丙型肝炎病毒细胞和动物模型研究

丙型病毒性肝炎是一种严重危害人类健康的常见病和多发病。全球约有1．7亿人感染丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus,HCV）。我国HCV感染者已达6000万。长期以来,丙型肝炎的研究一直面临一大难题：即缺少稳定可靠的HCV感染细胞模型和动物模型,阻碍了对HCV致病机制、抗病毒药物筛选和疫苗研究等的研究进程。因此探索具有实际应用价值的HCV感染模型或HCV基因表达模型,是当今丙型肝炎防治研究的重大课题,近10年来众多研究者对此方面进行研究,本文即对此做一综述。     

丙型肝炎病毒逃避宿主固有免疫的分子机制

丙型肝炎病毒(HCV)可引起慢性肝炎、肝硬化和肝癌.80%的新发感染发展为慢性感染,干扰素/利巴韦林联合治疗疗效不尽如人意,这些现象提示HCV已建立了一系列抵抗机制对抗宿主的免疫反应和干扰素的抗病毒活性.近年来研究发现,病毒可通过干扰模式识剐受体TIJR3、RIG-I介导的信号通路和干扰素信号通路以及干扰素刺激基因等多个水平的逃避机制,抵抗宿主的抗病毒反应.本文对HCV封闭模式识别受体介导的信号通路,干扰宿主固有免疫以建立持续感染的分子机制进行了综述.     

丙型肝炎病毒对干扰素治疗的影响及预测

以干扰素为基础的治疗是目前丙型肝炎病毒感染者唯一有效的治疗手段,但干扰素疗效受病毒因素、宿主免疫状态和干扰素剂型等影响,且干扰素价格昂贵,疗程长,又有一定的不良反应。因此,对丙型肝炎患者治疗前或早期治疗过程中进行干扰素疗效的预测,将有助于对临床病例进行合理的干扰素治疗。本文综述了丙型肝炎病毒的基因型、治疗前血清中病毒载量水平、病毒变异率,以及治疗过程中病毒动力学变化等病毒自身因素和干扰素疗效预测的关系。     

丙型肝炎病毒的分子遗传学研究现状

丙型肝炎病毒(HCV)基因组是线性、正链RNA分子,其全长核苷酸(nt)序列约为10kb,由5′端(332nt)非编码区、3′端(54nt)非编码区和一长的开读框架(ORF:1～9033nt或9075nt、9097nt)3部分构成;根据编码区基因序列可推定出HCV多聚蛋白前体(3011aa)的组成。用计算机对基因组的核苷酸序列进行分析,结果表明HCV基因组具有较高的突变频率,因而基因序列呈现出较大的变异,其中以E_1区和E_2/NS_1区的变异性最高;相对而言,C区、NS_3～NS_5区和5′-NCR的核苷酸序列则有明显的保守性;同时将HCV和已知的其它病毒的基因组及多聚蛋白进行比较,结果显示在分类上HCV与黄病毒和瘟病毒有关。     

丙型肝炎病毒致病的分子生物学机制

丙型肝炎病毒（HCV）属于黄病毒属，基因组与单股正链RNA，其致病机制与DNA病毒和逆转录病毒截然不同。由于诱导中和抗体的抗原表位恰好位于其包膜抗原E2蛋白的高变区1（HVRA1），因而容易逃避机体的免疫监视，形成慢性感染，同时造成发展广谱预防性疫苗的困难。噬菌体表面展示技术和模拟表位的理论和技术，是构建新型蛋白或基因疫苗，克服这一困难的可能途径。HCV基因复制和翻译有关的调节基因序列与肝细胞来源的蛋白质之间相互作用的研究，将有助于阐明HCV调节机制和相对嗜肝特性的分子生物学基础；HCV特异性受体的研究，将有助于阐明HCV感染并进入肝细胞的各个细节；酵母双杂交技术对于HCV结构和非结构蛋白结合的肝细胞蛋白的筛选，以抑制性消减杂交（SSH）技术对HCV蛋白调节的肝细胞靶基因的筛选，将有助于阐明HCV与肝细胞大分子之间相互作用的分子机制。所有这些，将为最终揭密HCV感染引起慢性病毒性肝炎、肝纤维化、肝细胞癌、肝脏脂肪变、B细胞淋巴瘤、冷球蛋白血症等的分子生物学机制，并为反义技术、人源化单链可变区抗体与目的基因的细胞内免疫基因治疗和治疗性基因疫苗等抗HCV治疗新型方法的研究奠定了坚实的基础。     

丙型肝炎病毒逆转录—套式PCR检测方法和临床应用

在HCVRNA高度保守的5’末端非编码区域内选择合成内、外引物，建立了HCV的逆转录－套式PCR检测方法，并对血清标本中HCVRNA的提取方法进行比较。对23例肝病患者的检测结果显示，HCVRNA的阳性率为56．5％。与抗HCV抗体检测结果比较，抗HCV阳性患者中有81．5％HCVRNA阳性，而抗HCV阴性患者中仍有33．3％的HCVRNA阳性，表明PCR在HCV感染的早期诊断、传染性的确立及药物疗效考核等方面有重要作用。     

重组丙型肝炎病毒表位抗原的研究

目的：研究丙型肝炎病毒（HCV）表位抗原,以满足丙肝抗体确认试剂研究的需要,方法;构建原核融合表达载体pBVIL1,精选HCV不同区抗原,C区,NS3,NS4和NS5的主要抗原表位,用PCR方法从不同HCV抗原表达质粒中扩增出相应抗原表位,构建pBVIL1表达质粒,并在HB101受体菌中表达,纯的单片段抗原经包被测定板和用间接ELISA法对阴性及阳性血清测定其活性,结果与结论：所克隆的单片段抗原均在表达载体pBVIL1中获得高效表达,单片段抗原纯品用卫生部的Ｐanel测定,所得结果和进口Ｏrtho公司ＲＩＢＡ３．０结果进行比较,其中Ｃ和ＮＳ４抗原活性略高于ＲＩＢＡ３．０中的相应抗原,ＮＳ３抗原活性则略低于ＲＩＢＡ３．０中的c33cr抗原,但对４０份阳性血清的总评价和ＲＩＢＡ３．０完全一致,表明目前抗原已可满足要求。     

增强子Ⅰ对乙型肝炎病毒DNA疫苗免疫应答的影响

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)自身增强子Ⅰ(enhancerⅠ,ENHⅠ)对HBVDNA疫苗免疫应答的影响。方法采用PCR法以HBVadr亚型全基因DNA序列为模板分别扩增表面抗原(HBsAg)和HBsAg-ENHⅠ基因片段,重组到载体VR1012中,构建两种HBVDNA疫苗,转染COS-7细胞及HepG2细胞并免疫BALB/c小鼠。采用蛋白印迹、ELISA、ELISPOT等方法检测其在COS-7和HepG2细胞内的表达及小鼠的体液及细胞免疫应答效果。结果转染的HepG2和COS-7细胞均表达HBsAg;连接ENHⅠ的HBVDNA疫苗转染HepG2细胞后HBsAg表达量明显升高,两种疫苗转染COS-7细胞表达HBsAg无明显差异;免疫小鼠后第2周产生HBsAb及HBsAg特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL),两种疫苗免疫产生的HBsAb及HBsAg特异性CTL无明显差异。结论ENHⅠ可使HBVDNA疫苗转染HepG2细胞表达HBsAg明显增加,对转染COS-7细胞表达HBsAg及接种BALB/c小鼠引起的免疫应答无明显影响。     

增强子Ⅰ对乙型肝炎病毒DNA疫苗免疫应答的影响

目的 研究乙型肝炎病毒（HBV）自身增强子I（enhancerI，ENHI）对HBV DNA疫苗免疫应答的影响。方法 采用PCR法以HBVadr亚型全基因DNA序列为模板分别扩增表面抗原（HBsAg）和HBsA-ENHI基因片段，重组到载体VR1012中，构建两种HBV DNA疫苗，转染CADS-7细胞及HepG2细胞并免疫BALB／c小鼠。采用蛋白印迹、ELISA、ELISPOT等方法检测其在COS-7和HepG2细胞内的表达及小鼠的体液及细胞免疫应答效果。结果 转染的HepG2和COS-7细胞均表达HBsAg;连接ENHI的HBV DNA疫苗转染HepG2细胞后HBsAg表达量明显升高，两种疫苗转染COS-7细胞表达HBsAg无明显差异；免疫小鼠后第2周产生HBsAb及HBsAg特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL），两种疫苗免疫产生的HBsAb及HBsAg特异性CTL无明显差异。结论ENHI可使HBV DNA疫苗转染HepG2细胞表达HBsAg明显增加，对转染COS-7细胞表达HBsAg及接种BALB／C小鼠引起的免疫应答无明显影响。     

不同剂量司库奇尤单抗治疗中重度银屑病疗效分析

目的 分析探讨不同剂量司库奇尤单抗治疗中重度银屑病的临床疗效。方法 选取2020年1月至2021年5月南阳市中心医院收治的104例中重度银屑病患者作为研究对象,按照不同用药剂量将其分为高剂量组(52例)和低剂量组(52例)。高剂量组患者皮下注射司库奇尤单抗注射液300 mg/次,低剂量组患者皮下注射司库奇尤单抗注射液150 mg/次,对比观察两组患者银屑病面积和严重程度指数(PASI)评分、临床症状评分、血清炎症因子及免疫相关指标水平与不良反应发生情况。结果 治疗结束后,高剂量组患者PASI评分明显低于低剂量组(t=8.228,P<0.001),寻常型银屑病主症量表各维度评分均明显低于低剂量组(t=2.525、2.447、3.759,P=0.013、0.016、0.001),血清白细胞介素(IL)-10及CD₄⁺水平均明显高于低剂量组(t=4.059、3.735,P均<0.001),血清IL-17及辅助性T细胞17 (Thh17)水平均明显低于低剂量组(t=4.245、6.295,P均<0.001)。治疗期间,高剂量组患者不...     

热休克蛋白65增强小鼠对HBV DNA 疫苗免疫反应的研究

目的:观察热休克蛋白65的真核表达载体(pHSP65)对HBV DNA疫苗诱导BALB/c小鼠(H-2d)免疫应答的调节作用。方法:肌内注射空载体pcDNA3,HBV DNA疫苗加HSP65佐剂(pHBVS2S pHSP65)或不加佐剂(pHBVS2S);ELISA法测定血清抗HBs抗体;ELISPOT检测分泌IFN-γ的脾淋巴细胞;4 h51Cr释放法检测小鼠脾细胞CTLs活性。结果:HBV DNA佐剂组免疫小鼠抗HBsAg抗体滴度虽高于不加佐剂组,但无显著性差异;其IgG1/IgG2 a的比例不同于多肽免疫组,二者分别为0.395与10。佐剂组小鼠分泌IFN-γ的脾淋巴细胞量是不加佐剂组的2~3倍。CTLs细胞杀伤活性(E∶T=100)佐剂组与不加佐剂组分别为:(53.68±7.5)%、(42.81±7.7)%,差异显著(P<0.05)。结论:HBV DNA疫苗具有较强的免疫原性,能够诱导机体产生特异性的抗体及CTLs反应;HSP65佐剂能够有效提高小鼠对DNA疫苗的细胞免疫应答,有望成为DNA疫苗的免疫佐剂。     

热应激对血管内皮细胞DNA损伤效应的研究

目的：观察血管内皮细胞株ECV304在不同热应激条件下DNA受损情况。方法：实验采用单细胞凝胶电泳法(SCGE)检测在不同热应激条件(41℃2h、43℃2h、45℃2h)对ECV304细胞DNA的单链损伤情况。结果：在不同的热应激条件下，固定热应激时间，随着热应激温度的逐步增加，采用SCGE法所观察到的受损细胞数显著增多，P＜0．05，相应的慧尾长度显著增加，P＜0．05。结论：热应激对内皮细胞的DNA致伤肯定，可使ECV304细胞DNA发生不同程度的单链断裂。     

裸DNA肌肉注射不同注射方法对标记基因转染效率的影响

在肌肉损伤基因治疗应用研究中 ,裸DNA直接注射法具有安全可靠 (不会引起炎症反应和导致插入突变 )、制作工艺简单、操作简便 (与传统的注射方法非常相近 )、可重复注射等优点。以往研究表明 ,肌肉DNA注射基因转移的注射技术是显著影响表达水平的一个重要参数。因此 ,本研究比较了直接注射、注射后保持和缩进式注射三种不同注射方法对基因转移效率的影响 ,进行了不同注射方法的机理探讨。实验结果显示 ,缩进式注射方法转染效率最高 ,直接注射和注射后保持两种方法间无显著性差异。结果提示 ,质粒不是通过细胞膜的破损进入细胞 ,可能是“受体介导”或“T管和内陷”作用的结果。这一结果支持“T管和细胞内陷说”和“受体介导说”。     

64排螺旋CT不同剂量对比剂到达腹主动脉峰值时间的初步研究

目的探讨64排螺旋CT碘对比剂小剂量测试团注与增强剂量团注时,腹主动脉强化峰值到达时间的差异。方法60例心功能正常患者随机分成A、B、C组,每组20例,注射流率分别为4.5 ml/s、3.5 ml/s、4.5 ml/s,每组小剂量团注测试与增强剂量注射流率相同,A组与B组加20 ml生理盐水冲管,C组注射完对比剂后不用生理盐水冲管。另一组20例不同程度心功能不全患者作为D组,扫描方法及参数同A组。碘对比剂浓度为370 mgI/ml及采用电影模式增强扫描。测量每组小剂量团注测试及增强剂量团注扫描时肝门水平腹主动脉时间-密度曲线,比较两者到达最大强化峰值时间的差异。结果小剂量团注测试峰值到达时间变化范围,A、B、C组为19~24 s,平均分别为(20±2)s、(19±3)s、(22±3)s;D组为24~42 s,平均(28±14)s。增强剂量峰值到达时间A、B、C组变化范围为20~26 s,分别平均为(22±3)s、(21±2)s、(24±2)s;D组峰值到达时间变化范围为26~44 s,平均(32±14)s。A、B、C组小剂量测试团注与增强剂量团注时,对比剂到达肝门水平腹主动脉强化峰值时间相差约2~7 s,D组3~12 s。结论64排螺旋CT进行碘对比剂测试小剂量团注与增强剂量团注到达肝门水平腹主动脉峰值时间,不同剂量和不同注射流率之间存在差异。     

DNA within cars: prevalence of DNA from driver,passenger and others on steering wheels

ABSTRACT

Cars are frequently involved in criminal activities and sampled for DNA to assist investigations. To improve our awareness of DNA transfer, persistence, prevalence and recovery (DNA-TPPR) within cars we studied DNA profiles from samples collected from several sites in the front compartment of cars with known histories and occupancies. Here findings relating to steering wheels are reported. Each of the four quarters of the rim as well as the centre column, of four cars, provided good quantities of DNA for profiling. The driver was observed as the sole, major or co-major in 19/20 profiles, and as a minor in the remaining profile generated from these samples. Known close associates, including co-resident partners and passengers/friends, as well as other unknown individuals, who had not driven the car, are also detected on many of the sampled steering wheel sites. More studies are required to improve our awareness of DNA-TPPR and to generate data to help determine probabilities for different profile types and levels of specific contributions given specific circumstances relating to steering wheels, as well as several other relevant areas within cars, to assist sample targeting and activity level assessments.     

Investigations into improving the standard DNA testing of trace samples at ESR

ABSTRACT

Since 2007, the Institute of Environmental and Science Research (ESR) has been using the AmpF/STR Identifiler profiling kit as the standard DNA test. Whilst this approach works well for most samples with a DNA input range of 400 pg to 2 ng, samples containing less DNA often have limited to no profiling success. If required, such samples can undergo testing using a more sensitive technique, such as mini-STR analysis or Low Copy Number (LCN) DNA analysis. The introduction of a more sensitive standard DNA test into the laboratory would likely prove to be greatly beneficial. Profiling success should increase, particularly for samples containing trace DNA concentrations, and the number of samples requiring rework and further analysis using an ultra-sensitive technique would potentially reduce. A number of new generation multiplex kits with increased sensitivity are now commercially available. One such kit is the AmpF/STR Identifiler Plus profiling kit, which has enhanced buffer formulation and an optimized PCR cycling protocol. This study investigates the profiling results from trace DNA samples using Identifiler at 28 cycles and Identifiler Plus, at 28 and 29 cycles, analysed using the 3500xL Applied BioSystems Genetic Analyzer. Any further benefits from including a post-PCR clean-up step and enhanced capillary electrophoresis conditions are investigated and discussed.     

Methods enhancement for improved recovery of human DNA from forensic blood samples on different fabrics using the DNA IQ System

DNA typing of biological samples can be a challenging task due to the presence of small amounts of DNA and/or a high content of PCR inhibitors. Our aim is to develop a protocol to recover DNA suitable for DNA typing from blood-stained fabrics based on the DNA IQ System. Blood stains on different fabrics were buried in different types of soil and left for 1–7 days. The samples were then recovered and DNA was extracted with a modified DNA IQ System protocol, involving a modification in the preparation of the Wash Buffer. The samples extracted with the modified protocol showed a higher amount of recovered DNA compared with the recommended protocol. The removal of isopropanol from the Wash Buffer composition contributes to a higher amount of recovered DNA.     

Heavy Ion Effects on Cellular DNA: Strand Break Induction and Repair in Cultured Diploid Lens Epithelial Cells

Summary

The relative biological effectiveness (RBE) for the induction of DNA strand breaks and the efficiency of repair of these breaks in cultured diploid bovine lens epithelial cells was measured, using accelerated heavy ions in the linear energy transfer (LET)-range up to 16 200 keV/µm. At LET values above 800 keV/µm, the number of DNA strand breaks induced per particle increases both with the atomic number of the projectile and with its kinetic energy. About 90 per cent or more of the strand breaks induced by ions with an LET of less than 10 000 keV/µm are repaired within 24 h. Repair kinetics show a dependence on the particle fluence (irradiation dose). At higher particle fluences a higher proportion of non-rejoined breaks is found, even after prolonged periods of incubation. At any LET value, repair is much slower after heavy-ion exposure than after X-irradiation. This is especially true for low energetic particles with a very high local density of energy deposition within the particle track. At the highest LET value (16 200 keV/µm), no significant repair is observed.     

60Coγ照射和环磷酰胺对小鼠造血及免疫功能影响的研究

目的 比较⁶⁰Co γ射线照射及环磷酰胺对小鼠造血和免疫功能损伤的规律,为急性放射综合征(ARS)患者临床救治提供实验依据.方法 48只雌性BABL/c小鼠随机数字表法分为照射组、化疗组,每个剂量组6只.照射组接受⁶⁰Co γ射线照射,吸收剂量为2、4、6和8 Gy;化疗组注射环磷酰胺,剂量为100、150、200和250 mg/kg.处理后采尾静脉血,进行血常规检测.选择白细胞(WBC)差异无统计学意义的2 Gy和200 mg/kg组,处理后流式细胞术检测T、B、NK及调节T细胞.结果 各组外周血WBC计数均先下降,4 d后降至最低值.化疗组和2 Gy照射组WBC迅速回升,10~12 d基本恢复;而4 Gy照射组恢复较慢,6和8 Gy组不能自行恢复.2 Gy照射组与200 mg/kg化疗组差异无统计学意义,其余照射组与200 mg/kg化疗组的差异有统计学意义(t=2.531, 2.343, 2.074, P<0.05).2 Gy照射组CD8+T细胞数较200 mg/kg化疗组明显下降(F=5.026,P<0.05),2 Gy照射组调节T细胞在照射后升高,与200 mg/kg化疗组比较差异有统计学意义(F=4.848,P<0.05),但CD4+T、B和NK细胞数两组之间差异无统计学意义.结论 电离辐射较化疗对造血、免疫功能的损伤较大,恢复较慢.因此,在ARS患者中可针对性延长造血刺激因子和集落刺激因子的使用,以起到预防感染、出血及败血症、帮助造血及免疫系统重建的作用.