验室应根据实验目的和实验室条件．合理选择病毒RNA提取试剂盒。     

扎伊尔型埃博拉病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究

目的 建立扎伊尔型埃博拉病毒的核酸检测方法,以期用于埃博拉出血热临床标本的检测.方法 针对扎伊尔型埃博拉病毒核蛋白和糖蛋白基因设计引物和探针,建立单重和双重实时荧光RT-PCR检测方法,利用体外转录病毒RNA和埃博拉病毒系列参考品RNA评价其敏感性,利用马尔堡病毒、健康人、登革热患者和发热伴血小板减少综合征患者血清评价其特异性.结果 所建立的实时荧光RT-PCR检测方法扩增效率在95％～105％,可特异性地检测扎伊尔型埃博拉病毒核蛋白和糖蛋白基因,与马尔堡病毒、登革热和发热伴血小板减少综合征病毒均无交叉反应,体外转录的病毒RNA可检出10～100拷贝/μl.双重检测方法通过细胞培养的扎伊尔型埃博拉病毒RNA验证,可检出100 pfu/ml病毒.结论 本研究建立的检测扎伊尔型埃博拉病毒的实时荧光RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可用于埃博拉出血热临床标本的检测.     

登革热病毒RNA实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法,测定登革热病毒（DV）及DV病毒的RNA拷贝数。方法利用TaqMan探针,建立实时荧光定量RT-PCR方法,通过对登革热病毒RNA定量外标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果该方法检测灵敏度可达1×103copies/mL,特异性及重复性良好,对同一样品进行5次重复检测,其循环阈值的平均标准偏差为0.792。结论TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定登革热病毒及DVRNA载量。     

博尔纳病病毒感染的免疫发病机制

博尔纳病病毒(BDV)是单股负链RNA病毒,在体内和体外都缺乏细胞致病性。BDV可引起中枢神经系统持续感染并导致博尔纳病(BD),即免疫介导的脑脊髓炎。浸润的免疫细胞以CD4~ T细胞、CD8~ T细胞、巨噬细胞和B细胞为特征。CD8~ T细胞代表对核蛋白呈抗原特异性的效应细胞群。     

Lack of antiviral effect of amantadine in Borna disease virus infection

The antiviral effect of amantadine (1-aminoadamantane) was tested in vitro as well as in vivo. Treatment of persistently Borna disease virus (BDV)-infected cell lines of different origin and for various length of time did not result in a general reduction of virus titer or clearance of virus from infected cells. In vivo, rats were treated with amantadine by daily oral application or by use of osmotic pumps, and in both cases treatment was started before infection. Neither route of application of the drug had any influence on the time of onset of disease, on antiviral antibody titers, on virus titer in the brain, on the severity of the inflammatory reaction in the brain, or on the severity of neurological symptoms. These experiments, although revealing negative results and obtained using a virus from a natural case of Borna disease grown after isolation in vitro for a long period of time, should caution from the general use of amantadine as a curative agent against BDV infection as has been implicated recently [Bode et al. (1997) Lancet 349:178–179]. Received: 26 November 1997     

Increase of virus yields and releases of Borna disease virus from persistently infected cells

Borna disease virus grows to low titres in persistently infected cells with an infectious particle to cell ratio of 0.01 to 0.05. Inclusion of n-butyrate in the growth medium enhances infectivity yields up to 1 log. This effect is time and concentration dependent. In hypertonic medium with an excess of NaCl, KCl or Na2SO4 up to 50% of the total infectious virus yield is released from the cells. Released supernatant virus (buoyant density in sucrose rho = 1.22 g/cm3) is more heat stabile than cell-bound virus (rho = 1.18 g/cm3). The access to cell-free (released) virus opens new possibilities for the characterization of this neurotropic agent.     

Borna disease virus infection in racing horses with behavioral and movement disorders

Summary.  Borna disease virus (BDV) is a neurotropic agent with capacity to infect and cause neurological disease in a broad range of warmblooded hosts including horses, sheep, cattle, cats, and possibly also humans. The epidemiology of BDV is largely unknown. However, it is likely that subclinically infected animals may represent potential virus reservoirs. In two groups of Swedish racing horses, one clinically healthy and one consisting of horses with diffuse neurological signs, the BDV seroprevalence was 24.5% and 57.7%, respectively. BDV RNA was detected in peripheral blood mononuclear cells in 8 out of 28 (28.6%) investigated horses, the majority of the BDV RNA-positive horses belonging to the group with neurological signs. There was a close relationship between the Swedish equine BDV isolates and previously reported equine BDVs in Europe. Our results point to an association of BDV infection with atypical disease patterns in horses such as diffuse mental and gait disturbances. These findings may be of importance for the understanding of the epidemiology of BDV infections in animals and man. Accepted September 4, 1998 Received May 27, 1998     

博尔纳病毒核蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的 构建、表达、并纯化重组博尔纳病毒核蛋白(Borna disease vires,BDV),并鉴定该蛋白.方法 通过PCR反应从博尔纳病毒cDNA中扩增博尔纳病毒核蛋白P40基因,构建博尔纳病毒核蛋白P40基因重组质粒pET-14b-BD-VP40,转化大肠杆菌,IPTG诱导融合蛋白的表达,His-tag亲和层析纯化该蛋白,SDS-PAGE分析其表达量、表达形式和纯度;Western-blot法鉴定该蛋白.结果 成功构建蓖组质粒pET-14b-BDVP40,酶切鉴定、核酸序列分析正确,亲和层析纯化后纯度可达90%,Western-blot表明重组蛋白能与博尔纳病毒核蛋白单克隆抗体特异性结合.结论 在大肠杆菌中成功表达了可溶性的pET-14b-BDVP40融合蛋白,为进一步研究博尔纳病毒核蛋白作用机制及开发相应血清学检测试剂盒提供基础.